Les auteurs tiennent à remercier le Programme de biologie Davis souris UC pour la reproduction des souris. Cette recherche a été financée par une subvention de Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne.

Toutes les études et les expérimentations animales ont été effectuées en vertu d&#39;un protocole approuvé par l&#39;Université de Californie, Davis Institutional Animal Care et utiliser Comité consultatif administratif. 1. MUC1.Tg élevage de souris et propagation <ol><li> Le Programme Davis Biologie souris UC (MBP) races type sauvage C57BL / 6 mâles avec hétérozygote MUC1.Tg C57BL / 6 femelles pour établir notre colonie de reproduction. Progéniture MUC1.Tg sont livrés à des études selon les besoins. </li><li> Personnel MBP coupent les doigts de la progéniture dans un modèle défini (0-99) pour l&#39;identification de la souris, et quand pince applicable la queue. L&#39;orteil ou d&#39;un tissu de queue sont traitées pour le génotypage utilisant l&#39;extraction d&#39;ADN standard et Polymerase Chain Reaction (PCR) de l&#39;analyse. </li></ol> 2. Conception de l&#39;étude <ol><li> Étudier les affectations de groupe <ol><li> Peser chaque souris séparément sur une balance et enregistrer le poids en grammes pour chaque souris. </li><li> Cette partie de la procédure invOlvés la méthodologie et la conception de l&#39;étude. Pour la première partie de l&#39;étude, céder souris appariés selon l&#39;âge et MUC1.Tg type sauvage pour commencer l&#39;induction du cancer de la vessie avec OH-BBN. Euthanasier les souris 8 semaines après la dernière dose OH-BBN pour confirmer la présence de tumeurs de la vessie par l&#39;histologie. </li><li> Pour la deuxième partie de l&#39;étude, aléatoire souris MUC1.Tg hommes dans le nombre approprié de traitement et les groupes témoins. Ces souris seront surveillés pour des cytokines sériques et les réponses immunitaires des lymphocytes T pendant l&#39;induction et le développement des tumeurs, puis à la fin de l&#39;étude de 8 semaines après la dernière dose OH-BBN. </li></ol></li><li> l&#39;induction du cancer de la vessie <ol><li> OH-BBN est un agent cancérigène et très toxique. S&#39;il vous plaît lire et suivre les directives de la fiche de données de sécurité des matériaux lors de la manipulation et le stockage de ce produit chimique. </li><li> Calculer la concentration de la solution de dosage nécessaire pour délivrer la dose appropriée (3 mg), dans un volume de 100 pi, à chaque souris sur la base des poids moyens et number de souris dans chaque étude et de groupe. </li><li> Diluer le OH-BBN dans l&#39;éthanol à 100%. Amener la concentration finale de 30 mg / ml avec de l&#39;eau stérile. L&#39;éthanol final: concentration d&#39;eau doit être 20:80, v / v </li><li> Administrer le OH-BBN par voie orale avec de l&#39;acier inoxydable, 20 g aiguilles gavage jour, 5 jours / semaine pendant 12 semaines, en fonction de l&#39;affectation du groupe de traitement à partir de l&#39;âge de 8 semaines. </li></ol></li><li> Traitements de vaccination <ol><li> Reconstituer chaque flacon de vaccin peptidique lyophilisée dans 600 ul de 0,9% de solution saline stérile et complètement remettre en suspension en aspirant la solution à travers un 0,5 pouces 27 G aiguille 6x. En utilisant une solution saline, ajuster la concentration de sorte que la dose souhaitée est livré dans un volume de 100 pi. </li><li> À partir de la semaine 20, après la dernière dose de OH-BBN, administrer le vaccin sur une base hebdomadaire pour un cycle de huit semaines par injection sous-cutanée de 100 pi avec une aiguille de calibre 25 (numéro de la semaine correspond à l&#39;âge des souris). </li></ol></li><li> Surveillance et la collecte de l&#39;échantillon <ol><li> Peser toutes les souris et palper pour détecter la présence de nouvelles tumeurs une fois par semaine. Euthanasier les souris qui ont perdu ≥ 20% du poids du corps ou s&#39;il ya des tumeurs palpables, du sang dans l&#39;urine et / ou de rétention urinaire. </li><li> Avant la première dose OH-BBN, puis à intervalles de 4 semaines par la suite, de recueillir le sang entier via saigne sous-maxillaires. Recueillir le sang dans des tubes de coagulation du sérum (BD Microtainer), et permettre à 30 min pour le sang à coaguler. </li><li> Centrifuger les échantillons de sang dans une micro à 3500 g pendant 10 min. Soigneusement transférer le sérum à visser cryotubes de chapeau à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> Gel rapide dans l&#39;azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à l&#39;analyse par multiplex. </li><li> Huit semaines après la dernière dose de OH-BBN, euthanasier toutes les souris par asphyxie au CO2. </li><li> Placez chaque souris sur une planche de dissection et épingler par les quatre membres. </li><li> En utilisant des pinces et ciseaux, MAke Une incision horizontale dans la région supérieure de l&#39;abdomen. Insérer les ciseaux dans l&#39;incision entre la couche épidermique et la paroi abdominale et à séparer la peau en douceur du tissu sous-jacent à l&#39;aide