Este trabalho foi parcialmente financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (HL105114, HL088391, NS066652 e HL068878 para YEC), a American Heart Association (National Scientist Desenvolvimento 0835237N para JZ). YEC é apoiado financeiramente como dotado Frederick Huetwell Professor de Medicina Cardiovascular da Universidade de Michigan Medical Center (UMMC). Este trabalho utilizou Core Services suportados pelo Centro de Modelos Avançados para Ciências de translação e Terapêutica (CAMTraST) em UMMC.

Todos os procedimentos de manutenção dos animais, cuidado e uso foram analisados ​​e aprovados pelo Comitê da Universidade sobre o Uso e Cuidados de Animais da Universidade de Michigan. 1. ZFN Desenho e selecção <ol><li> Fornecer a informação sobre a sequência genómica do gene de interesse (por exemplo, coelho APOCIII) para o fabricante. Selecione ZFN conjunto (s) para os experimentos com base nas pontuações ZFN. </li></ol> 2. Coleção Coelho Embryo <ol><li> Superovulate sexualmente maduras (6-18 meses) Nova Zelândia Branco (NZW) coelhas por via subcutânea (sc) a injeção de FSH duas vezes / dia, com uma dosagem de 3 mg para as duas primeiras injeções, 5 mg para as próximas duas injeções e 6 mg para as duas últimas injeções. </li><li> Administrar uma única intravenosa (iv) a injecção de 200 IU de hCG, a 72 horas após a primeira injecção de FSH para induzir a ovulação. Companheiro as fêmeas superovuladas com um coelho macho imediatamente após a injeção de hCG. </li><li> Euthanize os coelhos doadores superovuladas com pentobarbital de sódio (150 mg / kg, iv) a 16-18 horas pós inseminação (psi). </li><li> Recuperar o ampolas oviduto cuidadosamente recolher o ovidutos e ovários inteiros estrutura. </li><li> Lavar cada oviduto com meio de 10 mL de tampão HEPES a manipulação TCM 199 suplementado com 10% de soro fetal bovino, através da injecção do meio a partir da extremidade do útero do oviduto. Recolher o meio de lavagem na abertura ovário-final do oviduto para uma placa de Petri. </li><li> Observar e identificar embriões recuperados no meio de lavagem, lave os embriões três vezes no meio da manipulação, mantê-los no meio de manipulação a 38,5 ° C no ar, e observá-los sob um microscópio estereoscópico para a ocorrência de fertilização. Prepare-se para microinjeção de embriões em estágio pronuclear 19-21 psi h </li></ol> 3. Preparação de mRNA de ZFN <ol><li> Purifica-se o ARNm, resultando antes de ressuspensão em RNAse-livre de 0,1 X TE (1 mM Tris-Cl pH8,0, EDTA 0,1 mM). Medir a concentração e armazenar o ARNm a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Preparar os mRNAs que codificam par ZFN (4-10 ng / mL em 1 mMTris-Cl, 0,1 mM de EDTA a pH 7,5), em aliquota de 10 ul frascos. Guarde-os a -80 º C até que esteja pronto para uso. Antes de microinjeção, descongelar o frasco (s) de RNA, e mantê-lo no gelo. </li></ol> 4. Embrião microinjeção <ol><li> Prepare a plataforma microinjecção, colocando uma gota de 5 ul de meio de manipulação de uma lâmina de câmara de 1-bem que tem a câmara de material removido. Cubra a gota média com óleo mineral e lugar no palco microscópio aquecida. </li><li> Coloque pipeta exploração (120 um de diâmetro) para o braço de suporte do micromanipulador e posicioná-la na gota de meio de manipulação. </li><li> Fabricar micropipetas de injeção através do aquecimento e puxando tubos capilares de vidro de borosilicato de um dispositivo extrator micropipeta. Carregar o mRNA a ser injectado na pipeta de injecção. </li><li>Ligue o fornecimento de ar comprimido que é conectado a um microinjetor. </li><li> Coloque pipeta de injeção no suporte a injeção, colocá-lo no micromanipulador e posicioná-lo para a gota de meio de manipulação. </li><li> Configuração microinjetor, com os seguintes parâmetros sugeridos: holdP = 2 psi, InjP = 20 psi, ClearP = 60 psi, Injtime = 1 seg, o que irá resultar em um volume de injecção de 1-5 pl. </li><li> Abra a ponta da pipeta de injecção batendo-a contra a pipeta de exploração. </li><li> Transferir embriões (30-50) para a queda de micromanipulação na plataforma. Utilizar a pipeta de exploração para capturar um embrião e alinhar a agulha de injecção, e o embrião pipeta de retenção ao longo do eixo-x. </li><li> Sob aumento de 400X, o avanço da pipeta de injeção através do embrião. Tenha cuidado para evitar o núcleo. Uma vez que a membrana plasmática é perfurado, pedal imprensa pé para