Os autores gostariam de agradecer ao Programa de Biologia Rato Davis UC para a reprodução dos ratos. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha.

Todos os estudos em animais e experimentos foram conduzidos em um protocolo aprovado pela University of California, Davis Institutional Animal Care e do Comitê Use Consultivo Administrativo. 1. MUC1.Tg Rato Breeding e Propagação <ol><li> O Davis Programa de Biologia Rato UC (MBP) raças tipo camundongos C57BL / 6 machos selvagens com heterozigotos MUC1.Tg C57BL / 6 do sexo feminino para estabelecer a nossa colônia de reprodução. MUC1.Tg filhotes são entregues para os estudos, conforme necessário. </li><li> Pessoal MBP cortar os dedos do filho em um padrão definido (0-99) para identificação mouse, e quando aplicável clipe da cauda. O dedo do pé ou o tecido da cauda é processado para a genotipagem utilizando a extracção de ADN padrão e Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR), análise. </li></ol> 2. Desenho do Estudo <ol><li> Estudar trabalhos de grupo <ol><li> Pesar cada rato separadamente em uma balança e registrar o peso em gramas de cada mouse. </li><li> Esta parte do processo de invOlvés a metodologia e desenho do estudo. Para a primeira parte do estudo, atribuir pareados por idade camundongos tipo MUC1.Tg e selvagem para começar a indução de câncer de bexiga com OH-BBN. Eutanásia ratinhos 8 semanas após a última dose de OH-BBN para confirmar a presença de tumores de bexiga por histologia. </li><li> Para a segunda parte do estudo, os ratinhos aleatoriamente MUC1.Tg macho para um número adequado de tratamento e grupos de controlo. Estes ratinhos ser monitorizadas as citocinas no soro e as respostas imunitárias de células T durante a indução e desenvolvimento de tumores, e, em seguida, no final do estudo 8 semanas após a última dose de OH-BBN. </li></ol></li><li> Indução de cancro da bexiga <ol><li> OH-BBN é uma substância cancerígena e altamente tóxica. Por favor, leia e siga as orientações da ficha de segurança ao manusear e armazenar este produto químico. </li><li> Calcular a concentração da solução de dosagem necessária para administrar a dose apropriada (3 mg), num volume de 100 ul, a cada rato com base nos pesos médios e number de ratinhos em cada grupo de estudo e. </li><li> Dilui-se a OH-BBN em etanol a 100%. Levar a concentração final de 30 mg / ml com água estéril. O final de etanol: concentração de água deve ser de 20:80, v / v </li><li> Administrar o OH-BBN oralmente utilizando aço inoxidável, 20 g de agulhas de gavage diárias, 5 dias / semana, durante 12 semanas, com base na atribuição de grupo de tratamento inicial com a idade de 8 semanas. </li></ol></li><li> Tratamentos de vacinação <ol><li> Reconstituir cada frasco de vacina peptídeo liofilizado em 600 ml de solução salina 0,9% estéril e completamente ressuspender desenhando a solução através de um 0,5 polegadas 27 agulha G 6x. Usando salina, ajustar a concentração de modo que a dose desejada é entregue num volume de 100 ul. </li><li> Começando na semana 20, após a última dose de OH-BBN, administrar a vacina numa base semanal, para um ciclo de oito semanas por injecção subcutânea de 100 ul usando uma agulha 25 G (número de semanas corresponde à idade dos ratinhos). </li></ol></li><li> Monitoramento e Coleta de Amostras <ol><li> Pesar todos os ratinhos e palpar para a presença de novos tumores uma vez por semana. Eutanásia quaisquer ratinhos que perderam ≥ 20% do peso do corpo, ou se existem tumores palpáveis, sangue na urina, e / ou retenção urinária. </li><li> Antes da primeira dose de OH-BBN e depois com intervalos de 4 semanas depois, recolher o sangue total através de sangrias submandibulares. Recolher o sangue em tubos de coagulação de soro Microtainer (BD) e 30 min para permitir a coagulação do sangue. </li><li> Centrifugar as amostras de sangue numa microcentrífuga a 3500 xg durante 10 min. Transferir cuidadosamente o soro para estragar criotubos tampão usando uma pipeta. </li><li> Congelamento flash em azoto líquido e armazenam-se a -80 ° C até análise posterior por multiplex. </li><li> Oito semanas após a última dose de OH-BBN, sacrificar todos os animais por asfixia CO 2. </li><li> Coloque cada rato em uma placa de dissecção e fechar por quatro membros. </li><li> Utilizando uma pinça e tesouras, make uma incisão horizontal na região abdominal superior. Inserir a tesoura na incisão entre a camada epidérmica e parede abdominal e separar cuidadosamente a pele do tecido subjacente com a ajuda de fórceps. </li><li> Adicione uma incisão vertical da incisão horizontal seguindo o eixo central em direcção à extremidade anterior do rato. Separe a