d&#39;une pince. </li><li> Faire une incision verticale de l&#39;incision horizontale suivant l&#39;axe central en direction de l&#39;extrémité antérieure de la souris. Séparer la peau de la cage thoracique, et en utilisant une seringue de 1 ml et une aiguille 22 G, percer le cœur et recueillir le sang avec un tirage lisse et régulière. </li><li> Reportez-vous à l&#39;étape 2.4.3 et 2.4.4 pour l&#39;isolement et le stockage du sérum. </li><li> En utilisant des pinces et ciseaux, couper et peler le reste de la couche épidermique. Couper à travers la paroi abdominale et du péritoine et de supprimer de façon aseptique tumeur de la vessie pour l&#39;immunohistochimie (IHC) et Western blot. </li><li> Recueillir rate pour l&#39;analyse de la viabilité cellulaire (Muse) et ELISpot. Pour IHC, lieu vessie échantillon de la tumeur dans la cassette de tissu et le fixer dans la nuit du formol réfrigérées à la température ambiante. </li&gt; <li> Le lendemain, remplacer le formol à 70% d&#39;éthanol. </li><li> Pour l&#39;analyse par Western blot de tumeur, d&#39;homogénéiser la tumeur, ajouter un tampon d&#39;extraction de protéines ainsi que des inhibiteurs de protéase d&#39;arrêter et de transférer à 1,5 microtubes ml. </li><li> Vortex pendant 30-60 secondes et maintenez sur la glace pendant 5 min. Un gel rapide dans l&#39;azote liquide et de dégel dans l&#39;eau ambiante. Répétez le processus de vortex, la congélation et la décongélation deux fois. </li><li> Centrifuger les échantillons à 10000 g pendant 10 min à 4 ° C et de transférer les extraits cellulaires de nouveaux tubes marqués. </li><li> Quantifier la concentration en effectuant un test de protéine acide Bicinchoninic (BCA) pour les mesures de protéines. Conserver les échantillons à -80 ° C jusqu&#39;au moment de l&#39;analyse par Western blot. </li></ol></li></ol> 3. Biologie Moléculaire / Western Les procédures suivantes ont été effectuées pour vérifier l&#39;expression de MUC1 dans les souris vessie tissu tumoral en utilisant le protocole standard de Western Blot (données montrent pasn). <ol><li> Séparez les extraits de protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE), puis les transférer sur une membrane PVDF en utilisant un appareil semi-aride. </li><li> Bloquer la membrane des protéines transférées avec 5% de lait écrémé dans 0,1% Tween-20 dans un tampon phosphate salin (PBS-T) pH 7,4 pendant 1 heure sur un agitateur orbital à température ambiante. </li><li> Incuber la membrane pendant 1 heure à température ambiante sur un agitateur avec l&#39;anticorps anti-MUC1 ou anti-β-actine dans 0,1% PBS-T. </li><li> Laver la membrane par décantation de la solution et en ajoutant 0,1% de PBS-T. Swirl la membrane sur l&#39;agitateur pendant 5 min et décanter. Répétez cette étape deux fois. </li><li> Incuber la membrane pendant 1 heure à température ambiante avec une peroxydase de raifort (HRP) anticorps secondaire conjugué. </li><li> Laver 3x (voir l&#39;étape 3.4). </li><li> Suivre le protocole de la chimiluminescence kit amélioré (ECL) pour activer et lire le fluorographie. </li></ol> 4. Multiplex Fluorometric immuno-Microbead &lt;ol&gt; <li> Configuration et calculs <ol><li> En utilisant une carte de plaque de 96 puits, d&#39;attribuer des blancs, des normes, des contrôles et inconnus dans les puits. Calculez le nombre et le volume des analytes, anticorps de capture et streptavidine-phycoérythrine (SA-PE) nécessaire pour le dosage. </li><li> Permettre à tous les tampons et les diluants revenir à température ambiante. Préparer les normes et les dilutions des échantillons à l&#39;aide d&#39;une plaque de 96 puits vide. </li><li> Reconstituer la matrice de sérum et de standard lyophilisé selon le protocole du fabricant et faire 1:05 dilutions en série de la norme avec le diluant approprié dans la plaque de 96 puits. Pour les puits vierges, utilisez le diluant approprié. </li><li> Diluer tous les contrôles et les échantillons inconnus 1:2 dans le diluant approprié dans le reste de la plaque de 96 puits. </li><li> Pour le mélange de billes, une pipette le volume requis du diluant approprié dans un tube de 15 ml. Vortex chaque flacon de billes pendant 20 secondes et la pipette de volume requis de chaque analyte dans le tube de 15 ml. </li&gt; <li> Toujours protéger les perles de la lumière pour éviter photoblanchiment. Ne pas placer la plaque de 96 puits sur du papier absorbant pour éviter la perte de l&#39;échantillon par capillarité. </li></ol></li><li> Protocole de test <ol><li> Pré-imbibé de la plaque de 96 puits à fond filtrant avec 200 pi de tampon de dosage et de permettre au trempage complet du filtre. Égoutter délicatement à l&#39;aide de l&#39;appareil à vide plaque de 96 puits et de sécher le fond de la plaque avec une serviette en papier. