NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

1. Animais <ol><li> Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use na Universidade de Medicina e Odontologia de New Jersey. </li><li> Casa grupo masculino camundongos C57BL / 6 em uma programação escuro light/12 hr 12 hr e permitir o acesso ad libitum à água e comida. Sacrifício em 4-5 meses de idade. A eutanásia dos ratos foi realizada por meio do plano cirúrgico de anestesia e uma forma secundária de eutanásia (ou seja penetrando incisão na cavidade torácica, através da membrana). Isto é consistente com as Diretrizes AVMA sobre eutanásia. </li></ol> 2. Preparação da solução de perfusão, Lamelas, pipetas de vidro, e Mídia <ol><li> Adicione uma solução de perfusão que consiste em 1L de KCl 2,5 mM, 7 mM de MgCl2, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 28 mM NaHCO3, 0,5 mM de CaCl2, 7 mM de glucose, 1 mM de ácido ascórbico, e 3 mM de piruvato em destilada dH2O Ajustar a osmolaridade para ~ 300 mOsm usando cerca de 80 g / L de sacarose. Oxigenar por borbulhamento com 95% de O2 / 5% de CO 2 e ajustar o pH para 7,4. Cada experiência requer aproximadamente 200 ml de solução de perfusão. As aliquotas podem ser guardadas a -20 ° C durante até 2 meses. </li><li> Adicione 250 ml de caldo contendo meio Neurobasal Neurobasal sem glicose, glicose 2,5 mM, e 100 U / ml de penicilina estreptomicina. Ajuste a osmolaridade do estoque Neurobasal a 280 mOsm usando sacarose. Fazer 500 ml Hibernate estoque contendo Hibernate-A mídia sem glicose, glicose 2,5 mM, e 100 U / ml de penicilina estreptomicina. </li><li> Mexa bem e ambas as ações filtro de esterilizar utilizando Stericup unidades de filtro de vácuo. Tenha cuidado para não introduzir a glicose ou outros contaminantes através das barras de vidro ou agitar. Envolva as garrafas em papel alumínio para proteger a mídia da luz e armazenar a 4 ° C por até 2 meses. </li><li> Inflamar as pontas dos 4 pipetas de vidro autoclavados (9) na forma que as pontas não são lodiâmetros nger afiadas e a abertura é grande (~ 0,9 milímetros), médio grande (~ 0,7 mm) em, meio (~ 0,5 mM), e pequeno (~ 0,3 mm),. O maior deve ser mal polido eo menor deve ser de cerca de um terço do que o diâmetro. </li><li> No dia antes de neurônios de colheita, limpo quatro 25 milímetros lamínulas utilizando etanol 70% e que passam sobre um queimador de chama de Bunsen. Coloque cada lamela em um estéril 35 milímetros prato de cultura e adicionar 2 ml estéril 1% de poli-D-lisina em dH 2 O. Colocar os pratos em uma incubadora (37 ° C) durante a noite. No dia seguinte, lava-se com dH 2 O estéril 3x e permitir lamelas para secar completamente. </li><li> Faça 75 mL alíquotas de 1 M de ácido láctico e 200 mL alíquotas de GlutaMAX; armazenar a -20 ° C. Totalmente descongelar alíquotas de ácido láctico e GlutaMAX antes da utilização para assegurar a homogeneidade. </li><li> No dia da colheita de neurônios, fazer 30 ml de meio de cultura fresco que consistem em Hibernate-A estoque contendo ácido láctico 1 mM, 0,5 mM GlutaMAX, e 2% B27 sem insulina. VoRTEx e ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1 N. </li><li> Coloque 10 ml de meio de cultura em uma placa de Petri 60 milímetros de vidro no gelo, colocar 2 ml em um tubo de 15 ml no gelo e manter a mídia restante à temperatura ambiente. </li><li> No dia da colheita de neurónios, fazer 25 ml de meio de crescimento fresco consistindo de estoque Neurobasal que contém uma mM de ácido láctico, Glutamax 0,5 mM, e 2% B27 sem insulina. Vortex e ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1 N. Permitir que o meio de crescimento fresco para equilibrar numa incubadora (37 ° C, 5% CO 2) durante pelo menos 30 min. </li></ol> 3. Perfusão cardíaca <ol><li> Descongelar completamente 200 ml de solução de perfusão e oxigenado com 95% O2 / 5% de CO 2 em gelo durante pelo menos 15 min. </li><li> Lavar uma lâmina vibratome com acetona, etanol a 70%, e dH2O Posicione a lâmina no vibratome. </li><li> Lave a câmara de resfriamento vibratome e tubos de perfusão com dH 2 O. Encher a câmara de refrigeração (4 ° C) Com solução de perfusão e continuar a oxigenar. </li><li> Anestesiar um rato com pentobarbital de sódio 50 mg / ml, diluído 1:1 com água estéril, injectado por via intraperitoneal. Verifique se o mouse é totalmente anestesiado por beliscar a cauda e observando nenhuma resposta. </li><li> Despeje solução de perfusão fria no reservatório de perfusão e tubos pouco antes da dissecção. Salve 20-30 ml para dissecação do cérebro e continuar a oxigenar no gelo. Fluxo por gravidade a partir