pele da caixa torácica, e usando uma seringa de 1 ml e uma agulha de 22 G, perfure o coração e coleta de sangue com um empate suave e constante. </li><li> Consulte o passo 2.4.3 e 2.4.4 para o isolamento e armazenamento de soro. </li><li> Utilizando uma pinça e tesoura, cortar e descascar o resto da camada epidérmica. Corte através da parede abdominal e peritônio e retire assepticamente tumor da bexiga por imuno-histoquímica (IHQ) e Western blot. </li><li> Colete baço para análise da viabilidade celular (Muse) e ELISpot. Para IHC, lugar bexiga espécime tumor em cassete tecido e fixar em formol durante a noite gelada à temperatura ambiente. </li&gt; <li> No dia seguinte, substitui o formol com etanol a 70%. </li><li> Para a análise de Western blot de tumor, homogeneizar o tumor, adicionar tampão de extração de proteínas além de inibidores de protease Parada e transferir para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Vortex para 30-60 segundos e manter em gelo por 5 min. Flash congelar em nitrogênio líquido e descongelamento na água ambiente. Repetir o processo de vórtice, a congelação e descongelação duas vezes. </li><li> Centrifugar as amostras a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C e transfere-se os extractos celulares para novos tubos etiquetados. </li><li> Quantificar a concentração através da realização de um ensaio de proteína ácida bicinconínico (BCA) para medições de proteínas. Armazenar as amostras a -80 ° C até estar pronto para a análise de Western blot. </li></ol></li></ol> 3. Biologia Molecular / Western Os seguintes procedimentos foram realizados para verificar a expressão de MUC-1 no tecido de tumor da bexiga do rato utilizando o protocolo padrão de Western blot (dados não mostramn). <ol><li> Separa-se os extractos de proteína por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) e em seguida, transferir para uma membrana de PVDF utilizando um aparelho semi-secos. </li><li> Bloquear a membrana da proteína transferida com 5% de leite desnatado em 0,1% de Tween-20 em tampão fosfato salino (PBS-T), a pH 7,4, durante 1 hora num agitador orbital à temperatura ambiente. </li><li> Incubar a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente num agitador com o anticorpo anti-MUC-1 ou anti-β-actina em 0,1% PBS-T. </li><li> Lava-se a membrana por meio de decantação da solução e adicionando 0,1% de PBS-T. Redemoinho da membrana no agitador durante 5 minutos e decantar. Repita esta etapa duas vezes. </li><li> Incubar a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente com peroxidase de rábano (HRP) conjugado com anticorpo secundário. </li><li> Lave 3x (consulte o passo 3.4). </li><li> Siga o protocolo para o Chemiluminesence kit avançado (ECL) para ativar e ler o fluorografia. </li></ol> 4. Multiplex Fluorimétrica Imunoensaio Microbead &lt;ol&gt; <li> Configuração e Cálculos <ol><li> Usando um mapa da placa de 96 poços, ceder espaços em branco, padrões, controles e amostras nas cavidades. Calcular o número e volume de analitos, anticorpos de captura e estreptavidina-Ficoeritrina (SA-PE), necessária para o ensaio. </li><li> Permitir que todos os tampões e diluentes para equilibrar à temperatura ambiente. Preparar os padrões e as diluições da amostra, utilizando uma placa de 96 poços em branco. </li><li> Reconstituir a matriz de soro padrão e liofilizada de acordo com o protocolo e fazer uma série de diluições 1:05 do padrão com o diluente apropriado na placa de 96 poços do fabricante. Para os poços em branco, utilizar o diluente apropriado. </li><li> Dilui-se todos os controlos e as amostras desconhecidas 1:02 no diluente apropriado no resto da placa de 96 poços. </li><li> Para a mistura de grânulo, pipetar o volume necessário de o diluente apropriado em um tubo de 15 ml. Vortex de cada frasco talão durante 20 seg e pipetar o volume necessário de cada analito para o tubo de 15 ml. </li&gt; <li> Proteja sempre as contas de luz, para evitar a fotodegradação. Não colocar a placa de 96 poços em material absorvente para evitar a perda de amostra através de capilaridade. </li></ol></li><li> Protocolo de Ensaio <ol><li> Prewet a placa de fundo de filtro de 96 poços com 200 ul de tampão de ensaio e para permitir a imersão completa do filtro. Suavemente drenar através do aparelho de vácuo de placas de 96 poços e secar o fundo da placa com uma toalha de papel. </li><li> Usando uma pipeta multicanal, pipeta 25 ul de soro padrão aos poços designados para os espaços em branco e padrões e pipeta de 25 mL de tampão de ensaio aos poços designados para os controlos e amostras. </li><li> Pipetar 25 mL do branco, as normas, controles e incógnitas para os