Esta técnica é significativa porque pode medir a absorção de glicose em células específicas em tecidos Drosophila vivos. O sensor baseado em FRET fornece uma medida direta das alterações nos níveis de glicose intracelular. Essa técnica permite que os pesquisadores avaliem mudanças nos níveis de glicose em tempo real, dentro de neurônios motores vivos de modelos de ELA versus controles.
Um aspecto desafiador é a imagem do mesmo conjunto de neurônios depois de mudar o buffer. Deixar a amostra no microscópio ajuda a garantir que o VMC se mova o mínimo possível. Antes de começar, as dissecções ligam o microscópio de imagem e os lasers.
Em seguida, colete uma terceira larva instar errante, enxágüe-a com água dupla destilada e coloque-a em uma gota de tampão HL3 em um prato alinhado de elastômero previamente preparado. Em seguida, sob um microscópio dissecando, use um par de fórceps para fixar as extremidades anterior e posterior da larva, lado dorsal para cima, esticando cuidadosamente o comprimento da larva em termos de pinos de insetos. Usando um par de tesouras iris angulares, faça uma incisão logo acima do pino posterior.
Em seguida, faça um corte vertical da incisão em direção à extremidade anterior da larva. Depois de adicionar algumas gotas de tampão HL3, se necessário, remova a traqueia e o resto dos órgãos flutuantes sem perturbar o sistema nervoso central. Em seguida, fixar os retalhos, esticando a parede do corpo para expor o sistema nervoso central, mantendo o sistema neuromuscular intacto.
Para aquisição de imagens, use microscópio confocal vertical com uma lente de imersão de água 40 vezes. Em seguida, selecione o laser de 405 nanômetros para excitar o PCP. Em seguida, otimize os parâmetros de aquisição, como velocidade de varredura, velocidade de varredura, tamanho médio, objetivo, zoom pinhole e resolução espacial.
Ajuste o ganho de modo que o sinal esteja no intervalo dinâmico ideal e use os mesmos parâmetros para todos os genótipos. Para a imagem dos neurônios motores dentro do fio nervoso ventral, coloque a antena de silicone com a amostra dissecada sob a lente e baixe a lente para que ela entre em contato com o tampão de sacarose trehalose HL3. Certifique-se de que a lente está completamente submersa no buffer e adicione mais tampão, se necessário. Próximo.
Utilizando os canais CFP e FRET, selecione manualmente uma seleção óptica composta por pelo menos seis neurônios motores em foco localizados ao longo da linha média do cabo nervoso ventral. Em seguida, adquira imagens a cada 10 segundos por 10 minutos. Essas imagens representam a linha de base.
Para estimulação de glicose, remova a sacarose trehalose contendo tampão HL3 usando uma pipeta Pasteur e adicione cinco tampão HL3 suplementado de glicose milimila sem mover o fio nervoso ventral. Em seguida, adquira imagens a cada 10 segundos por mais 10 minutos. Essas imagens representam a fase de estimulação.
Salve as imagens como arquivos CZI ou qualquer tipo de arquivo suportado pelo software de imagem com um nome de arquivo, incluindo data, fundo genético, condição experimental e canais usados. Reutilize os parâmetros para a imagem de todos os genótipos. Para processar imagens abra o software de imagem Fiji-ImageJ e, em seguida, abra os arquivos CZI, escolha a pilha de visualização com hipercompacta e defina o modo de cor em escala cinza e selecione canais divididos em janelas separadas. Próximo.
Processe as imagens usando plug-ins de correção de deriva, turbo reg e stack reg. Cada canal é corrigido separadamente selecionando stack reg sob plug-ins e, em seguida, escolhendo a transformação para a tradução. Escolha manualmente as regiões de interesse ou ROIs rastreando todos os neurônios motores que permanecem em foco durante toda a série temporal.
Em seguida, use o gerenciador de ROI para salvar cada contorno do neurônio motor. Use a função multi medida para medir o valor cinza médio em cada ROI em cada ponto de tempo. Em seguida, copie os ROIs rastreados do primeiro canal para o segundo canal para a imagem pré-estimulação.
Para análise de dados, calcule a razão FRET por CFP utilizando os valores cinza médios para os canais FRET e CFP. Alterações nas relações DE TRAP por CFP refletem alterações na concentração de glicose intracelular. Em seguida, plote as relações FRET por CFP para cada ROI e ponto de tempo versus tempo.
Um sensor de glicose à base de FRET geneticamente codificado foi usado para medir a absorção de glicose em neurônios motores. Quando a glicose não está ligada ao sensor, a excitação cfp causa apenas emissão de CFP. E quando a glicose se liga, o sinal YFP pode ser detectado devido ao TRASco ocorrendo entre CFP e YFP.
Aqui são mostradas imagens de sinais DE FRET e CFP em controles de sensores de glicose em neurônios mutantes TDP-43 sob condições de linha de base e estimulação. Um neurônio motor representativo é descrito em cada imagem como um exemplo de ROI. Após a estimulação da glicose, controle os neurônios motores que expressam sensores de glicose, apresentam um pequeno aumento na absorção de glicose, enquanto os neurônios que expressam TDP-43 mostraram uma absorção de glicose significativamente maior.
Outras relações FRET por CFP de neurônios motores mutantes TDP-43 foram normalizadas para controles de sensores de glicose em cada ponto de tempo. Sob condições básicas, não houve diferença entre os genótipos. No entanto, após a estimulação da glicose, observou-se um aumento rápido e significativo na absorção de glicose em mutantes TDP-43 em comparação com o controle.
Em uma representação de gráfico de barras, a estimulação de glicose em neurônios expressando o sensor de glicose demonstrou um pequeno, mas significativo aumento na relação FRET por CFP em comparação com a linha de base. Em contraste, os neurônios que expressam TDP-43 apresentaram um aumento significativo na razão de estimulação em comparação com a linha de base. A diferença líquida nas relações DE TRAC por CFP entre neurônios motores expressando TDP-43 e sensor de glicose é em torno de 10,9% O gerenciamento de tempo é fundamental para este procedimento para que os neurônios não morram ao longo da imagem.
É importante imaginar imediatamente após as dissecções para evitar isso. Esta técnica destacou a importância do metabolismo da glicose nos neurônios e levou nosso grupo a investigar melhor o papel da glicólise na regeneração do neurônio motor.