de uma seringa de 60 ml elevada através de uma tubagem e uma agulha G 20 proporciona um fluxo suficiente. Permita que a solução para executar até que as bolhas de ar são lavadas. Continue para oxigenar. </li><li> Cortar a pele acima da caixa torácica do mouse. Levante a caixa torácica e, cuidadosamente, fazer um corte horizontal através do diafragma. Faça dois cortes laterais através da caixa torácica para cima em direção aos braços para expor o coração. Use uma pinça para segurar a caixa torácica. </li><li> Faça um pequeno corte 2 milímetros no átrio direito para fornecer um ponto de saída de sangue para ser lavada para fora do vascusistema lar. </li><li> Perfurar o ventrículo esquerdo com a agulha de perfusão, apenas o suficiente para inserir a abertura da agulha. Segurar a agulha no lugar com uma mão e iniciar o fluxo de solução de perfusão com a outra mão. Depois de 10-15 ml de solução de perfusão, o sangue deve ser lavado para fora e o efluente irá limpar. </li></ol> 4. Cérebro corte e Dissection <ol><li> Após a perfusão cardíaca, transferência oxigenado solução de perfusão a frio para uma placa de Petri em gelo imediatamente antes da utilização. </li><li> Decapitar Rapidamente, remover o cérebro do crânio e colocar o cérebro em solução de perfusão. Para remover o cérebro: puxe a pele para a frente, faça um corte na linha média no crânio em direção às órbitas, fazer 2 cortes laterais em direção a cada um dos olhos, use uma pinça para puxar para trás de cada lado do crânio, fazer um corte coronal entre as órbitas dos olhos, e use uma espátula para persuadir suavemente o cérebro para fora em solução de perfusão. Use a tesoura para cortar as vias ópticas, se necessário. Não tocar o hipotálamoc área e não puxe as vias ópticas, porque isso coloca muita pressão sobre a eminência mediana e tecido hipotalâmico subjacente. </li><li> Use uma lâmina de barbear e agulha lateralmente cortar o tecido cerebral de aproximadamente 3 mm posterior e anterior ao hipotálamo, enquanto o tecido está submerso (bregma -3,52 mm). É especialmente importante para o corte lateral anterior a ser de nível, de modo que o cérebro vai se sentar em frente a chuck vibratome. </li><li> Remover o tecido cerebral restante da solução e usar papel de filtro para afastar solução da seção cérebro montado. </li><li> Coloque um pouco de super-cola em um mandril vibratome e espalhar a cola com o tamanho do cérebro. Colocar o tecido cerebral em cima da cola com a face anterior virada para baixo e de frente para o hipotálamo da lâmina. Wick o excesso de cola e coloque a bucha na câmara de resfriamento vibratome. Tenha cuidado para não deixar muito cola, pois bolha em torno do cérebro, quando colocado em uma solução. </li><li> Com o Vibratome ajustado para uma velocidade lenta (nível 2) e alta amplitude (nível 9), fazer 300-500 mM fatias até chegar à área do hipotálamo. Agora faça finas fatias de corte 100 mm a partir do posterior ao anterior. As pistas visuais são como se segue. Posterior ao hipotálamo do terceiro ventrículo será muito pequeno (-2,70 para -2,30 bregma mm). No bregma -2,30 mm, o terceiro ventrículo é separado em dorsal e ventral em secções o corte coronal. </li><li> Uma vez que as seções do terceiro ventrículo fusível, faça dois 500 mm fatias que contêm a região correta do VMH (-2,18 para -1,22 bregma mm). Anterior à VMH, o terceiro ventrículo já não se estende para o chão ventral do cérebro (bregma -1.06 a -0.82) 8. </li><li> Transferir essas fatias para a placa de Petri, em gelo, contendo os meios de cultura. Dissecar VMH (VMN + ARC), como mostrado na Figura 1. Usar uma pipeta para transferir suavemente as peças VMH em 2 ml de meio de cultura sobre gelo. </li></ol> 5. Dissociação e Cultura <ol><li> Remover o VMH de gelo e colocar à temperatura ambiente. Adicionar 20 U / ml de papaína a 4 ml de meio de cultura. Inverter para misturar e coloque em um banho de água 34 C °. Verifique e misturar por inversão a cada minuto até que a mídia digestão não é mais nublado. Filtro (0,22 mM) em um frasco estéril e transferir o tecido para os meios de digestão. </li><li> Digerir o tecido, por agitação a 100 rpm a 34 ° C durante 30 min. </li><li> Prepare 1 ml de meio contendo 8% de albumina de soro bovino (BSA) durante a digestão. Dissolve-se 80 mg de BSA em 1 ml de meio de cultura e do filtro (0,22 mM) num tubo cónico. </li><li> Lavar o tecido através da transferência para 5 ml de meio de cultura num tubo cónico e, lentamente, invertendo uma vez. </li><li> Adicionar enzima DNase 30 mL de 6 ml de meio de cultura e misture para fazer