respectivos poços atribuídos. Vortex a mistura de esferas durante 20 segundos e transferir os grânulos a um reservatório. </li><li> Pipetar 25 ul da mistura de contas para cada poço. Cobrir a placa com uma folha de alumínio ou de uma tampa de placa opaco para proteger da luz. </li><li&gt; Agitar a placa a 500 rpm durante duas horas à temperatura ambiente num agitador de placas. Drenar e lavar a placa com 200 ul de 0,1% de Tween 20 em tampão fosfato salino (PBS-T), duas vezes. Escorrer e secar. </li><li> Preparar a solução de anticorpo de captura. Pipetar a quantidade necessária de 0,1% em PBS-T e anticorpo de captura num tubo ml e 15 vórtice durante 10 seg. Transferir a mistura de anticorpo de captura a um reservatório e uma pipeta de 25 uL em cada poço. </li><li> Agitar a placa a 500 rpm durante uma hora à temperatura ambiente num agitador de placas. Drenar e lavar a placa com 200 ul de 0,1% de PBS-T por duas vezes. Escorrer e secar. </li><li> Prepare a solução de SA-PE. Pipete o volume requerido de 0,1% de PBS-T e SA-PE num tubo ml e vortex durante 10 seg 15. Transferir a solução para um reservatório e uma pipeta de 25 uL em cada poço. </li><li> Agitar a placa a 500 rpm durante 30 minutos à temperatura ambiente num agitador de placas. Drenar e lavar a placa com 200 ul de 0,1% de PBS-T por duas vezes. Escorra e bmuito seco. </li><li> Pipete 100 pi de 0,1% de PBS-T e agitar num agitador de placas a 500 rpm durante pelo menos dois minutos para ressuspender as esferas. Ler e analisar a placa na máquina LX200 Luminex. </li></ol></li></ol> 5. IFN-γ/IL-4 ELISpot Elaboração e Análise <ol><li> Em uma cabine de segurança biológica, processar os baços a 100 tecido Nylon mM peneiras em 5 ml de fosfato estéril, solução salina tamponada (PBS) em placas de Petri estéreis. Camada de esplenócitos em 3 ml de meio de separação de linfócitos em tubos estéreis de 15 ml. </li><li> Centrifugar os tubos a 600 xg durante 15 minutos para separar os linfócitos das células vermelhas do sangue. Transferir as camadas de linfócitos acima do gradiente para novos tubos estéreis de 15 ml. </li><li> Ajustar o volume para 10 ml com PBS estéril. Centrifugar a suspensão a 600 xg durante 10 min para sedimentar as células. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de PBS para a viabilidade celular e contar com a Musaanalisador. Siga o Muse Conde &amp; protocolo Kit de Viabilidade. </li><li> Fazer diluições seriadas dos linfócitos em 1,5 ml de parafusos de fixação em tubos de centrífuga de factores de diluição de 1:10, 1:20 e 1:40 (ou conforme o necessário) em Contagem &amp; Reagente Viabilidade (mínimo volume total de 300 ul). Pipeta cada diluição cima e para baixo várias vezes para misturar e analisar sobre o Muse. </li><li> Prepare um mapa da placa das amostras e as condições para a placa ELISpot. Preparar a placa de ELISpot de acordo com o protocolo do fabricante e pipeta de 100 uL de meio, o péptido (10 ug / ml), ou péptido (10 ug / ml) a cada poço precipitação. </li><li> Pipete 100 pi da suspensão de células, proporcionando 1,0 x 10 6 células para cada poço da placa e incubar a 37 ° C durante a noite. </li><li> Seguir o protocolo do fabricante para o ensaio ELISPOT. Analisar a placa ELISpot desenvolvido utilizando um microscópio de dissecação. </li><li> Quantificar os resultados por meio da contagem do número de manchas coloridas corresng para cada substância, em cada poço. As manchas correspondendo ao número de células formadoras de mancha (SFC) em cada poço. </li></ol> 6. Imuno-histoquímica (IHQ) e Hematoxilina &amp; Eosina (H &amp; E) Coloração <ol><li> Aqui o tecido do tumor da bexiga conservados, tal como descrito acima (secção 2.4.11), incorporar em parafina e secção passo de 4 mm para análise imuno-histoquímica. </li><li> Realizar IHC utilizando um anticorpo que reconhece a proteína MUC1 região de MUC1 de repetições em cadeia. Usar o animal Kit peroxidase Investigação para minimizar a reactividade do anticorpo secundário rato com imunoglobulina endógena presente no tecido. </li><li> Realizar coloração H &amp; E, utilizando protocolos padrão. </li></ol> 7. Métodos Estatísticos Para o Multiplex Fluorimétrica Imunoensaio Microbead, use o teste t de Student bicaudal para comparar a média de concentrações séricas de citocinas entre os grupos de tratamento e controle observado. Para ELISpot, usar um único way ANOVA para comparar o local formando colônias entre o controle da mídia, mexidos peptídeo e grupos de peptídeos. Use teste de comparações múltiplas de Dunnett para diminuir a probabilidade de um resultado falso-positivo. Um valor de p ≤ 0,05 é considerado significativamente diferente de todas as análises.

