MH reconhece o apoio da &quot;Deutsche Forschungsgemeinschaft&quot; (DFG). Autor contribuições: MH investigação destinada; KT, JS e MT realizado pesquisas e analisados ​​os dados; KT e MH escreveu o jornal.

1. A cultura de Chlamydomonas <ol><li> A seguir C. reinhardtii cepas foram utilizados no presente estudo: WT cc124, WT CW15-arg7 (da parede celular deficiente e arginina auxotrofo), uma estirpe mutante ΔPSI 29 e um pgrl1 knock-out tensão 4. </li><li> Todas as estirpes foram crescidas em Tris-Acetato-Fosfato (TAP) médio de 30 a 25 ° C, com uma intensidade de luz contínua de 20-50 μE / m 2 seg e agitando a 120 rpm. A cultura da ΔPSI deve ser envolvido com algum papel de tecido para a exposição à luz de &lt;5 μE / m 2 seg. </li><li> As culturas de estirpes marcadas (ΔPSI e WT cc124, respectivamente) continha 7,5 mM de 15 N NH 4 Cl, enquanto que as culturas de estirpes não marcado (WT CW15-arg7 e pgrl1, respectivamente) continha 7,5 mM de 14 N NH 4 Cl. As células têm de crescer em pelo menos quatro gerandoiões para atingir rotulagem completa e deve ser mantida na fase de crescimento exponencial. </li><li> No dia antes de iniciar a contagem de experiência e diluir as células a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml em um volume de pelo menos 750 ml / deformação. </li></ol> Por favor note que dois tipos de gradientes de densidade de sacarose descontínuo são descritos no seguinte protocolo. Os gradientes de densidade fotossistema sacarose de acordo com Takahashi et al. 9 são usados ​​para separar os diferentes complexos de proteína fotossintética de tilacóides isolados e solubilizados durante durante a noite centrifugação e tem que estar preparado no dia anterior (ver Protocolo 2) e os gradientes de densidade de sacarose thylakoid 8 são aplicados no procedimento de isolamento thylakoid (ver protocolo 3). 2. Preparação de gradientes de densidade de sacarose Fotossistema <ol><li> Para despejar os gradientes são necessários três soluções estoque: <ol><li> 2 M de sacarose </li><li> 10% β-DM em H2O </li><li> 0,5 M de Tricina, pH 8,0 (NaOH) </li></ol></li><li> Usando essas ações, preparar as seguintes soluções: <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> Concentração: </td><td style="width:75px;"> 1,3 M </td><td style="width:75px;"> 1,0 M </td><td style="width:75px;"> 0,85 M </td><td style="width:75px;"> 0,7 M </td><td style="width:75px;"> 0,65 M </td><td style="width:75px;"> 0,4 M </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 2 M de sacarose </td><td style="width:75px;"> 13 ml </td><td style="width:75px;"> 10 ml </td><td style="width:75px;"> 8,5 ml </td><td style="width:75px;"> 7 ml </td><td style="width:75px;"> 6,5 ml </td><td style="width:75px;"> 4 ml </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 10%46;-DM </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 0,5 M Tricina </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td></tr><tr height="20"><td height="21" style="height:20px;width:94px;"> H2O </td><td style="width:75px;"> 6,7 ml </td><td style="width:75px;"> 9,7 ml </td><td style="width:75px;"> 11,2 ml </td><td style="width:75px;"> 12,7 ml </td><td style="width:75px;"> 13,2 ml </td><td style="width:75px;"> 15,7 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Utilize tubos de 14 milímetros x 89 milímetros de centrífuga e despeje os gradientes muito lentamente, começando com a solução de mais elevada densidade de sacarose a solução de menor densidade. </li><li> Despeje apenas 1 ml cada, para os 1,3 e 1,0 M e 2 ml de soluções para o resto das soluções. </li><li> Deixe gradientes durante a noite no quarto frio. </li></ol> 3. Anaerobic Indução e Isolamento de membranas tilacóides 8 <ol><li> Antes de começar com o isolamento de membranas de tilacóides, induzir condições anaeróbicas, fazendo borbulhar árgon durante 4 h. O borbulhamento pode ser realizada por meio de uma pipeta de vidro de cultura de frascos com agitação constante da cultura com uma barra de agitação magnética. </li><li> Comece com o isolamento de membranas de tilacóides por sedimentação das células durante 5 min a 2500 xg, ressuspender em tampão de H1 (0,3 M de sacarose, 25 mM de HEPES (pH 7,5), 5 mM MgCl2). (Por favor, note que quando se inicia com o isolamento de amostras de membranas tilacóides should ser mantidos em gelo para evitar a degradação de proteínas, todos os passos de