mídia trituração. Aspirar a mídia de lavagem e adicionar 3 ml de mídia trituração. </li><li> Use as pipetas de vidro para triturar na ordem de largest para o menor. Gentilmente triturar 10x e aguarde 4 min para peças maiores para resolver. Utilizar a segunda pipeta para transferir o topo 2 ml contendo uma suspensão de células dissociadas de um novo tubo cónico. Adicionar 2 ml de mídia trituração, triturar 10x e esperar 3 min. Utilizar o terceiro pipeta para transferir os melhores 2 ml de suspensão de células. Adicionar 1 ml de mídia trituração, 5x triturar e esperar 2 min. Utilizar a quarta pipeta para transferir o topo 2 ml da suspensão de células. </li><li> A camada de suspensão de células dissociadas em cima da BSA 8%, tomando cuidado para não misturar. Centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. </li><li> Coloque autoclavado de 6 mm x 8 milímetros clonagem cilindros no centro de cada lamela. Lamelas deve estar completamente seca. Aspirar e ressuspender o sedimento em 440 mL de mídia crescimento quente. Preencha clonagem de cilindros com a suspensão neuronal e lugar na incubadora por 20 min. </li><li> Retire os cilindros de clonagem e muito gentilmente lavar detritos. Encha cada wi pratopo de 2 ml de meio de crescimento. Permitir que as células recuperar durante pelo menos 1 hr antes de quaisquer ensaios são realizados. </li></ol> 6. Preparação para o MPD imagem <ol><li> Adicione solução de gravação consiste de NaCl 121 mM, KCl 4,7 mM, CaCl2 2 mM, 0,1 mM de MgCl2, 1,2 mM de MgSO4, 0,97 mM de K 2 HPO 4, 0,23 mM, KH 2 PO 4, 5 mM de NaHCO3, e 25 mM HEPES. Ajustar o pH para 7,4. </li><li> Adicionar glucose para tornar a solução de teste de glicose baixo desejado (0,1-2,0 mM de glucose). Misturar bem e reservar 400 ml baixo solução de gravação de glicose. Adicionar glicose para os restantes 600 ml para fazer solução de gravação de glicose 2,5 mM e misture bem. </li><li> Proteger corante da luz tanto quanto possível. Adicionar 4 ml de temperatura ambiente de buffer para um frasco azul MPD. Misture bem e adicione 5 mL de corante por solução de gravação ml. Mantenha solução homogénea misturando com pipeta entre soluções. O corante fluorescente contém molecules, que entram células com despolarização, e supressor moléculas, que não podem atravessar a membrana celular. As aliquotas podem ser guardadas a -20 ° C e utilizado dentro de 4 dias. Não congelamento-descongelamento mais do que uma vez. </li><li> Incubar as células em 2 ml de 2,5 mM de solução de gravação de glicose mais corante a 34 ° C durante 30 min. Um bloco de aquecimento pode ser utilizado. Proteger da luz. </li><li> Prepare bombas de seringa e sistema de perfusão com 2,5 mM e 0,1 mM de soluções de gravação, mais corante. Tubos de 60 ml de seringas devem ser ligadas a um colector. </li><li> Depois de parar qualquer bomba, espere ~ 10 segundos antes de mudar soluções no colector para evitar o acúmulo de pressão na seringa. A mudança de pressão de distribuição de fluido para alterar a câmara fechada que contém os neurónios, causando alterações no foco do microscópio durante a experiência e distorção de imagens. </li><li> O tubo colector de saída deve ser ligado a um aquecedor em linha e, em seguida, tubo de polietileno, que se liga a uma câmara fechada.<html> Bolhas devem ser apuradas ea taxa de perfusão deve ser ajustada para 0,5 ml / min. Proteger da luz. </li><li> Transferir 25 milímetros lamela com os neurônios aderentes à câmara fechada, tomando cuidado para não permitir que lamela para secar e não introduzir bolhas de ar. O deslizamento é alinhada nas ranhuras da peça de fundo, um par de gotas de solução de gravação é colocado ao longo dos lados, e a parte superior está montada suavemente para segurar a lamela no lugar. </li><li> Usar uma pipeta para encher a câmara com a solução de gravação e, em seguida, colocar uma lamela de 18 milímetros na parte superior. Gentilmente caber anel branco na câmara para manter a lamela menor no lugar. Pressionar para baixo muito lentamente e levemente para evitar as bolhas de ar a ser introduzido no interior da câmara fechada. </li><li> Inicie a bomba de seringa para a solução de gravação de glicose 2,5 mM, pressione o anel branco, e conectar-se à câmara fechada. Solte lentamente a pressão do anel branco e se conectar a tubulação que conduz a um contentor de resíduos. </li></ol>e &quot;&gt; 7. MPD imagem <ol><li> Centralize os neurônios utilizando luz baixa de campo claro. Tentar minimizar a quantidade de tempo que as células estão a ser expostos à luz. </li><li> Permitir que o sistema de