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	<li>Siegel, R., Naishadham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).</li><li>Lynch, C. F., Davila, J. A., Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+23.+Cancer+of+the+urinary+bladder.">Chapter 23. Cancer of the urinary bladder.</a> SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. , 07-6215 (2007).</li><li>Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+cancer+in+2010:+how+far+have+we+come.">Bladder cancer in 2010: how far have we come.</a> CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).</li><li>Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+cancer:+a+review+of+non-muscle+invasive+disease.">Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease.</a> Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).</li><li>Bohle, A., Jocham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravesical+bacillus+Calmette-Guerin+versus+mitomycin+C+for+superficial+bladder+cancer:+a+formal+meta-analysis+of+comparative+studies+on+recurrence+and+toxicity.">Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity.</a> J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).</li><li>Shokeir, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Squamous+cell+carcinoma+of+the+bladder:+pathology,+diagnosis+and+treatment.">Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment.</a> BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).</li><li>Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+human+tumour+immunology+and+immunotherapy.">Progress in human tumour immunology and immunotherapy.</a> Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).</li><li>Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Final+results+from+a+national+multicenter+phase+II+trial+of+combination+bacillus+Calmette-Guerin+plus+interferon+alpha-2B+for+reducing+recurrence+of+superficial+bladder+cancer.">Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer.</a> Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).</li><li>Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+MUC1,+MUC2,+and+MUC5AC+in+carcinomas+of+various+sites:+an+immunohistochemical+study.">Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study.</a> Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).</li><li>Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins+in+cancer:+protection+and+control+of+the+cell+surface.">Mucins in cancer: protection and control of the cell surface.</a> Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).</li><li>Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1+mucin+in+urological+malignancy.">MUC1 mucin in urological malignancy.</a> BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).</li><li>Devine, P. L., McKenzie, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins:+structure,+function,+and+association+with+malignancy.">Mucins: structure, function, and association with malignancy.</a> Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).</li><li>Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-lymphocytes+derived+from+patients+with+breast+adenocarcinomas+recognize+an+epitope+present+on+the+protein+core+of+a+mucin+molecule+preferentially+expressed+by+malignant+cells.">Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells.</a> Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).</li><li>Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+MUC1+on+myeloma+cells+and+induction+of+HLA-unrestricted+CTL+against+MUC1+from+a+multiple+myeloma+patient.">Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient.</a> J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).</li><li>Choi, C., Witzens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+functional+CD8+memory+T+cells+specific+for+MUC1+in+bone+marrow+of+patients+with+multiple+myeloma.">Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma.</a> Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).</li><li>Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific,+major+histocompatibility+complex-+unrestricted+recognition+of+tumor-associated+mucins+by+human+cytotoxic+T-cells.">Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).</li><li>Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-cells+from+ovarian+malignant+tumors+can+recognize+polymorphic+epithelial+mucin+core+peptides.">Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides.</a> J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).</li><li>Tang, C. K., Katsara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+used+for+MUC1+immunotherapy:+human+clinical+studies.">Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies.</a> Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).</li><li>Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+eradicate+tumors+when+adoptively+transferred+in+vivo.">MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo.</a> Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).</li><li>Acres, B., Limacher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1+as+a+target+antigen+for+cancer+immunotherapy.">MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy.</a> Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).</li><li>Butts, C., Murray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+phase+IIB+trial+of+BLP25+liposome+vaccine+in+stage+IIIB+and+IV+non-small-cell+lung+cancer.">Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer.</a> J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).</li><li>Butts, C., Maksymiuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updated+survival+analysis+in+patients+with+stage+IIIB+or+IV+non-small-cell+lung+cancer+receiving+BLP25+liposome+vaccine+(L-BLP25),+phase+IIB+randomized,+multicenter,+open-label+trial.">Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial.</a> J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).</li><li>Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+of+primary+human+CD4++and+CD8++T+cell+responses+against+cancer-associated+MUC1+peptide+epitopes.">Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes.</a> Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).</li><li>Palmer, M., Parker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+the+BLP25+(MUC1+peptide)+liposomal+vaccine+for+active+specific+immunotherapy+in+stage+IIIB/IV+non-small-cell+lung+cancer.">Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer.</a> Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).</li><li>Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin+expression+by+transitional+cell+carcinomas+of+the+bladder.">Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder.</a> Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).</li><li>Murray, A., Simms, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+rhenium-188-C595+antibody+for+radioimmunotherapy+of+transitional+cell+bladder+cancer.">Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer.</a> J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).</li><li>Hughes, O., Bishop, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+superficial+bladder+cancer+by+the+intravesical+administration+of+67copper-labelled+anti-MUC1+mucin+monoclonal+antibody+C595.">Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595.</a> J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).</li><li>Conn, I. G., Crocker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMFG-2+as+a+prognostic+indicator+in+superficial+bladder+cancer.">HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer.</a> J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).</li><li>Hughes, O., Denley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1+mucin+expression+in+transitional+cell+carcinoma+of+the+bladder:+a+target+for+diagnosis+and+therapy+with+monoclonal+antibody+C595.">MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595.</a> J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).</li><li>Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+immunity+to+MUC1+in+a+human+MUC1+transgenic+murine+model.">Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model.</a> Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).</li><li>Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin-1+specific+immunotherapy+in+a+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer.">Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer.</a> J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).</li><li>McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+total+dose+and+dose+schedule+on+induction+of+urinary+bladder+cancer+in+the+mouse+by+N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine.">Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine.</a> Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).</li><li>Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+effects+of+L-BLP25+antigen-specific+tumor+immunotherapy+in+a+novel+human+MUC1+transgenic+lung+cancer+mouse+model.">Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model.</a> J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).</li><li>Kunze, E., Schauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+transformation+in+the+development+of+N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced+transitional+cell+carcinomas+in+the+urinary+bladder+of+rats.">Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats.</a> Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).</li><li>Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+human+bladder+carcinogenesis.">Experimental models of human bladder carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).</li><li>Samma, S., Uemura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+of+carcinoma+in+situ+in+dog+urinary+bladder+by+sequential+treatment+with+N-methyl-N'-nitrosourea+and+N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine.">Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine.</a> Gann. 75 (5), 385-387 (1984).</li><li>Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+urinary+bladder+urothelial+cancers+in+the+rabbit+by+dibutylnitrosamine+with+an+artificial+bladder+calculus+as+cocarcinogen.">Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen.</a> Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).</li><li>Irving, C. C., Tice, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced+urinary+bladder+cancer+in+rats+by+administration+of+disulfiram+in+the+diet.">Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet.</a> Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).</li><li>Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-BLP25+vaccine+plus+letrozole+induces+a+TH1+immune+response+and+has+additive+antitumor+activity+in+MUC1-expresssing+mammary+tumors+in+mice.">L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice.</a> Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).</li></ol>