centrifugação são realizados a 4 ° C e a trabalhar com luvas é fortemente recomendada para evitar a contaminação de queratina.) </li><li> Células de pellets por 5 min a 2.500 xg, ressuspender em tampão H1. </li><li> Quebre as células com duas passagens através de um nebulizador com uma pressão de azoto de 1500 hPa (para as estirpes sem parede celular fazer apenas uma passagem). </li><li> Gire para baixo as células de 7 min a 2.500 x g. (Após este passo, o sobrenadante deve ser verde claro, se não, a ruptura celular não foi bem sucedida.) </li><li> Ressuspender as células em tampão de H2 (0,3 M de sacarose, HEPES 5 mM (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) e as células peletizadas para 10 min a 32.800 x g. </li><li> Ressuspender as células em tampão de H3 (1,8 M de sacarose, 5 mM de HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) e homogeneizar pelota com um potter (sem partículas verdes deve permanecer no final desta etapa de trabalho). </li><li> Prepare gradientes de densidade de sacarose thylakoid em banheiraes (25 mm x 89 mm) por começando na parte inferior com uma camada de 12 ml de tampão com células H3, verter uma camada do meio, de 12 ml de tampão H4 (1,3 M de sacarose, 5 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de EDTA ( pH 8,0)) e no topo de 12 ml de tampão H5 (0,5 M de sacarose, HEPES 5 mM (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)). Tenha cuidado ao despejar os gradientes e evitar a mistura das três camadas. </li><li> Equilibrar com tampão H5 e gradientes de densidade de sacarose tilacói centrífuga durante 1 hora a 70.700 x g. </li><li> Retirar bandas tilacói dos gradientes de densidade de sacarose e tilacóides diluí-los com um volume de tampão H6 apropriado (HEPES 5 mM (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)). </li><li> Gire as células em 37.900 xg por 20 min. Se a pastilha não é apertado, mais tampão H6 é necessário para este passo de centrifugação. </li><li> Ressuspender thylakoids em um buffer H6 pequeno volume e prosseguir com determinação da concentração de clorofila. </li></ol> 4. Determinação da Concentração de Clorofila 31 </sup&gt; <ol><li> A determinação da quantidade de clorofila é realizada com 80% de acetona. </li><li> Misturar 995 mL de 80% de acetona e 5 mL de tilacóides em tampão H6 (diluição 1:200). </li><li> Vortex por alguns segundos até que não haja partículas verdes permanecem e, em seguida, girar em 14,1 g durante 5 min. </li><li> Leve o sobrenadante e medir a extinção em 663,6 e 646,6 nm e 750 nm, respectivamente. </li><li> Calcula-se a quantidade de clorofila utilizando a seguinte fórmula: <ol><li> C Chl a [mg / ml] = (0,01225 * E 663,6-0,00255 * E 646,6) * factor de diluição </li><li> C Chl b [mg / ml] = (0,02031 * E 646,6-0,00491 * E 663,6) * factor de diluição </li><li> C Chl [mg / ml] = C + C Chl a Chl b </li></ol></li></ol> 5. Carregamento de gradientes de densidade de sacarose Fotossistema <ol><li> Calcule a quantidade de tilacóides, β-DM e tampão H6 que são necessáriospara cada gradiente: <ol><li> Cada rampa deve ser carregado com um volume total de 700 ul com 0,8 mg / ml em 0,9% de clorofila β-MS (dissolver β-DM em H 2 O), preencher o volume restante com tampão H6. </li></ol></li><li> Para solubilização preparar diferentes alíquotas, com tilacóides, β-DM e tampão H6 para cada gradiente. </li><li> Deixar as amostras durante 20 minutos em gelo, com agitação regular (inversora) a cada poucos minutos (passo de solubilização). </li><li> Centrifugar a uma velocidade máxima (14000 xg) durante 10 min a 4 ° C. (Após a centrifugação, o sedimento deve ser pequeno e esbranquiçado, enquanto o sobrenadante é verde-escuro.) </li><li> Carregar sobrenadante sobre os gradientes. </li><li> Equilibrar com tampão H6 e girar usando ultracentrífuga a 134.470 xg durante a noite (14 horas) a 4 ° C. (Por favor, note que a separação bem sucedida de complexos fotossintéticos usando gradientes de densidade fotossistema sacarose como apresentado neste protocolo só é alcançada quando using recém tilacóides isolado, uma vez que uma previsão para a solubilização e separação complexo é difícil de fazer quando se trabalha com membranas de tilacóides que tenham sido congeladas antes.) </li></ol> 6. Fracionamento de gradientes de densidade de sacarose Fotossistema <ol><li> Tire fotos dos gradientes. </li><li> Perfurar um furo