perfusão de correr por 10 min para permitir a estabilização da temperatura, foco e tingir o equilíbrio. </li><li> Enquanto priming, abra o programa MetaMorph e dar uma imagem de campo claro (10X) dos neurônios. Use a função de Auto-Focus para tomar 3 pilhas de imagens fluorescentes (150 ms, filtro de Cy3 Narrow, 10X) e determinar o foco dentro de 5 mm. No final do período de condicionamento de 10 min, verificar o foco mais uma vez. </li><li> Comece a gravar imagens fluorescentes a cada 30 seg por 40 min. Estabelecer uma linha de base em 2,5 mM de glicose durante 10 minutos, em seguida diminua glicose durante 15 minutos, e finalmente voltar a 2,5 mM de glucose, durante 15 min. Soluções são alteradas, parando uma bomba de seringa, à espera de 10 segundos, voltando-se uma porta no colector, e começar outra bomba de seringa. As mudanças devem ocorrer antes de desejados momentos based sobre a defasagem entre o colector e células. </li><li> Depois de gravar todas as imagens fluorescentes, dê uma imagem de campo claro dos neurônios. </li></ol> 8. Análise MPD imagem <ol><li> Use MetaMorph para criar regiões ovais ao redor de cada célula na imagem de campo claro tomada no final do experimento in. Regiões deve ser ligeiramente maior do que cada neurônio e podem ser feitas de 1 pixel fora de borda escura da célula. Não escolha células que são insalubres, sobreposição, ou perto de detritos. Células saudáveis, muitas vezes aparecem escuras. Por fim, criar 5 grandes regiões ovais em áreas com ausência de células ou detritos para as medições de fundo. </li><li> Transfira as regiões para todas as imagens fluorescentes e inspecionar para verificar que nenhum movimento / mudança ocorreu. Use a função de medida para registrar a intensidade de fluorescência de cada região para todas as imagens em um arquivo do Excel. O uso de Revistas em Metamorph é aconselhada. </li><li> No Excel, crie uma média de 5 regiões de fundo para cada fluorescimagem ent. Isto representa o valor médio do fundo em cada ponto de tempo. Para cada ponto de imagem / tempo, subtrair o fundo de todas as medições região. A intensidade de fluorescência subtraído-fundo será chamado de intensidade a seguir. </li><li> Para cada célula, calcular a intensidade média durante 2-8 minutos de gravação. Isso representa a linha de base da célula em glicose 2,5 mM. Um tampão de dois minutos em ambas as extremidades de cada tratamento é utilizado para minimizar o ruído. </li><li> Para cada célula, calcular a percentagem de alteração a partir da linha de base: (Intensidade-Base) / Base </li><li> Criar um gráfico de linha com a variação percentual da linha de base vs tempo. </li><li> Calcule a variação percentual média da linha de base durante minutos 18-23. Calcule a variação percentual média da linha de base durante 35-40 minutos. Durante o processamento da imagem não é utilizado, o ruído é reduzido por meio do cálculo da média de intensidade dentro de cada região celular, de subtracção do fundo, e a média da intensidade de região, durante 5 minutos or mais. </li><li> Experimentos de controle em que mM solução de gravação de glicose 2,5 mM é trocada com solução de gravação de glicose 2,5 devem ser realizados para determinar o limiar de ruído. Calcule a variação percentual média da linha de base durante 18-23 minutos, para, pelo menos, 6 pratos e 3 ratos. Determine a média e desvio padrão desses valores. </li><li> Definir o limiar de uma resposta positiva de despolarização à média mais dois desvios padrão. A média mais dois desvios padrão corresponde a uma diferença com p &lt;0,05. As experiências de controlo revelou uma alteração de 10% da linha de base como o valor limiar apropriado. </li><li> Para cada célula, avaliar a resposta de despolarização reversível com base em dois critérios. Em primeiro lugar, a alteração percentual média da linha de base durante 18-23 minutos, deve ser maior do que 10%, o limite determinado na etapa anterior. Em segundo lugar, a variação percentual média da linha de base durante 35-40 minutos, deve ser inferior a metade da variação percentual média delinha de base durante minutos 18-23. O segundo critério foi escolhido, uma vez que foi encontrado para ser mais rigoroso do que a estimulação com glutamato ou KCl. Neurônios não saudáveis ​​costumam responder à estimulação com glutamato ou KCl, embora suas respostas a diminuição da glicose não são reversíveis. </li><li> Para cada prato, calcular a% de neurônios despolarizadas. Este valor é utilizado para quantificar a% de neurónios GI entre os diferentes grupos de tratamento. </li></ol>