DPV, GTW, SMG, CJK, AMG, e GKH declaram que não há interesses conflitantes. MWD é o investigador principal de um subsídio recebido da Merck KGaA, e MW é um funcionário da Merck KGaA.

A indução bem-sucedida de carcinoma de células transicionais da bexiga e escamosas invasivo em ratos MUC1.Tg humanos oferece um modelo pré-clínico para o desenvolvimento de imunoterapia. Estudos imunoteraptico requerem o uso de um modelo espontâneo intacto, imune a fim de avaliar a resposta inflamatória a progressão do tumor ao longo do tempo, bem como a resposta imunitária a imunoterapia. Em um modelo de desenvolvimento de tumores espontâneos, o microambiente do tumor permanece intacta e os tumores se desenvo...

O câncer de bexiga é o quarto tipo mais comum de câncer ea oitava causa de morte por câncer em homens americanos. Nos Estados Unidos, estima-se 72.500 novos casos e 15.000 mortes por câncer de bexiga são esperados entre homens e mulheres juntos em 2013 1. A incidência de câncer de bexiga é aproximadamente três vezes maior nos homens em relação às mulheres. Nos Estados Unidos, os carcinomas de células transicionais (TCC) são responsáveis ​​por mais de 90% dos casos, enquanto os carcinomas espinocelular (CEC) têm uma incidência de menos de 2% 2. A taxa de sobrevida em 5 anos relativo global para papilar TCC é de 91,5% em comparação com apenas 30,9% para o SCC 2. Embora TTCs papilares não invasivos representam aproximadamente 75% dos casos no momento do diagnóstico, mesmo com o tratamento de mais de 50% dos pacientes experimentam a recorrência dentro de 5 anos, com um máximo de 30% destes pacientes a progredir para doença invasiva do músculo 3,4 . Regimes de tratamento típicas para inv não-músculodoença ASIVE incluem a ressecção transuretral (TUR), seguido de quimioterapia intravesical. Em pacientes com Ta de alto grau ou tumores T1, um TUR repetição pode ser realizada antes da quimioterapia 3,4. Para os pacientes com recidiva Ta de baixo grau ou de alto grau de Ta ou lesões T1, TUR seguido por quimioterapia adjuvante, imunoterapia ou na forma de Bacilo Calmette-Guerin (BCG), podem ser utilizados 3,4. Intravesical BCG tem sido mostrado para ser superior ao intravesical mitomicina C no que diz respeito ao tempo de recorrência 5. Para doença invasiva muscular T2, cistectomia radical com ou sem quimioterapia neoadjuvante é o curso de tratamento recomendado 3. Em pacientes com SCC, cistectomia radical parece ser o tratamento mais eficaz 6. Dadas as altas taxas de reincidência, apesar dos melhores tratamentos disponíveis, existe claramente uma necessidade de terapias novas e mais eficazes para o câncer de bexiga. Ampliação de novos immunotherapies para bladdcâncer er é uma abordagem possível, que podem ser uma esperança para prolongar a sobrevivência livre de doença. Historicamente, a BCG tem sido a única imunoterapia para o câncer de bexiga. O seu mecanismo de acção está pensado para envolver a indução não específica de uma resposta imunitária de tipo T helper 1 (Th1), através de aumento dos níveis de interleucina-2 (IL-2) e interferão gama (IFN-γ) 4. Celular, ou a imunidade de Th1, é crítico na imunoterapia do cancro como humoral, ou Th2, a imunidade nunca foi demonstrado ser eficaz contra tumores sólidos, com excepção de anticorpos dirigidos contra os receptores do factor de crescimento de 7. Na tentativa de melhorar os benefícios da BCG monoterapia, IFN-α 2B/BCG combinação de imunoterapia foi avaliada em um ensaio clínico de fase II com resultados inconclusivos 8. Uma abordagem alternativa para a imunoterapia para o câncer de bexiga pode ser alvo antígenos associados a tumores (TAAs), a identificação de que fez imunoterapia do cancro mais específico 7 </sup&gt;. Um tal AT é a mucina 1 (MUC1), que é uma glicoproteína de superfície celular, em muitos cancros superexpresso de células epiteliais, tais como de bexiga, mama, pulmão, e cancro do pâncreas 9,10. A expressão e modificação da proteína MUC1 também é substancialmente alterada durante a carcinogénese, de tal forma que expõe underglycosylation sequências antigénicas de aminoácidos conhecidas como número variável de repetições em tandem (VNTR) no núcleo do péptido. Enquanto MUC1 é um auto-molécula, essas regiões imunodominantes VNTR não são normalmente expostos devido a uma extensa glicosilação e, assim, eles são vistos pelo sistema imune como 11,12 estrangeira. Os linfócitos T citotóxicos (CTLs) que reconhecem especificamente MUC1 epitopos tenham sido isolados a partir dos nódulos linfáticos drenantes tumores de pacientes de cancro da mama 13, bem como do sangue e da medula óssea de doentes com mieloma 14,15, tornando MUC1 um alvo potencial para um resposta imune celular. Os VNTRs imunodominantes da underglycosylateforma d de MUC1 são reconhecidas pelas CTLs, resultando na destruição de células tumorais 16-19. As respostas imunes celulares e / ou humorais nativas para MUC1 cancerosas são, no entanto, não é suficientemente forte para eliminar tumores. Para aumentar a resposta imune fraca já existente para MUC1, os péptidos imunodominantes sintéticos podem ser introduzidas através de vacinação para gerar uma resposta de CTL forte o suficiente para ser de benefício clínico 18,20. Uma vacina lipossomal MUC1 já foi mostrada para aumentar a sobrevivência em pacientes com cancro do pulmão 21,22, gerar CTL capazes de matar as células do tumor MUC-1-positivos, e produzir uma resposta de citocinas tipo Th1 polarizadas 23,24. Com um nível elevado de expressão de MUC-1 9,11,25, cancro da bexiga é um candidato lógico para testar a MUC1 