na parte inferior do tubo por meio de uma agulha e gradientes de fraccionar em 500 tubos de ul. Alternativamente, o fraccionamento pode também ser realizado usando uma placa de 96 cavidades (microplaca). </li><li> Ao utilizar uma microplaca, determinar a absorbância das diferentes frações do gradiente em 675 nm. (Neste passo as amostras podem ser armazenadas a -80 ° C durante algumas semanas.) </li></ol> 7. SDS-PAGE e imunodetecção (Por favor, note que apenas a comparação de WT vs ΔPSI um western blot foi realizada para selecionar as frações para posterior MS-análise. Para o experimento WT vs pgrl1 fracções foram escolhidos por meio da absorção em diferentes fracções.) <ol><li> Separe 30 ul de cada fracção de WT e ΔPSI gradiente em 13% de SDS em gel de poliacrilamida 32. </li><li> Realizar análise de western blot 33 utilizando os seguintes anticorpos: ANR1 (TEF7) 26, PGRL1 34, CAS 6, o AASI PSI subunidade 32 e PSII núcleo subunidade D1. Use todos os anticorpos com uma diluição de 1:1.000 (por técnica de detecção de quimioluminescência aumentada), excepto para o anticorpo D1, que deve ser utilizado com uma diluição de 1:10.000. </li><li> Com base nos resultados da imunodetecção, tomar as frações de pico de ANR1, PGRL1 e AASI para WT e ΔPSI (aqui frações 6 e 13, respectivamente), misturar 30 mL da fração 6 do WT e ΔPSI e fazer o mesmo com a fração de 13 de ambas as composições e separar os novamente sobre um gel de poliacrilamida SDS a 13%. </li><li> Para a comparação quantitativa do WT vs pgrl1 tomar o CFracções EF-supercomplex como determinado através da medição da absorvância nas diferentes fracções do gradiente e misturar 30 ul de ambas as amostras, seguido por separação num gel de SDS-poliacrilamida a 13%. </li><li> Manchar as bandas de proteína com uma solução de Coomassie (ácido fosfórico 85%, sulfato de amónio 757 mM, 1,2% de azul brilhante de Coomassie, 20% de metanol) durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Para remover manchas inespecífica, lavar várias vezes com DDH 2 O. </li><li> Corte as pistas em um milímetro pedaços de gel e prosseguir com a digestão em gel. (Alternativamente, as amostras podem ser secas de alguns minutos em uma centrífuga de vácuo e armazenados durante algumas semanas antes de continuar com a digestão em gel.) </li></ol> 8. A digestão em gel (a partir de modificação Shevchenko et al. 35) Por favor, note a preparar todos os buffers e soluções imediatamente antes da utilização e tomar garrafas de vidro para buffers contendo acetonitrila (ACN). &lt;br /&gt; ATENÇÃO! Trabalhando com ACN pode ser prejudicial; mais informações pode ser baixado em: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013). <ol><li> Lavar com pedaços de gel&gt; 10 volumes de ddH2O (~ 200 mL) durante 30 seg. </li><li> Incubar os pedaços de gel, com 300 ul de mM NH 4 HCO 3 25 durante 15 min com agitação, remover o líquido. </li><li> Incubar os pedaços de gel, com 300 ul de mM NH 4 HCO 3 25 em 50% de ACN (preparar por mistura de ACN e 50 mM NH 4 HCO 3 a uma razão de 1:1) durante 15 min com agitação, remover o líquido. </li><li> Se as peças de gel são ainda azul, repetir o NH 4 HCO 3 e NH 4 HCO 3 / ACN lava até a maioria do Coomassie é removido. (Embora a maior parte da coloração com Coomassie deve ser removido, ele não é necessário para Destain os pedaços de gel completamente.) </li><li> Adicionar 100 ul de ACN para desidratar os pedaços de gel por 5 min. Os pedaços de gel deve encolher umª olhar completamente branco. </li><li> Remover o máximo possível ACN e prossiga com a digestão de tripsina. Alternativamente, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C durante algumas semanas. </li><li> Adicionar 10-20 mL por banda de 20 ng / mL de tripsina em 10% ACN / 25 mM NH 4 HCO 3 (recém diluído), manter as amostras em gelo. </li><li> Após 30 min, verificar se toda a solução foi absorvida e adicionar mais tampão de tripsina, se necessário. Pedaços de gel deve ser completamente cobertas com tampão de tripsina. Manter as amostras em gelo. </li><li> Deixar pedaços de gel por mais 90 min em gelo para saturar os com tripsina. (Etapa crítica: a produção de peptídeos trípticos aumenta consideravelmente com o aumento do tempo de incubação em gelo, provavelmente por causa da difusão lenta da enzima na matriz de poliacrilamida É necessário ter um pequeno excesso de solução cobrindo os