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, pipette 25 ul de matrice de sérum dans les puits assignés pour les blancs et les normes et pipette 25 ul de tampon de dosage dans les puits attribués aux contrôles et inconnus. </li><li> Pipette 25 ul de la vierge, les normes, les contrôles et inconnus dans les puits assignés respectifs. Vortex le mélange de billes pendant 20 secondes et transférer les perles à un réservoir. </li><li> Pipette 25 ul du mélange de billes dans chaque puits. Couvrir la plaque avec une feuille d&#39;aluminium ou un couvercle de plaque opaque à l&#39;abri de la lumière. </li><li&gt; agiter la plaque à 500 rpm pendant deux heures à température ambiante sur un agitateur de plaque. Égoutter et laver la plaque avec 200 pi de 0,1% de Tween 20 dans un tampon phosphate salin (PBS-T) deux fois. Les égoutter et les éponger. </li><li> Préparer la solution d&#39;anticorps de capture. Pipeter la quantité requise de 0,1% du PBS-T et l&#39;anticorps de capture dans un tube de 15 ml et le vortex pendant 10 s. Transférer le mélange d&#39;anticorps de capture d&#39;un réservoir et d&#39;une pipette 25 ul dans chaque puits. </li><li> Agiter la plaque à 500 rpm pendant une heure à température ambiante sur un agitateur de plaque. Égoutter et laver la plaque avec 200 pi de 0,1% PBS-T deux fois. Les égoutter et les éponger. </li><li> Préparer la solution SA-PE. Introduire à la pipette le volume requis de 0,1% PBS-T et SA-PE dans un tube de 15 ml et vortex pendant 10 sec. Transférer la solution dans un réservoir et d&#39;une pipette 25 ul dans chaque puits. </li><li> Agiter la plaque à 500 rpm pendant 30 min à température ambiante sur un agitateur de plaque. Égoutter et laver la plaque avec 200 pi de 0,1% PBS-T deux fois. Égoutter et bBeaucoup sec. </li><li> Ajouter 100 ul de 0,1% PBS-T et secouer sur un plateau agitateur à 500 tours par minute pendant au moins deux minutes pour remettre en suspension les perles. Lire et analyser la plaque sur la machine Lx200 Luminex. </li></ol></li></ol> 5. IFN-γ/IL-4 ELISpot Préparation et analyse <ol><li> Dans une enceinte de sécurité biologique, traiter les rates à 100 um tissu nylon tamis dans 5 ml stérile tamponnée au phosphate salin (PBS) dans des boîtes de Petri stériles. Couche les splénocytes sur 3 ml de milieu de séparation des lymphocytes dans des tubes stériles de 15 ml. </li><li> Centrifuger les tubes à 600 xg pendant 15 minutes afin de séparer les lymphocytes à partir des globules rouges. Transférer les lymphocytes couches au-dessus du gradient de nouveaux tubes stériles de 15 ml. </li><li> Réglez le volume à 10 ml avec du PBS stérile. Centrifuger la suspension à 600 g pendant 10 min à pellets les cellules. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de PBS pour la viabilité cellulaire et compter avec la Museanalyseur. Suivez la Muse Count &amp; protocole du kit de viabilité. </li><li> Faire des dilutions en série des lymphocytes dans 1,5 ml vis des tubes à bouchon de centrifugeuses à des facteurs de dilution de 1:10, 1:20 et 1:40 (ou le cas échéant) au chef et réactif de viabilité (minimum volume total 300 pi). Introduire à la pipette chaque dilution de haut en bas plusieurs fois pour mélanger et analyser la Muse. </li><li> Préparer un plan de plaque des échantillons et les conditions de la plaque ELISpot. Préparer la plaque ELISpot selon le protocole du fabricant et pipette 100 pi de milieu, un peptide (10 pg / ml), ou d&#39;un peptide (10 pg / ml) dans chaque puits bousculade. </li><li> Ajouter 100 ul de la suspension cellulaire, délivrant 1,0 x 10 6 cellules dans chaque puits et incuber la plaque à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Suivre le protocole du fabricant pour le test ELISPOT. Analyser la plaque de ELISpot développé en utilisant un microscope à dissection. </li><li> Quantifier les résultats en comptant le nombre de taches colorées corresponding de chaque analyte dans chaque puits. Les spots correspondent au nombre de cellules de formation de tache (SFC) dans chaque puits. </li></ol> 6. Immunohistochimie (IHC) et hématoxyline &amp; éosine (H &amp; E) Coloration <ol><li> Prenez la vessie tissu tumoral conservé tel que décrit ci-dessus (2.4.11), intégrer dans la paraffine et la section étape à 4 um pour l&#39;analyse immunohistochimique. </li><li> Effectuer IHC utilisant un anticorps MUC1 qui reconnaît la région de répétition en tandem de MUC1. Utilisez le kit peroxydase de recherche sur les animaux afin de minimiser la réactivité de l&#39;anticorps secondaire de la souris avec de l&#39;immunoglobuline endogène présente dans le tissu. </li><li> Effectuer coloration H &amp; E en utilisant des protocoles standard. </li></ol> 7. Méthodes statistiques Pour le Multiplex Fluorometric immunologique de microbilles, utiliser le test t de Student bilatéral à comparer à la moyenne observée des concentrations de cytokines sériques entre le traitement et les groupes témoins. Pour ELISpot, utiliser un one-way ANOVA pour comparer la tache formant colonies entre le contrôle des médias, brouillés peptide et groupes peptidiques. Utilisez test de comparaison multiple de Dunnett pour réduire la probabilité d&#39;un résultat faussement positif. Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme significativement différente de toutes les analyses.