dirigida imunoterapia 26,27. Além disso, a MUC1 tem potencial como fator prognóstico no câncer de bexiga 28, MUC1 expressão em TCC está significativamente associado com o estágio e grau, e metastático TCCFoi demonstrado que continuam a expressar MUC1 29. A fim de avaliar o potencial utilidade da imunoterapia MUC1 dirigida no cancro da bexiga, foi desenvolvido um MUC-1 humano intacto imune (hMUC1)-expressando Congênicos transgénico modelo de cancro da bexiga de rato (MUC1.Tg) no C57BL / 6 do fundo 30. MUC-1 humana expressa-se como uma auto-proteína sob o controlo do seu próprio promotor, resultando num padrão de expressão do tecido consistente com a observada em humanos 30,31. Os ratinhos foram induzidos com a bexiga cancerígeno conhecido N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN), 32, e, em seguida, os tumores resultantes foram avaliados quanto à expressão hMUC1 e tipo de tumor e grau. Para avaliar o efeito do agente cancerígeno sobre os níveis de citocinas Th1/Th2, durante o desenvolvimento do tumor, amostras de soro foram recolhidas periodicamente para análise multiplex. Os ratinhos foram, em seguida, tratou-se com uma vacina de péptido MUC1-alvo, e a citoquina de soro e as respostas imunes foram avated por multiplex fluorometric imunoensaio microbead e ELISpot.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN)</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>B0938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G Gavage Needles</td>
			<td>Popper &#38; Sons, Inc.</td>
			<td>7921</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide Vaccine</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>investigational agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainers</td>
			<td>BD</td>
			<td>365957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cassettes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M490-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>87787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokine 20plex Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LMC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Microsphere Beads</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>MC100xx-01</td>
			<td>xx is the bead region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TNF- Capture Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>551225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TNF- Detection Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>554415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IFN- Capture Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IFN- Detection Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab83136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Buffer</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>L-MAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokine Standard</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MXM8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-screen HTS 96well filter plates</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSBVN1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-PE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 m Nylon Tissue Sieves</td>
			<td>BD</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splenocyte Separation Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-829E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF- /IL-4 ELISpot plates</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ELD5217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>2900-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-actin monoclonal antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>W401B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>SC-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>162-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean TGX Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>456-1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Count &#38; Viability Kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MCH100104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC1 Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550486</td>
			<td>IHC antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Research Peroxidase Kit</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K3954</td>
			<td>IHC staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore plate vaccum apparatus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Lx200</td>
			<td>Millipore / Luminex</td>
			<td>40-013</td>
			<td>Manufactured by Luminex, distributed by Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Xponent Software</td>
			<td>Millipore / Luminex</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 3.1; included with Luminex Lx200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milliple Analyst Software</td>
			<td>Milliplex / VigeneTech</td>
			<td>40-086</td>
			<td>Version 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Software</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 1.1.0.0; included with Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Unitron</td>
			<td>Z730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism Software</td>
			<td>Graphpad Software Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans Blot SD Cell and PowerPac</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-3849</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of invasive transitional cell bladder carcinoma in immune intact human muc1 transgenic mice:  a model for immunotherapy development