pedaços de gel para evitar que as peças. cair seco durante a incubação durante a noite.) </li><li> Digerir a 37 ° C durante 4-6 horas. Para os experimentos que requeremrecuperação peptídeo máxima, digerir durante a noite. </li><li> Após a digestão girar tampão condensado. </li><li> Sonicar tubos durante 5 min para eluir os péptidos e centrifugar de novo. </li><li> Recolher o sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo. </li><li> Realizar a extracção de péptidos com 80 ul de 30% ACN / 1% de ácido fórmico (FA), num banho sónico, durante 15 min. </li><li> Realizar a extracção com 80 mL de 30% de ACN / 1% de FA em um banho sónico, durante 15 min. </li><li> Realizar a extracção com 80 mL de 70% de ACN / 1% de FA em um banho sónico, durante 15 min. </li><li> Centrifugar novamente e piscina sobrenadante com o fluido antes. (FA serve para inactivar a tripsina e aumentar a solubilidade do péptido). </li><li> Solução de peptídeo seca completamente numa centrífuga de vácuo. (Nesse momento as amostras podem ser armazenadas durante algumas semanas, em -20 ° C, antes de prosseguir com o MS-análise). </li><li> Peptídeos Ressuspender em 6 mL MS tampão (5% ACN, 0,1 v / v FA, água) e sonicado por 2-5 min. </li><li> Centrifugar as amostras a maximum velocidade durante 5 minutos para remover o material em partículas. </li><li> Use 4 ul de sobrenadante para análise por espectrometria de massa. </li></ol> 9. MS-Análise de Dados com &quot;Proteomatic&quot; A análise dos dados foi realizada com o software open-source &quot;Proteomatic&quot; (que pode ser baixado em http://www.proteomatic.org/), uma plataforma que permite a geração e realização de MS / MS pipelines de avaliação de dados, usando software livre e comercial 36. Resumidamente, as configurações são descritas a seguir e informações mais detalhadas podem ser encontradas em 6,26. <ol><li> Identificação e quantificação de dados MS- A identificação e quantificação de proteínas de o WT vs ΔPSI experiências foram realizadas com OMSSA (versão 2.1.4 37) e qTrace 26, respectivamente, como descrito 6,26. Para a análise de dados a partir de MS-o experimento WT vs pgrl1 o seguinte oleoduto actualização foi utilizado:<ol><li> Além OMSSA 37, as proteínas foram também identificados com X! Tandem (versão 2013/02/01 38). Ambos os algoritmos foram aplicados através de pesquisa contra um banco de dados gerado pela combinação do JGI Chlamydomonas banco de dados modelo gene versão 4.3 com a versão do banco de dados AUGUSTUS 10.2, bem como contra um banco de dados do NCBI juntou bancos de dados BK000554.2 e NC_001638.1. </li><li> MS 2 Identificação de péptidos foi realizada utilizando uma abordagem de chamariz alvo 39. Um engodo para cada proteína foi criado por baralhar aleatoriamente péptidos trípticos, mantendo a redundância de péptidos nonproteotypic. </li><li> Validação estatística dos péptidos foi realizada com o qvality software (versão 0.3.3 40) utilizando uma probabilidade de erro posterior (PEP) limiar de menos do que 0,01 e os resultados foram filtrados com uma tolerância de massa precursor de 5 ppm. </li><li> Peptídeos de OMSSA e X! Runs Tandem se juntaram e quantificadas com qTrace <sup&gt; 26 aplicando as seguintes etapas de filtragem: exija o MS 2 Identificação, adicionar nomes de proteína / informações do grupo e exigem ambos os peptídeos irmã. </li></ol></li></ol> Para investigar se a proteína proporções foram significativamente diferentes em relação uns aos outros nas frações CEF-supercomplex mistas de WT e pgrl1, a análise estatística foi realizada a aplicação do software SPSS (versão 21). As sub-unidades do complexo de citocromo b 6 / f foram testados contra o outro, assim como as proteínas FNR, FTSH2 e HCF136 contra as subunidades PSI. Os rácios de péptidos de cada contagem de varredura por proteína de todas as quatro repetições foram testados para a distribuição normal com o teste de Shapiro-Wilks. Uma vez que as populações de péptidos não foram distribuídos normalmente (p &lt;0,001), foram realizadas estatísticas não paramétricas. Primeiro, o teste de Kruskal-Wallis foi aplicado avaliando uma divergência significativa entre os grupos. Só se este teste previsto diferença significativas entre grupos, foi realizada uma análise mais aprofundada de prever as diferenças significativas entre os dois grupos independentes, com o teste de Mann-Whitney U-teste.