injetar. Após a injeção, retirar a agulha, solte o embrião. Repita o processo para todos los restantebryos. </li><li> Lavar embriões injectados três vezes em meio de cultura de embrião, o qual é constituído por uma solução salina equilibrada de Earle (EBSS), suplementado com aminoácidos não essenciais (NEAA), aminoácidos essenciais (EAA), 1 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 0,4 mM, e 10% FBS. </li><li> Incubar os embriões a 38,5 ° C em 5% de CO 2 em ar durante 1-2 horas, antes de serem transferidos para cirurgicamente os ovidutos de uma fêmea receptora sincronizado NZW coelho (ver passo 5.1). Alternativamente, a cultura dos embriões até atingirem o estágio de blastocisto, antes de serem usados ​​para a validação em vitro ou ensaios. </li></ol> 5. Transferência de Embriões <ol><li> Selecione um coelho fêmea NZW 5-12 meses de idade, com boa saúde, pesando aprox. 4,0-5,0 kg como destinatário dos animais. Administrar Hormona Libertadora de Gonadotropina (GnRH), por via intramuscular injecção (im, de 50 mcg / ml, 0,3 ml / animal) para o receptor ao mesmo tempo com que o ponto de injecção de hCG para o animal (s) doador (ver passo 2.2). </li&gt; <li> Após a conclusão da microinjeção, preparar o coelho destinatário para transferência de embriões (normalmente 16-24 horas após a injeção de GnRH). Anestesiar o coelho com 10-40 mg / kg de ketamina (im), e / ou isoflurano vaporizado (2-4%) por inalação. Proteger os olhos do coelho de secagem excessiva através da aplicação de uma pomada oftálmica estéril. Observar o animal até que ele é totalmente inconsciente, ie. não responde aos reflexos pedal; apertando a almofada do pé é usado para verificar se há falta de pedal de reflexo, que é uma indicação de anestesia adequada. </li><li> Raspar o abdômen do coelho, lave com esfoliante anti-séptico, seguido de solução anti-séptica, e limpe a área depilada com esponjas de gaze estéril. </li><li> Realizar a cirurgia sob condições estéreis, gravar os sinais vitais do coelho receptor aproximadamente a cada 15 min durante toda a cirurgia. </li><li> Transferir 10-25 embriões para um animal receptor, dependendo do número de embriões disponíveis. </li><li> No final doprocedimentos cirúrgicos, feche a camada muscular com fio absorvível revestido. Suturar a pele ou com uma sutura subcuticular usando sutura absorvível ou com simples suturas interrompidas usando sutura nonabsorable (por exemplo, de monofilamento de nylon ou semelhante). </li><li> Mantenha o animal aquecido e monitorá-lo até o seu decúbito esternal é atingido. </li><li> Monitorar o animal diariamente. Siga as instruções do veterinário para cuidar do animal. Administrar meloxicam (sc de 1,0 mg / kg) para aliviar a dor e / ou reduzir a febre pós operação diária, se necessário determinado pelo médico veterinário. </li><li> Remover suturas nonabsorable em cerca de 10-14 dias de operação post. </li></ol> 6. Detecção de ZFN Induced Gene Disruption <ol><li> Para a validação in vitro, realizar genotipagem nas in vitro de embriões em cultura. Lyse embriões individuais que se desenvolveram a fase de mórula / blastocisto em solução 5 mL NP40 (1% NP40 mais 1 ug / ml proteinase K em Taq Tampão) Durante 0,5-1 horas a 55 ° C, e 10 min a 95 ° C. </li><li> Para a genotipagem da prole, coletar amostras de pele de orelha de kits de recém-nascidos, extrair DNA genômico, e usá-los como modelos para PCR seqüenciamento. Aplicar Kwik-Stop para a área de amostragem após a coleta para parar a hemorragia e reduzir o desconforto. </li><li> Utilizar a lise do passo 6.2 ou 6.3 como molde para PCR utilizando-LA Taq e par de iniciadores de PCR, as quais estão localizadas a montante (5&#39;-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 &#39;) e a jusante (5&#39;-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3&#39;) do local alvo ZFN . </li><li> Purifica-se os produtos de PCR e sequenciar-los com o iniciador de sequenciação (5&#39;-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 &#39;). </li><li> Identificar as amostras mutantes, olhando para a curva de casal no diagrama de sequência em torno do local segmentação. Identifique aqueles com curvas duplas como &quot;positivo&quot;. </li><li> Clonar os produtos &quot;positivos&quot; de PCR em vector de clonagem TA, pegar 10-20 clones, seqüência as inserções, e confirmar as mutações em torno da targeting local. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