A modelo pré-clínico de câncer de bexiga invasivo foi desenvolvido em mucina humana 1 (MUC1) camundongos transgênicos (MUC1.Tg) com a finalidade de avaliar a imunoterapia e / ou quimioterapia citotóxica. Para induzir o cancro da bexiga, C57BL / 6 (tipo selvagem e MUC1.Tg) foram tratados oralmente com o agente cancerígeno de N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN) a 3,0 mg / dia, 5 dias / semana durante 12 semanas. Para avaliar os efeitos de OH-BBN no perfil de citocinas no soro durante o desenvolvimento do tumor, sangue foi coletado por meio de hemorragias submandibular antes do tratamento ea cada quatro semanas. Além disso, uma vacina de péptido MUC1-alvo e um placebo foram administrados a grupos de ratinhos por semana durante oito semanas. Multiplex fluorométricos immunoanalyses microbead de citocinas no soro durante o desenvolvimento do tumor e após a vacinação foram realizadas. No término, o interferão gama (IFN-γ) / interleucina-4 (IL-4) análise ELISpot para MUC1 resposta imunitária das células T específicas e as avaliações histológicas do tipo de tumore grau foram realizados. Os resultados mostraram que: (1) a incidência de câncer de bexiga em ratos tipo tanto MUC1.Tg e selvagem foi de 67%, (2) carcinomas de células transicionais (TCC) desenvolvidos na proporção de 2:1 em relação ao carcinoma de células escamosas (SCC) , (3) as citocinas inflamatórias aumentou com o tempo, durante o desenvolvimento do tumor, e (4) a administração do péptido de vacina induz um perfil de citocinas Th1 soro polarizado e uma resposta de células T específica MUC1. Todos os tumores em MUC1.Tg camundongos foram positivos para MUC1 expressão, e metade de todos os tumores em camundongos tipo MUC1.Tg e selvagens foram invasivo. Em conclusão, utilizando uma abordagem de equipe, através da coordenação dos esforços dos farmacologistas, imunologistas, patologistas e biólogos moleculares, desenvolvemos um modelo de camundongo transgênico imune intacto de câncer de bexiga que expressa hMUC1.

A avaliação pré-clínica dos efeitos de novas imunoterapias e combinações no cancro da bexiga, exige o desenvolvimento de um modelo animal adequado. Em nosso modelo de camundongo transgênico, a indução com o carcinógeno químico OH-BBN resultou em uma alta taxa de incidência de câncer de bexiga predominantemente TCC com algum SCC, que é semelhante ao câncer de bexiga em humanos. Para determinar a histologia do tumor, estado de MUC1 expressão e a resposta imunitária ao tratamento com a vacina peptídica, M...

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Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Um N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina induzida pelo modelo de cancro da bexiga foi desenvolvido em mucina humana 1 (MUC1) ratinhos transgénicos para o fim de testar a MUC1-imunoterapia dirigida. Após a administração de uma vacina de péptido MUC1-alvo, uma resposta de linfócitos T citotóxicos para MUC1 foi confirmada por medição dos níveis de citocinas no soro e da actividade específica da célula T.

Indução de carcinoma da bexiga invasivo de células transicionais em imunológico intacto Humanos MUC1 Ratos transgênicos: um modelo de desenvolvimento Imunoterapia

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

induction-invasive-transitional-cell-bladder-carcinoma-immune-intact

Research

JoVE Journal

Medicine

21.1K visualizações.  University of California, Davis. Um N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina induzida pelo modelo de cancro da bexiga foi desenvolvido em mucina humana 1 (MUC1) ratinhos transgénicos para o fim de testar a MUC1-imunoterapia dirigida. Após a administração de uma vacina de péptido MUC1-alvo, uma resposta de linfócitos T citotóxicos para MUC1 foi confirmada por medição dos níveis de citocinas no soro e da actividade específica da célula T.

Vídeo: Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Medicina

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body temperature that is observed during fever. The use of hyperthermia as an adjuvant has emerged as a promising procedure for tumor regression in the field of cancer biology. For this purpose, the most important requirement is to have reliable and uniform heating protocols. We have developed a protocol for hyperthermia (whole body) in mice. In this protocol, animals are exposed to cycles of hyperthermia for 90 min followed by a rest period of 15 min. During this period mice have easy access to food and water. High body temperature spikes in the mice during first few hyperthermia exposure cycles are prevented by immobilizing the animal. Additionally, normal saline is administered in first few cycles to minimize the effects of dehydration. This protocol can simulate fever like conditions in mice up to 12-24 hr. We have used 8-12 weeks old BALB/Cj female mice to demonstrate the protocol.

This paper describes a protocol for whole body hyperthermia in mice that can stimulate fever like conditions up to 12-24 hr.

Protocolo para Longa Duração Hipertermia corpo inteiro em Ratos

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

O Uso de cistometria em pequenos roedores: Um Estudo de Chemosensation Bexiga

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

Geração de subcutânea e intra-hepática Humanos carcinoma hepatocelular Xenoenxertos em Immunodeficient Ratos

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized by increased urgency and frequency of urination, as well as nocturia and general pelvic pain, especially upon bladder filling or voiding. Despite years of research, the cause of IC/BPS remains elusive and treatment strategies are unable to provide complete relief to patients. In order to study nervous system contributions to the condition, many animal models have been developed to mimic the pain and symptoms associated with IC/BPS. One such murine model is urinary bladder distension (UBD). In this model, compressed air of a specific pressure is delivered to the bladder of a lightly anesthetized animal over a set period of time. Throughout the procedure, wires in the superior oblique abdominal muscles record electrical activity from the muscle. This activity is known as the visceromotor response (VMR) and is a reliable and reproducible measure of nociception. Here, we describe the steps necessary to perform this technique in mice including surgical manipulations, physiological recording, and data analysis. With the use of this model, the coordination between primary sensory neurons, spinal cord secondary afferents, and higher central nervous system areas involved in bladder pain can be unraveled. This basic science knowledge can then be clinically translated to treat patients suffering from IC/BPS.