Os autores declaram que não há interesse financeiro concorrente.

Diferentes estudos de proteômica quantitativa, utilizando rotulagem de isótopos estáveis ​​têm sido publicados nos últimos anos. Nestas experiências, normalmente duas amostras diferentes são comparados, de que uma amostra é marcada com um isótopo estável. Posteriormente, as proteínas ou os péptidos de ambas as amostras são combinadas numa proporção igual e ainda mais processados ​​em conjunto 48. Tais estudos, muitas vezes a intenção de comparar os compartimentos definidos isoladas ce...

Processos fotossintéticos em tilacóides de plantas e algas podem funcionar de modo linear e cíclica. Durante o fluxo de elétrons linear (LEF) fotossistema I (PSI), fotossistema II (PSII) e citocromo b 6 / f em última análise, transferir elétrons da água para o NADP + 1, o que leva à geração de NADPH e ATP 2. Em contraste, cíclico fluxo de elétrons (CEF), que é conhecido por ser induzida sob diversas condições ambientais, como o estado 2 3 e 4, as condições anaeróbias resulta na redução de re do PSI oxidados através da injeção de elétrons de volta para a cadeia de transporte de elétrons. Este processo pode ocorrer tanto no lado do estroma do citocromo b 6 / f complexo 1 ou na piscina plastoquinona 5 e gera ATP, mas não NADPH 2. O objectivo do protocolo apresentado serve para demonstrar a espectrometria de massa (MS) m baseadoétodo para a análise comparativa e quantitativa de complexos multiprotein em tilacóides de Chlamydomonas reinhardtii para obter insights sobre a composição destes complexos em condições diferentes (exemplificadas comparando linhagens geneticamente diferentes). Esta abordagem foi aplicada em uma publicação por Terashima et al., Em 2012, mostrando uma Ca 2 +-regulação dependente da CEF em C. reinhardtii mediada por um complexo multiproteico, incluindo as proteínas do CAS, ANR1, e PGRL1 6. O procedimento será explicado por comparativamente a análise da composição de CEF-supercomplex em duas estirpes geneticamente diferentes, tirando assim partido de rotulagem uma das duas estirpes com azoto pesado (15 N). Resumidamente, o protocolo inclui a preparação de membranas de tilacóides, seguido de solubilização detergente e fraccionamento de complexos fotossintéticos em um gradiente de densidade de sacarose. Após o fracionamento do gradiente, frac selecionadoções de duas estirpes são misturadas com base no volume igual, separadas por SDS-PAGE seguido por digestão em gel e subsequente análise por MS quantitativa. Como mencionado acima, a CEF é induzida em diferentes condições ambientais e uma publicação de 2010 demonstra o isolamento de um funcional CEF-supercomplex de estado 2 de células bloqueadas C. reinhardtii 7, a qual foi realizada por separação tilacóides solubilizados em um gradiente de densidade de sacarose durante a ultracentrifugação. Diferente do Iwai et al. 7, o protocolo apresentado descreve o isolamento de CEF-supercomplex de anaeróbio crescido C. culturas reinhardtii, seguindo um procedimento alternativo. Isto inclui mudanças no protocolo de isolamento thylakoid bem como as diferenças relativas ao passo solubilização ea separação de complexos de proteínas por ultracentrifugação. No presente protocolo, tilacóidessão isolados mediante a aplicação do processo publicado por Chua e Bennoun 8, enquanto que os tampões usados ​​para a preparação de tilacoide por Iwai et al. continha 25 mM de Mes, 0,33 M de sacarose, 5 mM de MgCl2, 1,5 mM de NaCl (pH 6,5) como descrito 9. A solubilização foi realizada com 0,7-0,8% de detergente (de n-tridecil-β-D-maltósido) durante 30 min em gelo, no caso de Iwai e colegas de trabalho, enquanto o método de solubilização descrito aqui baseia-se no uso de 0,9% de detergente (n -Dodecil-β-D-maltósido (β-MS)) e é realizado por apenas 20 minutos em gelo. Ambos os grupos utilizaram 0,8 mg de clorofila por ml para a solubilização com o respectivo detergente. Para a separação dos complexos fotossintéticos de tilacóides solubilizadas Iwai et al. Aplicadas concentrações de sacarose entre 0,1-1,3 M, ao passo que os autores deste protocolo utilizado concentrações variando 0,4-1,3 M. A última diferença é a velocidade de centrifugação, que é menor em comparação ao eApublicação rlier. A solubilização das membranas tilacóides com detergentes não iónicos, seguido por fraccionamento de densidade de gradiente de sacarose foi já aplicado em numerosos estudos que vão desde a década de 1980 até hoje 7, 9-14 e também a aplicação da marcação metabólica das proteínas é um método generalizado no campo proteómica. A abordagem descrita aplica-se a marcação metabólica 15N para uma das duas estirpes por cultura de comparação que, na presença de azoto pesado como única fonte de nitrogénio na forma de 15 N NH 4 Cl, o que é incorporada em todos os aminoácidos que conduzem a uma massa mudar dependendo da sequência de aminoácidos do péptido. Quando a análise de uma mistura de 14 N e 15 N dentro de um MS executado, este deslocamento de massa pode ser usada para determinar a origem da amostra, para cada péptido e o péptido relativa abundância pode ser calculada representando abundâncias relativas para o correspondenteção da proteína 15. Numerosos estudos quantitativos sobre proteômica C. reinhardtii estão disponíveis, o que comparar uma quantidade definida de proteína para analisar as alterações do proteoma entre as condições experimentais (por exemplo, mudanças no proteoma de nutrientes devido a 16-19 ou luz estresse 20,21). Comparado a esses estudos, a abordagem atualmente apresentada volumes iguais de amostras são combinados e