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	<li>Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-sensing+neurons:+are+they+physiologically+relevant?.">Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?.</a> Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).</li><li>Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+impairs+glucose+and+insulin+regulation+of+nitric+oxide+production+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus.">Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).</li><li>Canabal, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose,+insulin,+and+leptin+signaling+pathways+modulate+nitric+oxide+synthesis+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus.">Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).</li><li>Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMP-activated+protein+kinase+and+nitric+oxide+regulate+the+glucose+sensitivity+of+ventromedial+hypothalamic+glucose-inhibited+neurons.">AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).</li><li>Murphy, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasting+enhances+the+response+of+arcuate+neuropeptide+Y-glucose-inhibited+neurons+to+decreased+extracellular+glucose.">Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucokinase+is+a+critical+regulator+of+ventromedial+hypothalamic+neuronal+glucosensing.">Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing.</a> Diabetes. 55, 412-420 (2006).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prior+hypoglycemia+enhances+glucose+responsiveness+in+some+ventromedial+hypothalamic+glucosensing+neurons.">Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons.</a> Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).</li><li>Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+pre-+and+postsynaptic+influences+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus.">Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).</li><li>Song, Z., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+glucose+and+lactate+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus.">Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 54, 15-22 (2005).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

A chave para ser capaz de estudar a atividade dos neurônios de camundongos adultos é a capacidade de dissociar os neurônios saudáveis. A dissociação dos neurônios do hipotálamo de camundongos adultos é mais difícil em vários passos-chave no protocolo em comparação com neurônios de ratos juvenis. Temos superar este problema de várias formas. Fazendo grossas fatias de 500 mm do cérebro minimiza danos mecânicos aos neurônios, em comparação com os habituais 250-350 mM fatias utilizados para o tecido cere...

