Staphylococcus aureus é uma bactéria gram-positiva que produz uma ampla gama de fatores de virulência que promovem a patogênese. Estes incluem leucotoxinas bi-componentes que interrompem a integridade da membrana de leucócitos polimorfonucleares, também chamados PMNs ou neutrófilos. Este vídeo ilustra o isolamento de PMNs de sangue humano inteiro e dois ensaios distintos para quantificar a citototoxicidade S.aureus contra essas importantes células imunes inatas.
Esses ensaios podem ser todos realizados com equipamentos de laboratório padrão e são facilmente adaptáveis para examinar outros aspectos da interação do patógeno hospedeiro. Esses experimentos utilizarão sangue inteiro extraído de doadores humanos e exigirão a aprovação do comitê institucional ou do conselho de revisão apropriado, bem como uma declaração de que o consentimento informado foi obtido de todos os participantes. O primeiro passo deste procedimento é o isolamento dos neutrófilos através do uso de centrifugação e gradientes de densidade.
Primeiro, traga 50 mililitros de 3%dextran 0,9% cloreto de sódio, 35 mililitros de cloreto de sódio de 0,9%, 20 mililitros de cloreto de sódio de 1,8%, 12 mililitros de 1,077 gramas por solução de ficoll mililitro e 20 mililitros de água à temperatura ambiente. Transfira 25 mililitros de sangue humano heparinizado recém-desenhado em dois tubos cônicos de centrífuga. Combine 25 mililitros de sangue inteiro heparinizado recém-desenhado com 25 mililitros de volume equivalente de temperatura ambiente, 3% dextran, cloreto de sódio de 0,9% em uma proporção de um para um.
Misture balançando suavemente cada tubo cônico de 50 mililitros e deixe ficar em temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação à temperatura ambiente, duas camadas separadas aparecerão. Transfira a camada superior de cada mistura sanguínea dextran em novos tubos cônicos de 50 mililitros.
Centrifugar a 450 g por 10 minutos em temperatura ambiente com baixa ou nenhuma pausa. Aspire cuidadosamente os dois supernacantes e descarte sem perturbar as pelotas celulares. Resuspenque suavemente cada pelota de célula em dois mililitros de cloreto de sódio de 0,9%.
Misture as pelotas resuspended em um único cônico de 50 mililitros e adicione o cloreto de sódio restante de 0,9% a um volume final de 35 mililitros. Suba cuidadosamente 10 mililitros de 1,077 gramas por solução de ficoll mililitro sob a suspensão celular usando uma pipeta manual. Depois de girar a 450 g por 30 minutos em temperatura ambiente, com baixas ou sem quebras, aspire suavemente o supernaente sem perturbar a pelota celular, como mostrado anteriormente.
Lise os glóbulos vermelhos reutilizando a pelota de células em 20 mililitros de água de temperatura ambiente. Misture suavemente balançando por 30 segundos. Adicione imediatamente 20 mililitros de cloreto de sódio de 1,8% e amostra de centrífuga a 450 g por 10 minutos à temperatura ambiente.
Aspirar cuidadosamente supernascida como mostrado antes. Levemente resuspenque a pelota celular em dois mililitros de temperatura ambiente RPMI e coloque no gelo. Conte células usando um hemacytómetro.
Resuspend PMNs purificados em uma concentração de uma vez 10 a 7 células por mililitro com RPMI gelado e manter no gelo. Combine 100 microliters de PMNs purificados com 300 microliters de DPBS, contendo um microliter de mancha de iodeto de propídio em dois tubos de citometria de fluxo de réplica. Para um controle positivo, adicione 40 microliters de solução Triton X-100 de 0,5% em um dos tubos de citometria de fluxo e misture bem.
Use a citometria de fluxo para medir a dispersão dianteira, dispersão lateral e coloração de iodeto de propídio para determinar a pureza e integridade dos PMNs isolados. Apenas preparações de PMN acima de 98% puras e acima de 95% de iodeto de propídio negativo devem ser utilizadas. Para o protocolo que delineia o isolamento do soro humano normal, consulte o manuscrito completo.