analisados. Esta configuração permite estudar o comportamento de migração das proteínas dentro da inclinação e, além disso, a análise da composição de diferentes complexos com respeito às estirpes investigadas. Este método irá ser explicada pela concentração principalmente em três proteínas: O primeiro candidato é o CAS proteína sensor de cálcio localizada-cloroplasto, que foi mostrado estar envolvida na foto-aclimatação em C. reinhardtii 22. O cálcio é considerado para ser um sinal importanteção de íons para caminhos que são ativados devido a diferentes estresses bióticos e abióticos, finalmente, levando a mudanças na expressão genética e fisiologia da célula 23 e foi proposto que os cloroplastos podem contribuir para celular Ca 2 + sinalização via proteína CAS 22,24,25. A segunda proteína é ANR1 (resposta anaeróbia 1 6), uma proteína que se mostrou ser induzida em condições de crescimento em anóxicas C. reinhardtii 26. Notavelmente, CAS, bem como ANR1 foram identificadas como subunidades de CEF-supercomplex e, além disso, utilizando abordagens genéticas reversa, foi demonstrado que ambas as proteínas funcionalmente contribuir para CEF in vivo 6, suportando o seu papel como subunidades funcionais deste complexo proteína. A terceira proteína é a proteína de tilacoide PGR5-like 1 (PGRL1), que foi mostrado estar envolvidas em CEF em Chlamydomonas 4,27, bem como em Arabidopsis 5,28 e era também IDentified no trabalho de Iwai et al. 7 Esta abordagem irá ser apresentada mostrando os resultados de duas experiências diferentes: de tipo selvagem (WT) versus (vs) uma estirpe ΔPSI 29, apresentando uma deleção do gene PSAB, que codifica para uma subunidade fotossistema essencial I, que também é parte da CEF-supercomplex e WT contra um pgrl1 knock-out tensão 4. Para cada uma destas experiências, a composição quantitativa do CEF-supercomplex entre 15 N e uma deformação de 14 N-etiquetada tem sido comparado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1135">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">Chemicals</td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Acetone</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Acetonitrile Optigrade f&#252;r LC-MS</td>
			<td style="width:427px;">Diagonal 
			website: https://www.diagonal.de/</td>
			<td style="width:119px;">9340</td>
			<td style="width:199px;">harmful, work with gloves 
			see protocol text for further precautions</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Ammonium chloride 15N</td>
			<td style="width:427px;">Cambridge Isotope Laboratories 
			website: http://www.isotope.com/cil/index.cfm</td>
			<td style="width:119px;">39466-62-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ammonium chloride 14N</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ammonium hydrogenphosphate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ammonium sulfate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td style="width:427px;">Fisher Scientific 
			website: http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex</td>
			<td>10041653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">n-Dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Formic acid&#160;&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hepes</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td>A4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Methanol</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Phosphorous acid</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Di-Potassium hydrogenphosphate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Potassium di-hydrogenphosphate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sucrose</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tricine</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Tris</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer</td>
			<td style="width:427px;">Promega 
			website: http://www.promega.de/</td>
			<td style="width:119px;">V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;"></td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">Equipment&#160;</td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Neboulizer (BioNeb cell disruptor)</td>
			<td style="width:427px;">Glas-Col 
			website: http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Centrifuge tubes (14 x 89 mm)&#160; 
			for preparation of takahashi style gradients</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Centrifuge tubes 25 x 89 mm 
			for preparation of thylakoid isolation gradients&#160;</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fuchs-Rosenthal cell couting chamber</td>
			<td style="width:427px;">Diagonal 
			website: https://www.diagonal.de/</td>
			<td style="width:119px;">449/72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Homogenizer (Potter) 50 ml&#160;</td>
			<td style="width:427px;">Fisherbrand 
			website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">10618242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Pistil for homogenizer</td>
			<td style="width:427px;">Fisherbrand 
			website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">105252220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge)</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;"></td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">Other</td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Antibodies&#160;</td>
			<td style="width:427px;">Agrisera 
			website: http://www.agrisera.com/en/index.html</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15n metabolic labeling and quantitative mass spectrometry