O cérebro regula a homeostase energética através da neuroendócrino e sistema nervoso autônomo. O hipotálamo ventromedial (VMH), constituída pelo núcleo ventromedial (VMN) e o núcleo arqueado (ARC), é importante para a central de regulação da homeostase da energia. Neurônios sensores de glicose Especializadas, no VMH, vincular a atividade neuronal e homeostase da glicose periférica 1. Existem dois tipos de sensores de glicose neurônios; glicose animado (GE) neurônios aumentar enquanto a glicose inibida (GI) neurônios diminuir a sua actividade com o aumento da glicose extracelular. Neurônios glicose VMH sensores geralmente são estudados utilizando eletrofisiologia ou cálcio / membrana potencial de imagem sensível corante. A técnica de patch clamp eletrofisiológico é considerada o padrão-ouro no estudo da atividade neuronal ex vivo. Nesta técnica, um eléctrodo de micropipeta de vidro é ligado à membrana celular através de uma elevada resistência(GÊ) selo. Eletrodos patch clamp permitir a gravação em tempo real do potencial de ação freqüência (pinça de corrente) ou condutância de íons (braçadeira de tensão) muda dentro de um único neurônio. Embora a técnica de patch clamp fornece informações detalhadas sobre mudanças na condutância de canais iônicos específicos, uma grande desvantagem é que apenas um neurônio pode observar ao mesmo tempo. Demora cerca de 30-45 minutos de gravação para verificar que se está a gravação de um neurônio sensor de glicose antes mesmo de iniciar um tratamento experimental específico. Além disso, GI e GE neurônios compreendem &lt;20% do total da população neuronal VMH. Para agravar este problema é a falta, em muitos casos, de um marcador celular de identificação para esses neurônios. Assim, é evidente que apesar de fornecer informação eléctrica valiosa que outras técnicas não é possível, a análise de fixação de membranas é trabalhoso, demorado e baixo rendimento. A utilização de imagens de fluorescência de neurónios dissociados VMH permite o estudo de hundreds de neurônios simultaneamente. Corantes sensíveis de cálcio pode ser utilizado para medir alterações de cálcio intracelular, que indirectamente se correlacionam com alterações na actividade neuronal. Corantes sensíveis potenciais de membrana são utilizados para monitorar mudanças potenciais de membrana. Medir o potencial de membrana celular é um indicador mais directa da actividade neuronal em comparação com alterações nos níveis de cálcio intracelular. Além disso, a membrana potencial corante (MPD) imagens potencialmente detectar pequenas mudanças no potencial da membrana onde a ação potencial de disparo não é alterada e os níveis de cálcio intracelular pode não mudar. Ambas as técnicas de imagiologia de fluorescência foram utilizados para estudar VMH neurónios sensores de glucose de ratinhos jovens 2-7. Embora os resultados são menos detalhadas do que as obtidas com patch clamp eletrofisiologia, a força de experimentos com imagens é que eles avaliam simultaneamente uma grande população de células que, inevitavelmente, incluem um número significativo de neurônios sensores de glicose. MPD i imagemé particularmente útil para estudar os neurónios GI que são mais uniformemente localizada ao longo de todo o VMH; proporcionando assim uma população adequada para estudar o VMH dissociado (~ 15% GI). Por outro lado, enquanto os neurônios da GE são densamente localizada no ventrolateral-VMN e celular pobre região entre o ARC e VMN, eles não representam um número significativo de neurônios dentro do VMH (&lt;1% GE). Além disso, através do estudo de neurônios isolados, astrocitária e efeitos pré-sinápticos são eliminados. Isto pode ser uma vantagem em estudar os efeitos de primeira ordem de neurónios, bem como uma desvantagem uma vez que as ligações e os processos fisiológicos estão perdidos. Um factor limitante, tanto Electrofisiologia de fixação de membranas e MPD / cálcio corante de imagem é a necessidade de utilizar animais mais novos (por exemplo, ratos ou ratazanas. &lt;8 semanas de idade). Isto é, predominantemente, devido a um aumento do tecido conjuntivo, em combinação com a diminuição da viabilidade neuronal que ocorre com a idade. No cérebro-slice eletrofisiologia do parafuso prisioneiros, o aumento do tecido conjuntivo faz com que seja mais difícil visualizar os neurônios. O aumento do tecido conjuntivo também torna mais difícil dissociar um grande número de neurônios saudáveis ​​para estudos de imagem. Além disso, os neurônios dos animais mais jovens sobrevivem por mais tempo durante o registo patch clamp ou imagem. No entanto, o uso de ratos jovens pode ser uma grande limitação. Actividade e / ou uma resposta a neurotransmissores ou nutrientes que circulam neuronal muda com a idade. Por exemplo, uma vez que o balanço energético está intimamente ligada ao estado reprodutivo, os neurônios do hipotálamo que regulam o balanço energético podem responder de forma diferente em pré-vs animais pós-púberes. Além disso, muitas doenças necessitam de um tratamento a longo prazo ou não se manifestar até a idade adulta. Os principais exemplos de tais doenças são a obesidade dietética ou Diabetes Mellitus Tipo 2. Desde neurônios sensores de glicose são acreditados para jogar um papel nestas doenças, desenvolvemos uma metodologia para cultivar com sucesso adultos VMH neurônios saudáveis ​​para uso em exp imagem MPDeriments.