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin+expression+by+transitional+cell+carcinomas+of+the+bladder.">Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder.</a> Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).</li><li>Murray, A., Simms, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+rhenium-188-C595+antibody+for+radioimmunotherapy+of+transitional+cell+bladder+cancer.">Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer.</a> J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).</li><li>Hughes, O., Bishop, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+superficial+bladder+cancer+by+the+intravesical+administration+of+67copper-labelled+anti-MUC1+mucin+monoclonal+antibody+C595.">Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595.</a> J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).</li><li>Conn, I. G., Crocker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMFG-2+as+a+prognostic+indicator+in+superficial+bladder+cancer.">HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer.</a> J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).</li><li>Hughes, O., Denley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1+mucin+expression+in+transitional+cell+carcinoma+of+the+bladder:+a+target+for+diagnosis+and+therapy+with+monoclonal+antibody+C595.">MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595.</a> J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).</li><li>Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+immunity+to+MUC1+in+a+human+MUC1+transgenic+murine+model.">Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model.</a> Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).</li><li>Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin-1+specific+immunotherapy+in+a+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer.">Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer.</a> J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).</li><li>McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+total+dose+and+dose+schedule+on+induction+of+urinary+bladder+cancer+in+the+mouse+by+N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine.">Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine.</a> Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).</li><li>Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+effects+of+L-BLP25+antigen-specific+tumor+immunotherapy+in+a+novel+human+MUC1+transgenic+lung+cancer+mouse+model.">Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model.</a> J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).</li><li>Kunze, E., Schauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+transformation+in+the+development+of+N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced+transitional+cell+carcinomas+in+the+urinary+bladder+of+rats.">Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats.</a> Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).</li><li>Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+human+bladder+carcinogenesis.">Experimental models of human bladder carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).</li><li>Samma, S., Uemura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+of+carcinoma+in+situ+in+dog+urinary+bladder+by+sequential+treatment+with+N-methyl-N'-nitrosourea+and+N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine.">Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine.</a> Gann. 75 (5), 385-387 (1984).</li><li>Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+urinary+bladder+urothelial+cancers+in+the+rabbit+by+dibutylnitrosamine+with+an+artificial+bladder+calculus+as+cocarcinogen.">Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen.</a> Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).</li><li>Irving, C. C., Tice, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced+urinary+bladder+cancer+in+rats+by+administration+of+disulfiram+in+the+diet.">Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet.</a> Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).</li><li>Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-BLP25+vaccine+plus+letrozole+induces+a+TH1+immune+response+and+has+additive+antitumor+activity+in+MUC1-expresssing+mammary+tumors+in+mice.">L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice.</a> Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).</li></ol>