Prepare uma placa de 96 poços para ensaios de citotoxicidade PMN adicionando 100 microliters de soro humano 20% isolado diluído com DPBS a poços individuais que serão usados neste ensaio. Certifique-se de incluir pelo menos um controle negativo bem que só receberá mídia e pelo menos um bem de controle positivo que receberá 0,05% Triton X.Incubar a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, lave os poços codificados duas vezes com 100 microliters de DPBS gelados e coloque placa no gelo.
Remova qualquer DPBS residual dos poços de placa e adicione suavemente 100 microliters de PMNs humanos purificados em uma vez 10 a 7ª células por mililitro a cada poço codificado. Permita que os neutrófilos banhados se acomodem deixando-os no gelo por pelo menos cinco minutos antes de serem usados nos seguintes ensaios de citotoxicidade. Esta seção descreve um ensaio que quantifica a citotoxicidade de proteínas extracelulares produzidas por estafilococos contra PMNs humanos.
Cultura S.aureus durante a noite em mídia apropriada usando uma incubadora de agitação fixada a 37 graus Celsius no dia anterior ao experimento. Subcultura S.aureus realizando uma diluição de 1 a 100 culturas de bactérias durante a noite com mídia fresca. Incubar a 37 graus Celsius com agitação até que as bactérias atinjam a fase de crescimento estacionário precoce.
Após cinco horas de crescimento, transfira um mililitro de subcultura S.aureus em um tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro e centrífuga a 5.000 g por cinco minutos à temperatura ambiente. Após centrifugação, supernantes aspirados. Passe supernantes aspirados através de um filtro de seringa de 0,22 mícrons em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e coloque no gelo.
Realizar diluições seriais de supernacantes com mídia gelada usada para cultivar Staph aureus. Adicione suavemente amostras de supernacante ou mídia emprestadas para controles negativos e positivos a poços individuais de uma placa de 96 poços contendo PMNs no gelo, como descrito anteriormente. Placa suavemente rochosa para distribuir supernacantes em poços e incubar a 37 graus Celsius.
Nos momentos desejados, remova a placa da incubadora e coloque no gelo. Adicione 300 microliters de DPBS gelado contendo um microlitro de iodeto de propídio a cada tubo de citometria de fluxo. Transfira as amostras para fluir tubos de citometria no gelo.
Para o bem de controle positivo, adicione 20 microlitadores de 10% Triton X à amostra antes de transferir para um tubo de citometria de fluxo. Analise a coloração de iodeto de propidium de PMNs intoxicadas usando citometria de fluxo. Esta seção descreve um ensaio que quantifica a citotoxicidade de S.aureus após a fagocitose por PMNs humanos.
Curvas de crescimento definidas pela densidade óptica em 600 nanômetros e a concentração de bactérias devem ser determinadas para as cepas de aureus estafilococos relevantes antes de serem utilizados neste ensaio. Iniciar culturas noturnas de cepas s.aureus e bactérias de subcultura, como descrito anteriormente. Uma vez subculturado Staph aureus atingiu o crescimento médio-exponencial, transfira um mililitro de bactérias culturais para tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrífuga a 5.000 g por cinco minutos à temperatura ambiente.
Lave S.aureus aspirando seu supernascido sem perturbar a pelota e resuspende as bactérias pelleted em um mililitro DPBS. Vórtice as amostras por 30 segundos. Centrifugar as amostras a 5.000 g durante cinco minutos em temperatura ambiente.
Para oxidar Staph aureus, primeiro resuspense a pelota bacteriana em um mililitro de soro 20%. Em seguida, incubar amostras a 37 graus Celsius com agitação por 15 minutos. Lave otáxi boiado staph aureus após centrifugação como mostrado anteriormente.
O estaureus boienado diluído se esforça uma vez 10 para as 8 unidades formadoras de colônias, CFUs por mililitro, com RPMI gelado. Vórtice a amostra por 30 segundos e coloque no gelo. Confirme as concentrações de Staph aureus utilizadas para estes ensaios, emplacando de 1 a 10 diluições seriais de bactérias no ágar.