No presente trabalho, cinco coelhos APOCIII KO foram gerados utilizando a tecnologia ZFN. Anteriormente, o único relato de produção de coelhos GTT também usou a tecnologia ZFN 18. O presente trabalho confirmou que ZFN é útil para direcionar efetivamente genes em coelhos. No presente estudo, a taxa de ratinhos transgénicos (kits positivo / total de nascidos) is23.8% (5/21), o que é comparável ao do relatório anterior ZFN em coelhos (30,8%, 16/52) 18, e os relatados de usar ZFN em outras espécies animais, incluindo peixe zebra 19, 20 camundongos, ratos e porcos 21 17. Esta taxa é de facto mais elevada do que as taxas de produção de muitos estudos coelho transgénico convencionais, que normalmente caem na gama de 5-20%. Por exemplo, num esforço para o produto APOCIII coelhos transgénicos através de microinjecção de ADN convencional, Ding et al. Obtido 3 fundadores positivos de 54 crias recém-nascidas (5,6%) 22. Consistente com os resultados anteriores, as mutações nos locais alvo são variáveis, incluindo deleções ou inserções consistem número diferente de bases (desde 1-21 em cinco coelhos KO). Com base na informação da sequência específica dos animais fundadores, prevê-se que pelo menos quatro (isto é. Aqueles contendo Δ1, 1, 1, ou Δ20 mutações) que tem perda de função de APOCIII. Animais R-16 com Δ21 poderá não apresentar perda funcional, já que esta mutação está previsto para apenas causar perda de sete aminoácidos, mas não uma mudança de quadro de leitura. Em última análise, ensaios fenótipo são necessários para determinar se esses animais fundadores realmente mostrar a perda de funções APOCIII. Nenhum dos cinco coelhos KO gerados no presente estudo contêm modificações bialélicos. Curiosamente, este é também o caso no relatório anterior coelho ZFN. Em contraste, quando ZFNs segmentação α1 ,3-galactosiltransferase foram aplicados ao porcoAs células, a frequência de direcionamento de um único alelo variou 7-46%, com cerca de um terço de mutações de um só passo, criando bialélico perfurações 23. Consistente com isto, quando TALEN foi aplicado a células de fibroblastos de porco, as modificações bialélicos foram encontrados em cerca de 15-40% do total de 14 clones positivos. É possível que o fracasso em gerar coelhos KO bialélicos no presente estudo pode indicar uma diferença de espécies (ou seja coelhos contra os porcos) para tal capacidade de gene nuclease baseada segmentação. É, no entanto, mais provável que este é simplesmente porque o número de coelhos KO gerados neste projecto é relativamente pequena. Acreditamos que ZFN é capaz de gerar mutações bialleic em coelhos, que devem ser considerados como uma outra vantagem potencial de produção de coelhos GTT baseado ZFN. São necessários mais estudos para confirmar essa capacidade de ZFN em coelhos. Em conclusão, o presente trabalho demonstra que a ZGene baseado FN visando abordagem é eficaz na produção de coelhos KO. Em particular, foram geradas cinco coelhos APOCIII KO com uma taxa satisfatória transgénico de 23,8%. Estes animais são acreditados para fornecer informações mais significativas sobre o papel desta proteína no metabolismo lipídico em humanos do que os modelos correspondentes do mouse. Prevemos direccionamento de genes com base ZFN, bem como outras tecnologias de base, tais como nucleases TALEN e RGEN, em animais nonmurine facilitará significativamente o desenvolvimento de novos modelos animais para o estudo de várias doenças humanas. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Fluxograma da produção de coelhos knockout utilizando a tecnologia ZFN. A produção de coelhos KO utilizando tecnologia ZFN começa com a selecção do gene de interesse. A informação é fornecida seqüência, conjuntos ZFN são projetados e subjected a levedura baseado validação interna. No ponto de verificação (CP) 1 (CP-1), apenas os conjuntos passaram na casa de validação (50% ou mais do controle interno positivo) será fornecido aos usuários para a seleção. Se nenhum conjunto de passar CP-1, sequência adicional pode ser necessária para a concepção de conjuntos ZFN eficazes. Uma validação embrião in vitro é seguido para assegurar o conjunto ZFN selecionado pode induzir mutações em locais selecionados (CP-2). ZFN conjunto (s) só será utilizado se passa CP-2 (&gt; = 10% de taxas de mutação em embriões in vitro). Falha no CP-2 exigirá um redesenho dos conjuntos ZFN. Doadoras de embriões serão preparados e embriões em estágio pronuclear será microinjeção com os conjuntos ZFN validadas. Estes embriões microinjectados serão transferidos para receptoras sincronizadas. Após o período de um mês de gestação, os recém-nascidos serão genotipados (CP-3). Se nenhum dos recém-nascidos são positivos, microinjecção adicional vai ser efectuada. Demora 2-3 meses do início do projeto para CP-2, assumindo que nfalha o durante o processo. Leva adicionais 2-3 meses de CP-2 a CP-3. Por isso, é possível gerar um coelho nocaute em um mês 4-6 período de tempo usando a tecnologia ZFN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Projeto ZFN. Três conjuntos ZFN (ajuste 1, 2 e 3) foram projetados visando diferentes seqüências em Exon 1 ou Exon 2 de coelho APOCIII (A). Todos os três conjuntos foram sujeitos a MEL-1 de ensaio repórter de levedura para determinar as actividades de ZFN. De acordo com os protocolos do fabricante, que mostram actividades ZFNs&gt; 50% da do controlo positivo interno do fabrico, são considerados úteis para o in vitro e em experiências in vivo edição genoma.As atividades ZFN foram 224,2% para o conjunto 1, 196,9% para o Conjunto 2 e 177,8% para o conjunto de 3 (B), portanto, Conjunto 1 foi selecionado no presente estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3. Validação in vitro de embriões de ZFN. O ARNm (5 ug / ml) do Conjunto 1 foi microinjectada no citoplasma de embriões de coelho 35 pronuclear fase (A). Embriões eliminado sem tratamento microinjeção (n = 31) foram utilizados como grupo controle. A taxa de desenvolvimento BL foi de 77,4% no grupo controle. No grupo de micro-injectados, a taxa de BL foi de 51,4%. Das 16 BLs submetidos a PCR de seqüenciamento, 8 (50%) foram consideradas positivas, indicando Set 1 é um conjunto ZFN eficaz para induzir mutações no targelocal ting (B, apoc3wt.seq, black-box) de APOCIII em coelhos. Os LB contendo mutações são BL # apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, e (sublinhado B, vermelho) 17. Os restantes BLs (# apoc-2, 6, 9, 10, 12, 14 e 16) não possuem mutações no local segmentação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" /> Figura 4. Produção de coelhos APOCIII KO. Cento e quarenta e cinco embriões microinjetados com ZFN grupo 1 mRNAs foram transferidos para receptoras 7 coelhos pseudo-grávida (A). Embriões recém-liberadas (n = 75) sem ZFN microinjeção foram transferidos para receptoras (n = 6), como o grupo de controle. A taxa de prazo calculado como kits prazo total / total de embriões no grupo experimental é de 140,5% (21/145), enquanto que a taxa é de 29,3% (22/75) no grupo de controle (A). Dos 21 kits nascidos no grupo microinjectado, cinco (R1, R9, R11, R12 e R16) foram identificados como positivos kits KO após sequenciação de PCR (B). Os indels no local segmentação incluem duas inserções (+1 para ambos R9 e R11) e três deleções (Δ1, Δ 20 Δ 21 para R1, R12 e R16, respectivamente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