O protocolo introduzido fornece uma ferramenta para a análise de complexos multiproteicos na membrana tilacoide, revelando insights composição complexa, sob diferentes condições. Neste protocolo a abordagem é demonstrada através da comparação da composição do complexo de proteínas responsáveis ​​pela cíclico fluxo de electrões (CEF) na Chlamydomonas reinhardtii, isolado a partir de estirpes geneticamente diferentes. O processo compreende o isolamento de membranas de tilacóides, seguida pela sua separação em complexos multiproteicos por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose, SDS-PAGE, espectrometria de imunodetecção e comparativa, quantitativa de massa (MS) com base na marcação metabólica diferencial (14 N / 15 N) do cepas analisadas. Tilacóides solubilizados detergentes são carregados em gradientes de densidade de sacarose na concentração igual clorofila. Após ultracentrifugação, os gradientes são separados em fracções, as quais foram analisadas por massa spectrometry baseado em igual volume. Esta abordagem permite a investigação da composição dentro das frações de gradiente e, sobretudo, para analisar o comportamento de migração de proteínas diferentes, com especial incidência sobre ANR1, CAS, e PGRL1. Além disso, este método é demonstrado pela confirmando os resultados com immunoblotting e, adicionalmente, apoiando as descobertas de estudos anteriores (a identificação e a migração dependentes do PSI de proteínas que foram previamente descritos para fazer parte da CEF-supercomplex como PGRL1, FNR, e cit f). Notavelmente, esta abordagem é aplicável para tratar uma ampla gama de questões para as quais este protocolo podem ser adotadas e, por exemplo utilizados para análises comparativas de composição complexa multiprotein isolado de condições ambientais distintas.