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized in part by pelvic pain. In order to study nervous system contributions to the condition, a physiological model of urinary bladder pain is used in mice and rats.

Respostas Bexiga Distensão Evocado Visceromotor como um modelo para Bexiga dor em camundongos

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and either cut or crush it to induce peripheral nerve injury. Advantages of this surgery are its simplicity, high reproducibility, and the lack of effect on vital functions or mobility from the subsequent facial paralysis, thus resulting in a relatively mild surgical outcome compared to other nerve injury models. A major advantage of using a cranial nerve injury model is that the motoneurons reside in a relatively homogenous population in the facial motor nucleus in the pons, simplifying the study of the motoneuron cell bodies. Because of the symmetrical nature of facial nerve innervation and the lack of crosstalk between the facial motor nuclei, the operation can be performed unilaterally with the unaxotomized side serving as a paired internal control. A variety of analyses can be performed postoperatively to assess the physiologic response, details of which are beyond the scope of this article. For example, recovery of muscle function can serve as a behavioral marker for reinnervation, or the motoneurons can be quantified to measure cell survival. Additionally, the motoneurons can be accurately captured using laser microdissection for molecular analysis. Because the facial nerve axotomy is minimally invasive and well tolerated, it can be utilized on a wide variety of genetically modified mice. Also, this surgery model can be used to analyze the effectiveness of peripheral nerve injury treatments. Facial nerve injury provides a means for investigating not only motoneurons, but also the responses of the central and peripheral glial microenvironment, immune system, and target musculature. The facial nerve injury model is a widely accepted peripheral nerve injury model that serves as a powerful tool for studying nerve injury and regeneration.

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Axotomia do nervo facial em ratos: um modelo para estudo de resposta motoneuron para Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Indução de Aterosclerose Acelerada em Camundongos: O Modelo de "Lesão por Fio"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure overload-induced left ventricular hypertrophy (LVH) and its progression to heart failure. In the majority of the reported investigations, this procedure is performed with intubation and ventilation of the animal which renders it demanding and time-consuming and adds to the surgical burden to the animal. The aim of this protocol is to describe a simplified technique of minimally invasive TAC without intubation and ventilation of mice. Critical steps of the technique are emphasized in order to achieve low mortality and high efficiency in inducing LVH.
Male C57BL/6 mice (10-week-old, 25-30 g, n=60) were anesthetized with a single intraperitoneal injection of a mixture of ketamine and xylazine. In a spontaneously breathing animal following a 3-4 mm upper partial sternotomy, a segment of 6/0 silk suture threaded through the eye of a ligation aid was passed under the aortic arch and tied over a blunted 27-gauge needle. Sham-operated animals underwent the same surgical preparation but without aortic constriction. The efficacy of the procedure in inducing LVH is attested by a significant increase in the heart/body weight ratio. This ratio is obtained at days 3, 7, 14 and 28 after surgery (n = 6 - 10 in each group and each time point). Using our technique, LVH is observed in TAC compared to sham animals from day 7 through day 28. Operative and late (over 28 days) mortalities are both very low at 1.7%.
In conclusion, our cost-effective technique of minimally invasive TAC in mice carries very low operative and post-operative mortalities and is highly efficient in inducing LVH. It simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal. It can be easily performed by following the critical steps described in this protocol.

The aim of this protocol is to describe step-by-step the technique of minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) in mice. By elimination of intubation and ventilation which are mandatory for the commonly used standard procedure, minimally invasive TAC simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal.

Técnica de constrição da aorta minimamente invasiva transversal em camundongos para indução de Hipertrofia Ventricular Esquerda

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an increased use of mouse models in orthopedic research was noted, most probably because mouse models offer a large number of genetically-modified strains and special antibodies for the analysis of molecular mechanisms of fracture healing. To control the biomechanical conditions, well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory, also in mice. Here, we report on the design and use of a closed bone healing model to stabilize femur fractures in mice. The intramedullary screw, made of medical-grade stainless steel, provides through fracture compression an axial and rotational stability compared to the mostly used simple intramedullary pins, which show a complete lack of axial and rotational stability. The stability achieved by the intramedullary screw allows the analysis of endochondral healing. A large amount of callus tissue, received after stabilization with the screw, offers ideal conditions to harvest tissue for biochemical and molecular analyses. A further advantage of the use of the screw is the fact that the screw can be inserted into the femur with a minimally invasive technique without inducing damage to the soft tissue. In conclusion, the screw is a unique implant that can ideally be used in closed fracture healing models offering standardized biomechanical conditions.

This protocol describes a minimally invasive osteosynthesis technique using an intramedullary screw for standardized stabilization of femur fractures, which can be used to analyze endochondral bone healing in mice.

Um modelo minimamente invasivo para analisar a fratura endocondral cura em ratos sob condições biomecânicas padronizadas

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...