A apolipoproteína (apo) C-III (APOCIII) é uma pequena proteína de secreção-O glicosilada que é sintetizada principalmente no fígado e no intestino. Reside na superfície de quilomicron no plasma (CM), lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) e as lipoproteínas de alta densidade (HDL). APOCIII tem sido reconhecida como um fator de risco para a doença cardiovascular 1. Os pacientes com deficiência hereditária de APOCIII têm baixa de triglicérides plasmáticos (TG) e reduziu aterosclerose coronariana subclínica 2,3. Nível APOCIII elevada no plasma, por outro lado, muitas vezes, se correlaciona com a resistência à insulina, obesidade, hipertrigliceridemia e (HTG) 4,5. Gene nocaute (KO) é um meio poderoso para estudar a função de um gene. De acordo com as observações em populações mutantes humanos, nocaute do gene APOCIII em camundongos levou a uma redução de plasma TG e proteção contra HTG pós-prandial 6. Esse papel positivo de APOCIII apareceupara ser independente de apolipoproteína E (ApoE), como ratinhos deficientes de ApoE e ambos APOCIII também são protegidos de hiperlipidemia pós-prandial 7. Embora estes modelos APOCIII KO rato forneceram informação valiosa sobre as possíveis funções de APOCIII em seres humanos, é de notar que o metabolismo de colesterol de lipoproteína de ratinhos é diferente daquela dos seres humanos em muitos aspectos. Por exemplo, rato carece de colesterol de proteínas de plasma de transferência de éster (CETP), uma enzima importante envolvida no transporte de VLDL, LDL, HDL e 8. Por conseguinte, é necessário o desenvolvimento de um modelo animal apropriado para entender melhor o papel fisiológico de APOCIII in vivo. O coelho é um modelo clássico espécies animais 9-11. Ele tem um período de gestação de curta duração (30-31 dias), grande tamanho de leitegada (4-12/litter) e podem ser alojados convenientemente em uma instalação interior. Em comparação com ratos, coelhos são filogeneticamente mais estreita 10 para os seres humanos. Importante, como huhomem, mas ao contrário de ratos, coelhos são mamíferos ricos em LDL e têm níveis substanciais de CETP 10,12. Além disso, eles são susceptíveis a aterosclerose induzida por dieta rica em colesterol com as lesões semelhantes aos observados na aterosclerose humana 13. Por estas razões, temos a hipótese de que os coelhos APOCIII KO pode servir como um modelo melhor do que suas contrapartes do rato para investigar os papéis de ApoCIIIplay no metabolismo lipídico e aterosclerose em humanos. Produção de gene transgênico alvo (GTT) coelhos tem sido um desafio. Isto é principalmente devido à falta de transmissão da linha germinativa de células-tronco embrionárias (ESC) ea baixíssima eficiência da transferência nuclear de células somáticas (TNCS) em coelhos. ESC é a principal ferramenta para gerar camundongos GTT, enquanto e TNCS tem sido aplicado com sucesso para gerar animais KO em espécies falta CES transmissão germinativas, incluindo suínos, ovinos e bovinos, mas não coelhos. Recentemente Zinc Finger Nuclease (ZFN), Trancrição Activator-Like Effector Nuclease (TALEN) 14, e RNA Endonuclease Guiada (RGEN) 15 surgiu como meios poderosos para edição genoma. Estas nucleases, assim chamados de &quot;tesoura molecular&quot;, são eficazes na geração de quebras de cadeia dupla (DSB) no genoma que pode levar a um KO funcional do gene alvo ou utilizadas para integrar uma sequência de ADN num local específico no genoma de um número de espécies de 16. Em 2011, entre os primeiros a adaptação da tecnologia ZFN, geramos peroxisome receptor gama ativado por proliferador (PPAR), as células de suíno KO através desta abordagem e porcos PPAR KO gerados com sucesso depois de usar estas células para TNCS 17. No mesmo ano, a interrupção do gene da imunoglobulina eficiente e substituição alvo em coelhos também usando ZFN foi relatada 18. No presente estudo, cinco coelhos APOCIII KO foram gerados como foi confirmado por PCR seqüenciamento, utilizando ZFN Set 1 (veja a Figura 1 </strong&gt;. fluxograma para a ilustração). Estes animais são novos recursos para estudar os papéis de APOCIII no metabolismo de lipídios.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">APOC3-ZFN</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">CSTZFNY-1KT</td>
			<td style="width:167px;">Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344M</td>
			<td>mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAclear Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">AM1908M</td>
			<td>mRNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Follicle-stimulating hormone</td>
			<td>Bioniche Life Sciences</td>
			<td style="width:136px;">Folltropin-V</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Intervet</td>
			<td style="width:136px;">Chorulon</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gonadotropin-releasing hormone</td>
			<td>Prospecbio</td>
			<td>HOR-255</td>
			<td>Treating embryo recipient rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">SH30029.02</td>
			<td>Embryo culture, base medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (nonessential amino acid)</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M7145</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BME AMINO ACIDS solution</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">B6766</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffered TCM 199&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td style="width:136px;">12350039</td>
			<td>Embryo manipulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Incubator</td>
			<td style="width:276px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Galaxy 170</td>
			<td>Embryo culture equipment</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">TransferMan NK 2</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Inc.</td>
			<td style="width:136px;">P-1000</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td style="width:136px;">MINJ-D&#160;</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillary tubes&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">TW100F-6</td>
			<td>Embryo manipulation supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Euthasol (pentobarbitol sodium)</td>
			<td style="width:276px;">Virbac AH, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">ANADA#200-071</td>
			<td>Euthanization of embryo donor rabbits</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of apolipoprotein c-iii knockout rabbits using zinc finger nucleases