DPV, GTW, SMG, CJK, AMG, et GKH déclarent aucun conflit d&#39;intérêts. MWD est le chercheur principal d&#39;une subvention reçue de Merck KGaA, et MW est un employé de Merck KGaA.

L&#39;induction réussie invasive cancer de la vessie à cellules transitionnelles et squameuses chez les souris MUC1.Tg humaines propose un modèle préclinique pour le développement de l&#39;immunothérapie. Études d&#39;immunothérapie nécessitent l&#39;utilisation d&#39;un modèle intact spontanée, à l&#39;abri afin d&#39;évaluer la réponse inflammatoire à la progression tumorale au fil du temps ainsi que la réponse immunitaire à l&#39;immunothérapie. Dans un modèle de développement de tumeurs spontané...

cancer de la vessie est le quatrième forme la plus commune de cancer et la huitième cause de décès par cancer chez les hommes américains. Aux États-Unis, on estime que 72.500 nouveaux cas et 15.000 décès par cancer de la vessie sont attendus entre hommes et femmes confondus en 2013 1. L&#39;incidence du cancer de la vessie est environ trois fois plus élevé chez les hommes que chez les femmes. Aux États-Unis, les carcinomes à cellules transitionnelles (TCC) représentent plus de 90% des cas, tandis que les carcinomes spinocellulaires (CSC) ont une incidence de moins de 2% 2. Le taux de survie à 5 ans par rapport global pour papillaire TCC est de 91,5% contre seulement 30,9% pour les CSC 2. Bien que les TCC papillaires non invasives représentent environ 75% des cas au moment du diagnostic, même avec un traitement de plus de 50% des patients connaîtront une récidive dans les 5 ans, avec un maximum de 30% de ces patients évoluant vers muscle maladie invasive 3,4 . Schémas thérapeutiques classiques pour non-musculaire invasive maladie comprennent la résection transurétrale (TUR) suivie d&#39;une chimiothérapie intravésicale. Chez les patients atteints Ta haute qualité ou des tumeurs T1, une TUR de répétition peut être effectuée avant la chimiothérapie 3,4. Pour ces patients présentant des récidives de Ta bas grade ou TA de haute qualité ou des lésions T1, TUR suivie d&#39;une chimiothérapie adjuvante ou immunothérapie sous la forme de bacille de Calmette-Guérin (BCG) peut être utilisé 3,4. Intravésicale BCG a été montré supérieur à intravésicale mitomycine C par rapport au temps de récurrence 5. Pour la maladie invasive du muscle T2, cystectomie radicale avec ou sans chimiothérapie néoadjuvante est le traitement recommandé 3. Chez les patients avec SCC, cystectomie radicale semble être le traitement le plus efficace 6. Étant donné les taux très élevés de récidive malgré les meilleurs traitements disponibles, il ya clairement un besoin de nouvelles thérapies plus efficaces contre le cancer de la vessie. L&#39;expansion de nouvelles immunothérapies pour bladdcancer ER est une approche possible qui pourrait s&#39;annoncer prometteuse pour prolonger la survie sans maladie. Historiquement, le BCG a été le seul immunothérapie efficace contre le cancer de la vessie. Son mécanisme d&#39;action est pensé pour impliquer l&#39;induction non spécifique d&#39;une réponse immunitaire de type T-helper 1 (Th1) via des niveaux croissants de l&#39;interleukine-2 (IL-2) et l&#39;interféron gamma (IFN-γ) 4. Cellulaire, ou Th1 immunité, est essentiel dans l&#39;immunothérapie du cancer comme humorale, ou Th2, l&#39;immunité n&#39;a jamais été montré pour être efficace contre les tumeurs solides, à l&#39;exception des anticorps dirigés contre les récepteurs du facteur de croissance 7. Dans une tentative pour améliorer les avantages de BCG monothérapie IFN-α 2B/BCG immunothérapie combinaison a été évaluée dans un essai clinique de phase II avec des résultats peu concluants 8. Une autre approche pour l&#39;immunothérapie du cancer de la vessie peut être de cibler des antigènes associés aux tumeurs (TAA), l&#39;identification de ce qui a rendu l&#39;immunothérapie du cancer plus précis 7 </splace&gt;. Un tel TAA est une mucine (MUC1), qui est une glycoprotéine de surface de cellule surexprimé dans de nombreux cancers des cellules épithéliales, comme la vessie, du sein, du poumon et le cancer du pancréas 9,10. L&#39;expression et la modification de MUC1 est également substantiellement modifiées au cours de la carcinogenèse, de telle sorte que underglycosylation expose des séquences d&#39;acides aminés antigéniques des dits nombre variable de répétitions en tandem (VNTR) sur la base des peptides. Alors que MUC1 est un auto-molécule, ces régions VNTR immunodominantes ne sont normalement pas exposés en raison des importants glycosylation, et donc ils sont vus par le système immunitaire 11,12 étranger. Lymphocytes T cytotoxiques (CTL) qui reconnaissent spécifiquement MUC1 épitopes ont été isolés à partir de la tumeur ganglions lymphatiques de drainage des patients atteints de cancer du sein 13, ainsi que le sang et la moelle osseuse des patients atteints de myélome 14,15, ce qui MUC1 une cible potentielle pour une réponse immunitaire cellulaire. Les VNTRs immunodominantes du underglycosylateforme d de MUC1 sont reconnus par les CTL, ce qui entraîne la destruction des cellules tumorales 16-19. Réponses immunitaires cellulaires et / ou humorale autochtones à MUC1 cancéreuses sont, cependant, pas assez forte pour éliminer les tumeurs. Pour augmenter la réponse immunitaire est affaibli déjà existant pour MUC1, peptides immuno-synthétiques peuvent être introduits par la vaccination pour générer une réponse CTL assez fort pour être d&#39;avantage clinique 18,20. Un vaccin liposomale MUC1 a déjà été montré pour augmenter la survie des patients atteints de cancer du poumon 21,22, générer des CTL capables de tuer les cellules tumorales MUC1-positifs, et produire une réponse de cytokines Th1 polarisé 23,24. Avec un haut niveau d&#39;expression de MUC1 9,11,25, le cancer de la vessie est un candidat logique pour tester MUC1 dirigée immunothérapie 26,27. En outre, MUC1 a un potentiel comme facteur pronostique dans cancer de la vessie 28, expression de MUC1 dans TCC est significativement associée avec le stade et le grade, et métastatique TCCa été montré pour continuer à exprimer MUC1 29. Afin d&#39;évaluer l&#39;utilité potentielle de l&#39;immunothérapie dirigée MUC1 dans le cancer de la vessie, nous avons développé un MUC1 humaine intacte immunitaire (hMUC1) exprimant transgénique (MUC1.Tg) modèle murin de congénique cancer de la vessie sur le fond C57BL / 6 30. MUC1 humain est exprimé comme une protéine du soi sous le contrôle de son propre promoteur, résultant en un profil d&#39;expression tissulaire conforme à celle observée chez l&#39;homme 30,31. Les souris ont été induites par le carcinogène de la vessie appelée N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (OH-BBN) 32, puis les tumeurs résultant ont été évalués pour hMUC1 expression et le type de tumeur et de qualité. Pour évaluer l&#39;effet de la substance cancérigène sur Th1/Th2 niveaux de cytokines au cours du développement tumoral, des échantillons de sérum ont été prélevés périodiquement pour l&#39;analyse multiplex. Les souris ont ensuite été traités avec un vaccin peptidique MUC1 ciblée, et la cytokine sérum et les réponses immunitaires étaient d&#39;évaluationted par multiplex fluorimétrique immuno-microbille et ELISpot.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN)</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>B0938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G Gavage Needles</td>
			<td>Popper &#38; Sons, Inc.</td>
			<td>7921</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide Vaccine</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>investigational agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microtainers</td>
			<td>BD</td>
			<td>365957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cassettes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M490-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis Buffer</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>87787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease &#38; Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokine 20plex Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LMC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Microsphere Beads</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>MC100xx-01</td>
			<td>xx is the bead region</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TNF- Capture Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>551225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TNF- Detection Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>554415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IFN- Capture Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IFN- Detection Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab83136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Buffer</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>L-MAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokine Standard</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MXM8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-screen HTS 96well filter plates</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSBVN1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-PE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 m Nylon Tissue Sieves</td>
			<td>BD</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splenocyte Separation Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-829E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF- /IL-4 ELISpot plates</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>ELD5217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>2900-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-actin monoclonal antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>W401B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse HRP antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>SC-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>162-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean TGX Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>456-1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Count &#38; Viability Kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MCH100104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC1 Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550486</td>
			<td>IHC antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Research Peroxidase Kit</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K3954</td>
			<td>IHC staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore plate vaccum apparatus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Lx200</td>
			<td>Millipore / Luminex</td>
			<td>40-013</td>
			<td>Manufactured by Luminex, distributed by Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Xponent Software</td>
			<td>Millipore / Luminex</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 3.1; included with Luminex Lx200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milliple Analyst Software</td>
			<td>Milliplex / VigeneTech</td>
			<td>40-086</td>
			<td>Version 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muse Software</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 1.1.0.0; included with Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Unitron</td>
			<td>Z730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism Software</td>
			<td>Graphpad Software Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans Blot SD Cell and PowerPac</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-3849</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of invasive transitional cell bladder carcinoma in immune intact human muc1 transgenic mice:  a model for immunotherapy development