A abordagem proteômica quantitativa introduzida tem por objetivo caracterizar a composição dos complexos multiprotein em tilacóides demonstrados pela análise comparativa dos componentes CEF-supercomplex em geneticamente diferente C. reinhardtii cepas. O método descrito foi aplicado com sucesso por Terashima et al. 6 e compreende o isolamento de membranas de tilacóides de anaeróbios cultivadas culturas, seguido por detergente de solubilização. Subsequentemente, as amostras são carr...

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A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A abordagem descrita comparativa, quantitativa proteómica visa obter conhecimentos sobre a composição de complexos multiproteicos sob diferentes condições e é demonstrada através da comparação geneticamente diferentes estirpes. Para a análise quantitativa de volumes iguais de diferentes fracções de um gradiente de densidade de sacarose são misturados e analisados ​​por espectrometria de massa.

Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

a-new-approach-for-comparative-analysis-multiprotein-complexes-based

Research

JoVE Journal

Biology

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

12.1K visualizações.  University of Münster.  A abordagem descrita comparativa, quantitativa proteómica visa obter conhecimentos sobre a composição de complexos multiproteicos sob diferentes condições e é demonstrada através da comparação geneticamente diferentes estirpes. Para a análise quantitativa de volumes iguais de diferentes fracções de um gradiente de densidade de sacarose são misturados e analisados ​​por espectrometria de massa. 

Vídeo: A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biologia

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

A avaliação quantitativa do Lipidome fermento usando Electrospray Espectrometria de Massa de Ionização

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analisar grandes complexos de proteínas por espectrometria de massa estruturais

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados ​​Celular

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Amida de hidrogênio / deutério Exchange &amp; MALDI-TOF Análise Espectrometria de Massa de PAK2 Ativação

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado<sup&gt; 15</sup&gt; Etiquetagem N Metabólica, imunoprecipitação, Quantitativa Espectrometria de Massa e Affinity Modulação

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabólica Labeling e Membrana Fracionamento para Comparative Analysis proteômica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensão de células

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Uma nova técnica de Análise Quantitativa de perda de cabelo em ratos usando Análise Tons de Cinza

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

Quantificação de Estoicometria de Acetilação e Succinilação de Lisinas Proteicas em Sítios Específicos Usando Espectrometria de Massa de Aquisição de Dados Independente

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...