A apolipoproteína (apo) C-III (APOCIII) reside na superfície de quilomicron no plasma (CM), lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) e as lipoproteínas de alta densidade (HDL). Tem sido reconhecido que os elevados níveis de plasma APOCIII factor de risco constitutea para doenças cardiovasculares (DCV). Nível APOCIII plasmáticos elevados, muitas vezes se correlaciona com a resistência à insulina, obesidade e hipertrigliceridemia. Valiosos conhecimentos sobre os papéis de ApoCIIIin metabolismo de lípidos e doenças cardiovasculares tem sido obtido a partir de modelos de ratinhos transgénicos, incluindo knockout (KO) APOCIII, no entanto, é de notar que o metabolismo das lipoproteínas em ratinhos é diferente daquela dos seres humanos em muitos aspectos. Não se sabe até agora se plasma elevado APOCIII é diretamente aterogênica. Nós trabalhamos para desenvolver coelhos APOCIII KO no presente estudo com base na hipótese de que os coelhos podem servir como um reasonablemodelfor estudar o metabolismo lipídico humano e aterosclerose. Coelho dedo de zinco nuclease (ZFN) conjuntos visando ApoCIIIgene foram submetidos a validação in vitro antes da microinjecção de embriões. O mRNA foi injectada para o citoplasma de 35 embriões de coelho fase pronuclear, e avaliadas as taxas de mutação no estado de blastocisto. Dos dezasseis blastocistos que foram testadas, uma taxa satisfatória de 50% mutação (8/16) no sítio de direccionamento foi alcançado, suportando a utilização de um Conjunto para experiências in vivo. Em seguida, microinjeção 145 embriões com Set 1 mRNA, e transferiu esses embriões de coelhos 7 receptores. Depois de 30 dias de gestação, 21 kits nasceram, dos quais cinco foram confirmados como coelhos APOCIII KO após PCR ensaios de sequenciamento. A taxa de animais KO (# kits KO / total de nascidos) foi de 23,8%. A eficiência global de produção é de 3,4% (5 kits/145 embriões transferidos). O presente trabalho demonstrou que ZFN é um método altamente eficiente para a produção de coelhos KO. Estes coelhos APOCIII KO são novos recursos para estudar os papéis de APOCIII no metabolismo de lipídios.