Un modèle préclinique de cancer invasif de la vessie a été développé en mucine humaine 1 (MUC1) (MUC1.Tg) de souris transgéniques à des fins d&#39;évaluation de l&#39;immunothérapie et / ou la chimiothérapie cytotoxique. Pour induire un cancer de la vessie, C57BL / 6 (type MUC1.Tg et sauvages) ont été traités par voie orale avec l&#39;agent cancérigène N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (OH-BBN) à 3,0 mg / jour, 5 jours / semaine pendant 12 semaines. Pour évaluer les effets de OH-BBN sur le profil des cytokines sériques au cours du développement tumoral, le sang total ont été recueillis par des saignements sous-maxillaires avant le traitement et toutes les quatre semaines. En outre, un vaccin contre le peptide MUC1 ciblée et un placebo ont été administrés à des groupes de souris par semaine pendant huit semaines. Multiplex fluorimétriques immunoanalyses de microbilles de cytokines sériques au cours du développement tumoral et après la vaccination ont été réalisées. A la fin, l&#39;interféron gamma (IFN-γ) / interleukine-4 analyse (IL-4) ELISpot pour MUC1 réponse immunitaire des cellules T spécifiques et des évaluations histopathologiques de type de tumeuret la qualité ont été réalisées. Les résultats montrent que: (1) l&#39;incidence du cancer de la vessie chez les souris de type sauvage et les deux MUC1.Tg était de 67%, (2) les carcinomes à cellules transitionnelles (TCC) développés à un ratio de 2:1 par rapport aux carcinomes spinocellulaires (CSC) , (3) des cytokines inflammatoires augmenté avec le temps au cours du développement tumoral, et (4) l&#39;administration du vaccin peptide induit un profil de cytokines Th1 sérum-polarisé et une réponse des cellules T spécifiques MUC1. Tous les tumeurs chez les souris MUC1.Tg étaient positifs pour MUC1 expression, et la moitié des tumeurs chez les souris de type sauvage ont été MUC1.Tg et invasive. En conclusion, en utilisant une approche d&#39;équipe à travers la coordination des efforts des pharmacologues, des immunologistes, des pathologistes et biologistes moléculaires, nous avons développé un modèle de souris transgénique intact immunitaire du cancer de la vessie qui exprime hMUC1.