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	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Neurobasal-A Medium (Custom)</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">0050128DJ</td>
			<td style="width:427px;">custom made glucose free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Hibernate-A Medium (Custom)</td>
			<td style="width:115px;">BrainBits</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>custom made glucose free</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Penicillin streptomycin (20,000 U/ml)</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">15140</td>
			<td>other vendors acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Stericup vacuum filter units (0.22 &#956;m)</td>
			<td style="width:115px;">Millipore</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>other vendors acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">25 mm Glass coverslips</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">#1 25mm round</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">18 mm Glass coverslips</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">#1 18mm round</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">B27 minus insulin (50x)</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">0050129SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Razor blade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:180px;">55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Vibratome &#38; cooling chamber</td>
			<td style="width:115px;">Vibratome</td>
			<td style="width:180px;">Series 1000 Sectioning system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Vibratome blades</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences</td>
			<td style="width:180px;">22370</td>
			<td>injector or double edge blades from other vendors acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Papain, suspension</td>
			<td style="width:115px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS003124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">BSA, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>other vendor acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">DNAse, for cell culture</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>other vendor acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">cloning cylinders, 6 mm x 8 mm</td>
			<td style="width:115px;">Bellco Glass</td>
			<td style="width:180px;">2090-00608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Membrane Potential Dye (blue)</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:180px;">R8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">In-line heater</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Syringe pumps</td>
			<td style="width:115px;">WPI</td>
			<td style="width:180px;">sp100i</td>
			<td>other vendor acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Closed chamber</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">RC-43C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">PE-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Metamorph</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>alternate image analysis software acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Microscope</td>
			<td style="width:115px;">Olympus</td>
			<td style="width:180px;">BX61 WI</td>
			<td>
			used with 10X&#160;objective
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Camera</td>
			<td style="width:115px;">Photometrics</td>
			<td style="width:180px;">Cool Snap HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Narrow Cy3 Filter Set</td>
			<td style="width:115px;">Chroma</td>
			<td style="width:180px;">41007a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Illumination System</td>
			<td style="width:115px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:180px;">Lambda DG-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

membrane potential dye imaging of ventromedial hypothalamus neurons from adult mice to study glucose sensing

Estudos sobre a atividade neuronal são frequentemente realizadas utilizando neurônios de roedores com menos de 2 meses de idade, devido às dificuldades técnicas associadas com o aumento do tecido conjuntivo e diminuição da viabilidade neuronal que ocorrem com a idade. Aqui, descrevemos uma metodologia para a dissociação de neurônios do hipotálamo de ratos saudáveis ​​em idade adulta. A capacidade para estudar os neurónios de ratos adultos em idade permite a utilização de modelos de doenças que se manifestam numa idade mais avançada e pode ser mais preciso para a developmentally certos estudos. Imagens de fluorescência de neurónios dissociados pode ser utilizado para estudar a actividade de uma população de neurónios, em oposição ao uso de electrofisiologia para estudar um único neurónio. Isso é particularmente útil quando se estuda uma população neuronal heterogêneo no qual o tipo neuronal desejado é raro, como para glicose sentindo neurônios do hipotálamo. Utilizamos membrana potencial de imagem corante de neurônios do hipotálamo ventromedial adultos para estudar as suas respostas a chaNGES na glucose extracelular. Neurônios sensores de glicose são acreditados para jogar um papel na regulação central do equilíbrio energético. A capacidade para estudar a detecção de glicose em roedores adultos é particularmente útil uma vez que a predominância de doenças relacionadas com o balanço de energia disfuncional (por exemplo. Obesidade) aumentar com a idade.