Na validação in vitro de pares ZFN Dezesseis pares ZFN foram inicialmente projetados. A sequência de ruptura direccionada do Conjunto 1 está localizada no exão 2 de coelho APOCIII (Figura 2A). Três pares (grupo 1, 2, e 3, Figura 2A) foram seleccionados e sujeitos a levedura MEL-1 ensaio de repórter para determinar as actividades de ZFN (Figura 2B). Conjunto 1 tem uma pontuação ZFN de 224,2%, mais elevada do que aqueles do Conjunto 2 (196,9%) e do Conjunto 3 (177,8%) e muito mais elevado do que o limiar de selecção (ou seja, 50% do controlo positivo interno). Portanto Set 1 foi selecionado para experimentos in vitro de validação. Um conjunto particular deve resultar em taxas positivas nos embriões de 10% ou mais elevada para passar a validação in vitro de embriões, com base nos critérios de validação interna. O ARNm (5 ug / ml) do Conjunto 1 foi microinjectada no citoplasma de embriões de coelho 35 pronuclear fase (Figura 3A &lt;/ Strong&gt;). Embriões eliminado sem tratamento microinjeção (n = 31) foram utilizados como grupo controle. Dezoito embriões do grupo microinjectados desenvolveram para a fase de BL em D5, das quais dezasseis foram sequenciados, e oito (BL # apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, Figura 3B, sublinhado vermelho) exibido mutado seqüências no local de segmentação (black-box, Figura 2B, linha superior, apoC3wt.seq). A taxa de BL do grupo microinjectado (51,4%) é mais baixa do que a do grupo de controlo (77,4%), indicando a capacidade de desenvolvimento de embriões ligeiramente prejudicada microinjectados. A taxa de mutação positiva dos embriões microinjectados é de 50,0% (8/16), muito mais elevada do que o limiar de selecção (por exemplo, 10%). Estes resultados revelaram que Set 1 é um conjunto ZFN eficaz para induzir mutações no local segmentação de APOCIII coelho. Portanto Set 1 foi escolhido para produção in vivo de coelhos APOCIII KO. Produção de coelhos APOCIII KO O ARNm of ZFN Conjunto 1 foi microinjectada no citoplasma de embriões de coelho fase pronuclear, e transferidos 145 embriões microinjectados 7 coelhos receptoras pseudo-grávido (Figura 4A). Embriões recém-liberadas (n = 75) sem ZFN microinjeção foram transferidos para receptoras (n = 6), como o grupo de controle. Depois de 30 dias de gestação, 21 kits nasceram no grupo microinjeção. PCR sequenciação identificados cinco (APOC3-R1, R9, R11, R12 e R16) como kits KO positivos (Figura 4B). A taxa de prazo calculado como kits total de prazo / embriões totais é de 14,5% (21/145), enquanto que a taxa é de 29,3% (22/75) no grupo de controle. A taxa de KO calculado como kits totais KO / prazo total é de 23,8% (5/21). Um kit KO (PACO-R16) morreu cinco dias pós-parto (20,0%, 1/5). O indelsat local direccionamento incluem duas inserções e três deleções, eles areΔ1, 1, 1, Δ20 e Δ21, para coelhos # R1, R9, R11, R12, e R16, respectivamente, (Figura 4B). Bianálise oinformatics foi utilizada para identificar potencial ZFN off-alvos com 7 ou menos incompatibilidades para definir uma seqüência, como descrito anteriormente 17. Apenas um possível local previsto fora do alvo, localizado no cromossomo 14, foi identificado com 7 bps incompatíveis. Ensaio de PCR detectados eventos fora do alvo, em qualquer um dos animais fundadores.

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Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

Desenvolvimento recente no gene ferramentas que visam torna a produção de knockout (KO) coelhos possível. No presente trabalho, geramos cinco coelhos apolipoproteína (Apo) C-III KO usando Nucleases dedo de zinco (ZFN). Este trabalho demonstrou que ZFN é um método altamente eficiente para a produção de coelhos KO.

Produção de Coelhos Knockout apolipoproteína C-III, utilizando zinco Nucleases dedo

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

production-apolipoprotein-c-iii-knockout-rabbits-using-zinc-finger

Research

JoVE Journal

Medicine

18.0K visualizações.  University of Michigan Medical Center.  Desenvolvimento recente no gene ferramentas que visam torna a produção de knockout (KO) coelhos possível. No presente trabalho, geramos cinco coelhos apolipoproteína (Apo) C-III KO usando Nucleases dedo de zinco (ZFN). Este trabalho demonstrou que ZFN é um método altamente eficiente para a produção de coelhos KO. 