L&#39;évaluation préclinique des effets des nouvelles immunothérapies et de combinaisons dans le cancer de la vessie nécessite le développement d&#39;un modèle animal approprié. Dans notre modèle de souris transgénique, l&#39;induction avec le carcinogène chimique OH-BBN a entraîné un taux élevé d&#39;incidence du cancer de la vessie de prédominance TCC avec certains CSC, qui est semblable au cancer de la vessie chez l&#39;homme. Pour déterminer histologie de la tumeur, MUC1 statut d&#39;expression et la...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development at JoVE.com

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Une N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine induite modèle de cancer de la vessie a été développé en mucine humaine 1 (MUC1) de souris transgéniques à des fins de test MUC1-dirigé l&#39;immunothérapie. Après l&#39;administration d&#39;un vaccin peptidique MUC1 ciblée, une réponse des lymphocytes T cytotoxiques pour MUC1 a été confirmée par la mesure des niveaux de cytokines plasmatiques et de l&#39;activité cellulaire T spécifique.

Induction du envahissantes Transitional cancer de la vessie cellulaire dans immunitaire humain MUC1 souris transgéniques intactes: un modèle pour le développement d&#39;immunothérapie

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

induction-invasive-transitional-cell-bladder-carcinoma-immune-intact

Research

JoVE Journal

Medicine

21.1K vues.  University of California, Davis. Une N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine induite modèle de cancer de la vessie a été développé en mucine humaine 1 (MUC1) de souris transgéniques à des fins de test MUC1-dirigé l'immunothérapie. Après l'administration d'un vaccin peptidique MUC1 ciblée, une réponse des lymphocytes T cytotoxiques pour MUC1 a été confirmée par la mesure des niveaux de cytokines plasmatiques et de l'activité cellulaire T spécifique.

Vidéo: Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Création et propagation des tumeurs de l&#39;homme en rétinoblastome immunitaire chez les souris déficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Recherche

Médecine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-photon imagerie de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body temperature that is observed during fever. The use of hyperthermia as an adjuvant has emerged as a promising procedure for tumor regression in the field of cancer biology. For this purpose, the most important requirement is to have reliable and uniform heating protocols. We have developed a protocol for hyperthermia (whole body) in mice. In this protocol, animals are exposed to cycles of hyperthermia for 90 min followed by a rest period of 15 min. During this period mice have easy access to food and water. High body temperature spikes in the mice during first few hyperthermia exposure cycles are prevented by immobilizing the animal. Additionally, normal saline is administered in first few cycles to minimize the effects of dehydration. This protocol can simulate fever like conditions in mice up to 12-24 hr. We have used 8-12 weeks old BALB/Cj female mice to demonstrate the protocol.

This paper describes a protocol for whole body hyperthermia in mice that can stimulate fever like conditions up to 12-24 hr.

Protocole d&#39;hyperthermie Durée du corps entier long chez la souris

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

L&#39;utilisation de la cystomanométrie chez les petits rongeurs: une étude de la vessie Chemosensation

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

Génération de sous-cutanée et intra-hépatique droits de carcinome hépatocellulaire xénogreffes chez la souris immunodéficientes

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized by increased urgency and frequency of urination, as well as nocturia and general pelvic pain, especially upon bladder filling or voiding. Despite years of research, the cause of IC/BPS remains elusive and treatment strategies are unable to provide complete relief to patients. In order to study nervous system contributions to the condition, many animal models have been developed to mimic the pain and symptoms associated with IC/BPS. One such murine model is urinary bladder distension (UBD). In this model, compressed air of a specific pressure is delivered to the bladder of a lightly anesthetized animal over a set period of time. Throughout the procedure, wires in the superior oblique abdominal muscles record electrical activity from the muscle. This activity is known as the visceromotor response (VMR) and is a reliable and reproducible measure of nociception. Here, we describe the steps necessary to perform this technique in mice including surgical manipulations, physiological recording, and data analysis. With the use of this model, the coordination between primary sensory neurons, spinal cord secondary afferents, and higher central nervous system areas involved in bladder pain can be unraveled. This basic science knowledge can then be clinically translated to treat patients suffering from IC/BPS.