Adicione suavemente 100 microliters por poço de cada cepa de aureus estafilococos, ou RPMI para controles positivos e negativos, para PMNs em uma placa de 96 poços no gelo a partir do passo 1,14. Placa de rocha suave para distribuir Staph aureus em poços. Sincronizar a fagocitose por centrifugação de placa a 500 g por oito minutos a quatro graus Celsius e incubar placa a 37 graus Celsius imediatamente após centrifugação como tempo zero.
Nos pontos de tempo desejados, coloque a placa no gelo e adicione 200 microliters de DPBS gelado contendo um iodeto de propídio microliter a cada tubo de citometria de fluxo e, em seguida, transfira amostras para o tubo correspondente. Analise amostras para coloração de iodeto de propídio utilizando citometria de fluxo conforme descrito em 2,8 e 2,9. A transcrição de leucotoxinas bi-componentes que visam pmns humanos por Staph aureus requer que o sistema de componentes SA ou S2 demonstre a utilidade dos ensaios descritos para quantificar a citototoxicidade staph aureus contra PMNs humanos.
Esses experimentos foram realizados com um isolado estafáureo clinicamente relevante identificado como USA300 em um mutante de exclusão isologênica de SA ou S nesta cepa. O painel esquerdo retrata pmns purificados e o painel direito descreve amostras intencionalmente contaminadas como exemplo. Os PMNs isolados utilizando os procedimentos descritos na seção um deste protocolo foram manchados com iodeto de propídio e examinados por citometria de fluxo.
Parcelas de dispersão dianteira e lateral foram utilizadas para detectar contaminação de PMNs purificados por monócitos ou linfócitos durante os anos 1A e 1B. A integridade do PMN foi determinada por meio da coloração de iodeto de propídio. Usando o método descrito de purificação do PMN humano, podemos isolar consistentemente cinco vezes 10 a 10 vezes 10 para os 8 PMNs que são mais de 98% puros e são mais de 95% de iodeto propidium negativo.
A citotoxicidade das proteínas extracelulares produzidas pelo USA300 e pelo mutante AsaeR/S foi testada contra PMNs purificados. Esses experimentos demonstram um aumento dependente da concentração na coloração de iodeto propidium de PMNs purificadas após 30 minutos de intoxicação com proteínas extracelulares produzidas pelo USA300, mas não com o mutante AsaeR/S. Outros experimentos demonstraram um aumento constante na proporção de PMNs positivos de iodeto propidium após a intoxicação por proteínas extracelulares USA300 que subiram após aproximadamente 30 minutos.
A coloração mínima de iodeto de propidium de PMNs humanas foi observada em todos os pontos de tempo após a exposição a proteínas extracelulares produzidas pelo mutante AsaeR/S. Por último, foi testada a citotoxicidade do mutante USA300 e AsaeR/S contra PMNs após o teste da fagocitose sincronizada, observando-se um aumento dependente da concentração na proporção de PMNs positivos de iodeto de propidium 90 minutos após a faagocytose de USA300. Significativamente menos PMNs foram propidium iodida positivo após a fagocitose do mutante AsaeR/S.
A enumeração do inóculo mutante USA300 e AsaeR/S foi usada em cada um desses experimentos demonstrando que o contraste na citotoxicidade entre essas cepas não se deveu a diferenças na concentração de bactérias utilizadas. Este protocolo descreve as purificações de PMNs do sangue humano em duas técnicas distintas para quantificar a citotoxicidade do S.aureus contra essas células imunes inatas. O sucesso desses procedimentos dependerá da qualidade dos PMNs purificados e da preparação adequada de bactérias staph aureus ou supernantes.
Consulte o manuscrito completo para que pontos importantes considerem durante a realização desses procedimentos. USA300 é um isolado virulento MRSA e a perda de AsaeR/S reduz drasticamente a transcrição de fatores de virulência que visam pmns humanos, tornando essas cepas modelos ideais para comparar a citotoxicidade usando os ensaios descritos. A adaptação das condições de crescimento, volumes de supernantes adicionados ou razão de bactérias para PMNs pode ser necessária ao usar outras cepas de Staph aureus.