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Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that system. Changes in blood flow to the small intestine can result in effects on the absorptive functions of the organ. Particular interest in toxins liberated from feedstuffs through fermentative and digestive processes has developed in ruminants as an area where productive efficiencies could be improved. The video associated with this article describes an in vitro bioassay developed to screen compounds for vasoactivity in isolated cross-sections of bovine mesenteric artery and vein using a multimyograph. Once the blood vessels are mounted and equilibrated in the myograph, the bioassay itself can be used: as a screening tool to evaluate the contractile response or vasoactivity of compounds of interest; determine the presence of receptor types by pharmacologically targeting receptors with specific agonists; determine the role of a receptor with the presence of one or more antagonists; or determine potential interactions of compounds of interest with antagonists. Through all of this, data are collected real-time, tissue collected from a single animal can be exposed to a large number of different experimental treatments (an in vitro advantage), and represents vasculature on either side of the capillary bed to provide an accurate picture of what could be happening in the afferent and efferent blood supply supporting the small intestine.

The small intestine is frequently exposed to toxins that can influence blood flow and negatively impact nutrient absorption. Using a multimyograph and mesenteric artery and vein isolates, compounds or toxins of interest can be screened for vasoactivity.

Isolando e com cortes de bovinos artéria e veia mesentérica como Bioassay teste para vasoactividade no intestino delgado

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Medicina

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

A Passo a Passo Protocolo de Cirurgia sub-retiniana em Coelhos

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

A High Throughput, multiplexados e alvejado proteômica CSF Ensaio para quantificar Neurodegenerativas Biomarkers e apolipoproteína E isoformas Estado

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, dyslipidemia, and diabetes. To date, there is evidence to support a role for circulating aldosterone as a risk factor for the development of cardiovascular disease. Transgenic mouse models have been generated to study cellular and molecular processes leading to atherosclerosis. In this manuscript, we describe a protocol that takes advantage of continuous infusion of aldosterone in ApoE-/- mice and generates atherosclerotic plaques in the aortic root after 4 weeks of treatment. We, therefore, illustrate a method for quantification and characterization of atherosclerotic lesions at the aortic root level. The added value of aldosterone infusion is represented by the generation of atherosclerotic lesions rich in lipid and inflammatory cells after 4 weeks of treatment. We describe in detail the staining procedures to quantify lipid and macrophage content within the plaque. Notably, in this protocol, we perform heart tissue-embedding in OCT in order to preserve the antigenicity of cardiac tissue and facilitate detectability of antigens of interest. Analysis of the plaque phenotype represents a valid approach to study the pathophysiology of atherosclerosis development and to identify novel pharmacological targets for the development of anti-atherogenic drugs.

We describe a protocol to induce atherosclerosis in the aortic root of ApoE-/- mice fed with an atherogenic diet, through a continuous release of aldosterone. Methods to characterize plaque composition are also described.

Indução de ateroma através da ativação de receptores de mineralocorticoide em camundongos deficientes em Apolipoprotein E

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular disease is the development of ischemia. In severe cases, patients can develop critical limb ischemia in which they experience constant pain and an increased risk of limb amputation. Current therapies for peripheral ischemia include bypass surgery or percutaneous interventions such as angioplasty with stenting or atherectomy to restore blood flow. However, these treatments often fail to the continued progression of vascular disease or restenosis or are contraindicated due to the overall poor health of the patient. A promising potential approach to treat peripheral ischemia involves the induction of therapeutic neovascularization to allow the patient to develop collateral vasculature. This newly formed network alleviates peripheral ischemia by restoring perfusion to the affected area. The most frequently employed preclinical model for peripheral ischemia utilizes the creation of hind limb ischemia in healthy rabbits through femoral artery ligation. In the past, however, there has been a strong disconnect between the success of preclinical studies and the failure of clinical trials regarding treatments for peripheral ischemia. Healthy animals typically have robust vascular regeneration in response to surgically induced ischemia, in contrast to the reduced vascularity and regeneration in patients with chronic peripheral ischemia. Here, we describe an optimized animal model for peripheral ischemia in rabbits that includes hyperlipidemia and diabetes. This model has reduced collateral formation and blood pressure recovery in comparison to a model with a higher cholesterol diet. Thus, the model may provide better correlation with human patients with compromised angiogenesis from the common co-morbidities that accompany peripheral vascular disease.

We describe a surgical procedure used to induce peripheral ischemia in rabbits with hyperlipidemia and diabetes. This surgery acts as a preclinical model for conditions experienced in peripheral artery disease in patients. Angiography is also described as a means to measure the extent of introduced ischemia and recovery of perfusion.

Modelo pré-clínico de isquemia de membros posteriores em coelhos diabéticos

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

Estabelecimento de um modelo severo do olho seco usando dacryoadenectomy completo nos coelhos

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Blind Endotracheal Intubation in Neonatal Rabbits

The newborn rabbit is a useful animal model for various pathologies and procedures. Airway management of the rabbit is complex due to its anatomical characteristics, which is further complicated in the case of the newborn. Of the different methods of advanced airway management, endotracheal intubation is less aggressive than tracheostomy, and is more feasible than supraglottic management given the lack of supraglottic devices of such a small size. As direct glottis visualization is very difficult in animals this size, this blind intubation model is presented as an effective alternative, especially for experiments requiring prolonged anesthesia. Using this method, we performed blind intubations with a 90% success rate.