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized in part by pelvic pain. In order to study nervous system contributions to the condition, a physiological model of urinary bladder pain is used in mice and rats.

Réponses vessie distension évoqués viscéromotrice comme modèle pour douleur à la vessie chez la souris

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and either cut or crush it to induce peripheral nerve injury. Advantages of this surgery are its simplicity, high reproducibility, and the lack of effect on vital functions or mobility from the subsequent facial paralysis, thus resulting in a relatively mild surgical outcome compared to other nerve injury models. A major advantage of using a cranial nerve injury model is that the motoneurons reside in a relatively homogenous population in the facial motor nucleus in the pons, simplifying the study of the motoneuron cell bodies. Because of the symmetrical nature of facial nerve innervation and the lack of crosstalk between the facial motor nuclei, the operation can be performed unilaterally with the unaxotomized side serving as a paired internal control. A variety of analyses can be performed postoperatively to assess the physiologic response, details of which are beyond the scope of this article. For example, recovery of muscle function can serve as a behavioral marker for reinnervation, or the motoneurons can be quantified to measure cell survival. Additionally, the motoneurons can be accurately captured using laser microdissection for molecular analysis. Because the facial nerve axotomy is minimally invasive and well tolerated, it can be utilized on a wide variety of genetically modified mice. Also, this surgery model can be used to analyze the effectiveness of peripheral nerve injury treatments. Facial nerve injury provides a means for investigating not only motoneurons, but also the responses of the central and peripheral glial microenvironment, immune system, and target musculature. The facial nerve injury model is a widely accepted peripheral nerve injury model that serves as a powerful tool for studying nerve injury and regeneration.

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Visage axotomie des nerfs chez la souris: Un modèle pour étudier motoneurone réponse à une blessure

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Induction de l’athérosclérose accélérée chez les souris : le modèle « Wire-Injury »

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure overload-induced left ventricular hypertrophy (LVH) and its progression to heart failure. In the majority of the reported investigations, this procedure is performed with intubation and ventilation of the animal which renders it demanding and time-consuming and adds to the surgical burden to the animal. The aim of this protocol is to describe a simplified technique of minimally invasive TAC without intubation and ventilation of mice. Critical steps of the technique are emphasized in order to achieve low mortality and high efficiency in inducing LVH.
Male C57BL/6 mice (10-week-old, 25-30 g, n=60) were anesthetized with a single intraperitoneal injection of a mixture of ketamine and xylazine. In a spontaneously breathing animal following a 3-4 mm upper partial sternotomy, a segment of 6/0 silk suture threaded through the eye of a ligation aid was passed under the aortic arch and tied over a blunted 27-gauge needle. Sham-operated animals underwent the same surgical preparation but without aortic constriction. The efficacy of the procedure in inducing LVH is attested by a significant increase in the heart/body weight ratio. This ratio is obtained at days 3, 7, 14 and 28 after surgery (n = 6 - 10 in each group and each time point). Using our technique, LVH is observed in TAC compared to sham animals from day 7 through day 28. Operative and late (over 28 days) mortalities are both very low at 1.7%.
In conclusion, our cost-effective technique of minimally invasive TAC in mice carries very low operative and post-operative mortalities and is highly efficient in inducing LVH. It simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal. It can be easily performed by following the critical steps described in this protocol.

The aim of this protocol is to describe step-by-step the technique of minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) in mice. By elimination of intubation and ventilation which are mandatory for the commonly used standard procedure, minimally invasive TAC simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal.

Technique mini-Invasive transversal constriction aortique chez les souris pour l’Induction de l’hypertrophie ventriculaire gauche

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an increased use of mouse models in orthopedic research was noted, most probably because mouse models offer a large number of genetically-modified strains and special antibodies for the analysis of molecular mechanisms of fracture healing. To control the biomechanical conditions, well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory, also in mice. Here, we report on the design and use of a closed bone healing model to stabilize femur fractures in mice. The intramedullary screw, made of medical-grade stainless steel, provides through fracture compression an axial and rotational stability compared to the mostly used simple intramedullary pins, which show a complete lack of axial and rotational stability. The stability achieved by the intramedullary screw allows the analysis of endochondral healing. A large amount of callus tissue, received after stabilization with the screw, offers ideal conditions to harvest tissue for biochemical and molecular analyses. A further advantage of the use of the screw is the fact that the screw can be inserted into the femur with a minimally invasive technique without inducing damage to the soft tissue. In conclusion, the screw is a unique implant that can ideally be used in closed fracture healing models offering standardized biomechanical conditions.

This protocol describes a minimally invasive osteosynthesis technique using an intramedullary screw for standardized stabilization of femur fractures, which can be used to analyze endochondral bone healing in mice.

Un modèle mini-Invasive pour analyser Endochondral Fracture de guérison chez des souris dans des Conditions biomécaniques

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...