A dissecção precisa do VMH longe de outras áreas do hipotálamo é importante para a obtenção de resultados consistentes. A inclusão de outras áreas podem diluir a população neuronal VMH, mudando a% de neurónios despolarizadas calculados. Além disso, os neurónios sensores de glicose foram identificados em outras regiões do hipotálamo, como o hipotálamo lateral, que pode ser diferente funcionalmente e mecanicamente a partir de glicose VMH detecção neurónios. Figura 1 ilustra as localiza...

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Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

A atividade de neurônios individuais de ratos em idade adulta pode ser estudado por dissociar os neurônios de regiões específicas do cérebro e usando membrana fluorescente potencial de imagem corante. Por testes de respostas a alterações nos níveis de glucose, esta técnica pode ser utilizada para estudar a sensibilidade à glicose dos neurónios hipotalâmicos ventromediais adultos.

Membrana Potencial Dye imagem de Ventromedial Hipotálamo Neurônios de camundongos adultos para estudar Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

membrane-potential-dye-imaging-ventromedial-hypothalamus-neurons-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K visualizações.  Rutgers New Jersey Medical School.  A atividade de neurônios individuais de ratos em idade adulta pode ser estudado por dissociar os neurônios de regiões específicas do cérebro e usando membrana fluorescente potencial de imagem corante. Por testes de respostas a alterações nos níveis de glucose, esta técnica pode ser utilizada para estudar a sensibilidade à glicose dos neurónios hipotalâmicos ventromediais adultos. 

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Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Microdissecção Captura de Drosophila Neurônios periféricos

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Neurociência

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

We demonstrate application of the fluorescence indicator, TMRM, in cortical neurons to determine the relative changes in TMRM fluorescence intensity before and after application of a specific stimulus. We also show application of the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the relative level of reactive oxygen species in cortical neurons.

Determinação de Membrana Mitocondrial Espécies de Oxigênio Reativas Potencial e em neurônios de rato vivo Cortical

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Imagiologia pHluorin-tagged Inserção receptor para a membrana plasmática em primários de rato cultivadas Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Cérebro Fatia Biotinilação: Uma<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem medir Região específicas do tráfego de proteínas de membrana plasmática em adultos Neurônios

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

Imagens intracelular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em estriado astrócitos de ratos adultos, através de indicadores de cálcio geneticamente codificados

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, interactions with our environment can induce brain plasticity. Increasingly, research is trying to identify which environments stimulate brain plasticity beneficial for treating brain and behavioral disorders. Two environmental manipulations are described which increase or decrease the number of tyrosine hydroxylase immunopositive (TH+, the rate-limiting enzyme in dopamine (DA) synthesis) neurons in the adult mouse midbrain. The first comprises pairing male and female mice together continuously for 1 week, which increases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in males, but decreases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in females. The second comprises housing mice continuously for 2 weeks in &#8216;enriched environments&#8217; (EE) containing running wheels, toys, ropes, nesting material, etc., which increases midbrain TH+ neurons by approximately 14% in males. Additionally, a protocol is described for concurrently infusing drugs directly into the midbrain during these environmental manipulations to help identify mechanisms underlying environmentally-induced brain plasticity. For example, EE-induction of more midbrain TH+ neurons is abolished by concurrent blockade of synaptic input onto midbrain neurons. Together, these data indicate that information about the environment is relayed via synaptic input to midbrain neurons to switch on or off expression of &#8216;DA&#8217; genes. Thus, appropriate environmental stimulation, or drug targeting of the underlying mechanisms, might be helpful for treating brain and behavioral disorders associated with imbalances in midbrain DA (e.g. Parkinson&#8217;s disease, attention deficit and hyperactivity disorder, schizophrenia, and drug addiction).

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

Modulações Ambientais do número de Midbrain dopamina Neurônios no Adulto Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Membrana Potencial Dye imagem de Ventromedial Hipotálamo Neurônios de camundongos adultos para estudar Glucose Sensing

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