We describe a technique of endotracheal intubation in newborn rabbits after esophageal catheterization with a gastric tube.

Intubação endotraqueal cega em coelhos neonatais

The newborn rabbit is a useful animal model for various pathologies and procedures. Airway management of the rabbit is complex due to its anatomical ...

Multi-system Monitoring for Identification of Seizures, Arrhythmias and Apnea in Conscious Restrained Rabbits

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease and arrhythmias in people with epilepsy (i.e., epileptic heart.) Additionally, cardiac and autonomic disturbances have been reported surrounding seizures. 1:1,000 epilepsy patients/year die of sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP). The mechanisms for SUDEP remain incompletely understood. Electroencephalograms (EEG) and electrocardiograms (ECG) are two techniques routinely used in the clinical setting to detect and study the substrates/triggers for seizures and arrhythmias. While many studies and descriptions of this methodology are in rodents, their cardiac electrical activity differs significantly from humans. This article provides a description of a non-invasive method for recording simultaneous video-EEG-ECG-oximetry-capnography in conscious rabbits. As cardiac electrical function is similar in rabbits and humans, rabbits provide an excellent model of translational diagnostic and therapeutic studies. In addition to outlining the methodology for data acquisition, we discuss the analytical approaches for examining neuro-cardiac electrical function and pathology in rabbits. This includes arrhythmia detection, spectral analysis of EEG and a seizure scale developed for restrained rabbits.

Using simultaneous video-EEG-ECG-oximetry-capnography, we developed a methodology to evaluate the susceptibility of rabbit models to develop provoked arrhythmias and seizures. This novel recording system establishes a platform to test the efficacy and safety of therapeutics and can capture the complex cascade of multi-system events that culminate in sudden death.

Monitoramento multissuso para identificação de convulsões, arritmias e apneia em coelhos conscientes contidos

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease ...

Three-Dimensional Finger Motion Tracking during Needling: A Solution for the Kinematic Analysis of Acupuncture Manipulation

Three-dimensional (3D) motion tracking has been used in many fields, such as the researches of sport and medical skills. This experiment aimed to use 3D motion tracking technology to measure the kinematic parameters of the joints of fingers during acupuncture manipulation (AM) and establish three technical indicators "amplitude, velocity and time". This method can reflect the operation characteristics of AM and provide quantitative parameters along three axes of multiple finger joints. The current evidence shows that the method has great potential for future applications such as the study of the dose-effect relationship of acupuncture, teaching, and learning of AM, and the measurement and preservation of famous acupuncturists' AM.

This experimental method describes a solution for the kinematic analysis of acupuncture manipulation with three-dimensional finger motion tracking technology.

Rastreamento tridimensional do movimento do dedo durante a necessidade: uma solução para a análise cinemática da manipulação da acupuntura

Three-dimensional (3D) motion tracking has been used in many fields, such as the researches of sport and medical skills. This experiment aimed to use 3D ...

A Modified Technique for Arteriovenous Fistula Construction in Rabbits

Juxta-anastomotic stenosis is a challenging problem that often causes non-maturation and decreases the patency of an arteriovenous fistula (AVF). Injury to the veins and arteries during the operation and hemodynamic changes can lead to intimal hyperplasia, leading to juxta-anastomotic stenosis. To reduce injury to the veins and arteries during the operation, this study proposes a new modified no-touch technique (MNTT) for AVF construction that can decrease the rate of juxta-anastomotic stenosis and improve the AVF patency. To unravel the hemodynamic changes and mechanisms of the MNTT, this study presented an AVF procedure using this technique. Although this procedure is technically challenging, 94.4% procedural success was achieved after adequate training. Ultimately, 13 out of 34 rabbits had a functional AVF 4 weeks after the surgery, leading to a 38.2% AVF patency rate. However, at 4 weeks, the survival rate was 86.1%. Ultrasonography showed active blood flow through AVF anastomosis. Furthermore, the spiral laminar flow was observed in the vein and artery near the anastomosis, suggesting that this technique may improve the hemodynamics of the AVF. On histological observation, significant venous intimal hyperplasia was observed at the AVF anastomosis, whereas no significant intimal hyperplasia was observed at the proximal external jugular vein (EJV) of the anastomosis. This technique will improve the understanding of the mechanisms underlying the use of MNTT for AVF construction and provide technical support for the further optimization of the surgical approach in AVF construction.

The present protocol proposes the creation of an arteriovenous fistula in rabbits using a modified no-touch technique. The technique involves the side-to-side anastomosis of the common carotid artery and external jugular vein without the dissection of the perivenous tissues or cutting off the artery.

Técnica modificada para construção de fístula arteriovenosa em coelhos

Juxta-anastomotic stenosis is a challenging problem that often causes non-maturation and decreases the patency of an arteriovenous fistula (AVF). Injury ...