Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na fisiopatologia da aterosclerose precoce em camundongos. A principal vantagem dessa técnica é a eficiência, rapidez com que a aldosterona induz o desenvolvimento de placas de aterosclerose no crescimento adulto. A demonstração visual deste método é fundamental, pois algumas etapas técnicas são difíceis de aprender apenas através da instrução de texto.
Demonstrando o procedimento será Caterina Mammi, uma cientista do meu laboratório. Usando luvas cirúrgicas, conecte o tubo de enchimento da mini-bomba a uma seringa de um mililitro e carregue o tubo com 125 microliters da solução de aldosterona ou veículo. Insira o tubo de enchimento através do orifício na parte superior da mini-bomba até que não possa avançar mais e encha lentamente a bomba com a solução de aldosterona.
Pare de encher a bomba quando uma leva de fluido sair do corpo da bomba e remover cuidadosamente o tubo de enchimento. Insira o regulador de fluxo no corpo da mini-bomba, tomando cuidado para que o regulador seja semeado firmemente contra o corpo da bomba e prime a bomba preenchida em um béquer contendo solução salina estéril a 37 graus Celsius, por até 24 horas antes da implantação. Para implantar as bombas, use uma navalha para remover os cabelos do local cirúrgico e desinfetar a pele exposta com álcool isopropílico de 70% encharcado, material de almofada não tecido.
Em seguida, faça uma incisão de 0,8 a um centímetro através da pele, mas não os tecidos subjacentes e use fórceps para abrir a incisão. Usando um trocarte na outra mão, espalhe a pele para criar um bolso para a bomba a partir da incisão em direção à escápula e insira a bomba na incisão, com a cabeça do regulador orientada para a frente do mouse, empurrando suavemente a bomba completamente para o bolso para que haja pele suficiente para fechar a ferida sem tensão ou alongamento. Uma vez inserida a bomba, suture a incisão com fio cirúrgico e use um cotonete limpo para aplicar pomada tópica de iodo povidone.
Em seguida, deixe o mouse se recuperar em um estágio de aquecimento com monitoramento até a recumbência total. No ponto final experimental apropriado, o rato perfuuse através do ventrículo esquerdo usando perfusão gravitacional com 10 a 15 mililitros de DPBS gelado, seguido por 40 a 50 mililitros de 10% de formulação tampão neutro. Após 10 a 20 minutos, coloque o mouse sob microscópio estéreo e use fórceps e tesouras para remover o excesso de tecido adiposo periaórtico e pericárdico.
Segure o coração fixo com fórceps e corte perpendicularmente ao acesso do arco aórtico, o mais próximo possível ao coração, sem causar danos. Uma vez que o coração tenha sido separado da aorta, use um bisturi para cortar transversamente ao longo de uma linha reta, juntando-se aos pontos inferiores do átrio direito e esquerdo e encher a porção superior do coração aberto com o composto de temperatura de corte ideal. Coloque o tecido ressecado com um molde plástico crio-seção com o eixo da aorta colocado perpendicularmente à base do molde retangular e cubra o tecido com OCT fresco.
Vire o molde para garantir que o tecido esteja devidamente orientado, em seguida, coloque cuidadosamente o molde em uma placa de metal em gelo seco, embrulhando todo o molde com folha de prata para menos 80 graus Celsius de armazenamento quando o OCT ficar branco. Quando a crio-estatística atingir menos 20 graus Celsius, monte o bloco cardíaco congelado no suporte do espécime com o ventricular voltado para fora e insira o suporte do espécime na cabeça orientador do espécime. Ajuste a orientação do suporte da amostra para seção do bloco com a raiz aórtica perpendicular à lâmina e corte o bloco até que a raiz aórtica seja atingida.
Colete seções seriais em lâminas de vidro, monitorando o perfil anatômico da raiz aórtica, até que todas as três válvulas aórticas apareçam. Em seguida, colete de seis a oito, 10 seções de espessura ou até que uma das três válvulas desapareça ou não esteja mais intacta. Para o vermelho óleo O manchamento de gordura neutra, fixar as seções em 70 mililitros de 37% de formaldeído por cinco minutos, seguido de uma lavagem completa na água da torneira.
Após dois a três minutos, limpe a água de acesso e manche as seções em 70 mililitros de 0,3% de óleo vermelho O por 10 minutos. No final da incubação, lave os slides na água da torneira por 10 minutos e manche as células por um minuto em 70 mililitros da hematoxilina de Meyer, seguida por uma lavagem de água de um minuto e um emersão de um minuto em 70 mililitros de carbonato de lítio de 0,5%. Em seguida, lave as células na água por um minuto e monte as seções com um meio de montagem aquoso para imagem por microscopia de luz.
Após quatro semanas de tratamento, os camundongos eliminatórios de apolipoproteína-E apresentaram um aumento significativo no conteúdo lipídial, em comparação com animais do tipo controle-selvagem. Além disso, o tratamento de aldosterona aumenta o teor de macrófago em animais de nocaute, como evidenciado pela coloração do mack-3 e indicando uma placa aterosclerótica mais inflamada nesses animais em comparação com os camundongos tratados com veículos. No entanto, o tratamento com aldosterona não altera o teor de colágeno de placas ateroscleróticas.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que este método é validado apenas para camundongos apolipoproteínos que são naturalmente propensos a desenvolver aterosclerose quando alimentados com um corante aterogênico. Portanto, não pode ser aplicado a diferentes modelos animais. Após este procedimento, outros métodos como a infra-coloração podem ser realizados para caracterizar aterosclerose em outra região aórtica e quantificar o total de carga aterosclerótica.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da aterosclerose explorarem o mecanismo precoce da aterógena, como inflamação e disfunção endotelial. Não se esqueça que trabalhar com compostos voláteis como isofane e formalina pode ser extremamente perigoso e que precauções, como usar máscara facial de laboratório de segurança, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
