Os autores agradecem os membros do grupo Sharon para a sua revisão crítica, e por suas contribuições ao manuscrito. Estamos gratos pelo apoio dos Programas Morasha e Bikura, a Israel Science Foundation (Grant n. º s 378/08 e 1823-1807), o Josef Cohn Minerva Center for Research biomembrana, a Família Chais Fellows Program para novos cientistas, o Abraham e Sonia Rochlin Foundation, o Family Trust Wolfson Charitable, a Helen e Milton A. Kimmelman Centro de Estrutura Biomolecular e Montagem; o espólio de Shlomo e Beirzwinsky Sabine; Meil ​​de Botton Aynsley, e Karen Siem, Reino Unido. Somos gratos a Dan Tawfik e Yadid Itamar por nos dar a amostra variante lectina.

Parte 1: Preparação de ouro revestidas de capilares para nanofluxo ionização electrospray Análise de não-covalente complexos é normalmente realizada por meio de ionização electrospray nanofluxo (Nesi) 6, usando capilares de vidro ou de quartzo, que foram puxados para uma ponta fina (~ 1 mícron de diâmetro interno) e revestida com material condutor (geralmente de ouro) . Capilares estejam disponíveis ready-to-use de fontes comerciais (Objetivo Novo ou Proxeon), no entanto, pode ser mais rentável para prepará-los em casa: <ol><li> Vara duas tiras de adesivo dupla face para a parte inferior de uma placa de Petri, 2 cm. Coloque uma vareta de vidro (8 cm x 5 mm) no centro de uma das almofadas. O adesivo vai realizar os capilares no local, e da vareta de vidro apoiará os capilares preparado, e manter as pontas de quebrar (Fig. 1). </li><li> Use vidro borossilicato capilares, 1,0 mm de diâmetro externo x 0,78 mm id (usamos embalagens de 500 unidades de parede fina borosilicato capilares da Warner Instruments, cat. Não. G100TF-4). Inserir um capilar para o puxador de agulha (usamos modelo P-97 do Instrumento Sutter Co.). Grampo do capilar suavemente no lugar, e ajustar a sua posição de modo que fica no centro do filamento da agulha extrator de aquecimento. Aperte os grampos com cuidado, até o capilar é mantido firme em ambas as extremidades. </li><li> Puxe o capilar, utilizando um programa pré-definido. Cada capilar puxado dará origem a duas finais, em forma de vasos capilares. O processo de programação do extrator é uma de tentativa e erro, até que uma forma aceitável dica é obtido. Usamos o seguinte programa: <table border="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Calor </td><td> Puxe </td><td> Vell </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 750 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 700 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 750 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table></li><li> Remove os capilares retirado o instrumento e fiscalizar as dicas, descartando qualquer que são deformados ou quebrados. Use uma pinça blunt (usamos pinças de posicionamento de precisão CK), para colocar os vasos capilares na placa de Petri. A base do capilar deve ser anexado ao adesivo ea parte superior deve se inclinar sobre a haste de vidro, com a ponta apontando para cima. </li><li> Uma vez que a placa de Petri está cheia (cerca de 80 capilares se encaixam em um prato de 10 cm de diâmetro), insira a placa no ouro sputter coater (usamos modelo não. EMS550, de EMS). Certifique-se que o fornecimento de gás é escolhido de acordo com as instruções do fabricante, e ativar um ciclo de revestimento pré-definidos (usamos pressão Argon 4 psi, a uma pressão de vácuo de 5 x 10 -2 mbar, uma corrente de 45mA, e um tempo de revestimento de 1 min, por 3-6 ciclos, até os capilares são uniformemente dourada). </li></ol> Parte 2: Preparação da amostra <ol><li> Baixas concentrações micromolar de amostra são necessários (1-20 mM). Se necessário, concentrar a amostra usando dispositivos de ultrafiltração centrífuga (por exemplo, Vivaspin de Sartorius, ou NanoSep da Pall Corporation). É recomendável que você verificar a adsorção do complexo de proteínas para a membrana dispositivo, antes de usar. </li><li> Muitas vezes, os buffers de purificação ou soluções de armazenamento do complexo de proteínas não são compatíveis com Nesi, para o qual apenas soluções voláteis podem ser usadas. Portanto, buffer de troca é necessária. Este passo crucial, em que todos os vestígios de sais, as moléculas de buffer ou qualquer outro não-volátil adutos, como o glicerol, a TDT, ou EDTA são removidos, determina a qualidade dos espectros. Normalmente, a solução aquosa de acetato de amônio é usado, em uma concentração entre 5 mm e 1 M, e em 08/06 pH. Buffer de troca pode ser realizada utilizando uma coluna de filtração em gel de microcentrífuga (por exemplo, Micro Bio-Spin 6 colunas de cromatografia de Bio-Rad). Este passo pode ser repetido 1-3 vezes com uma diluição mínima (menos de um factor de 1,3 por dispositivo 5), até que a troca máxima é alcançada. Se ambos concentração e troca de buffer são necessárias, estas podem ser feitas em conjunto, utilizando ultrafiltração centrífuga (e, g., Vivaspin de Sartorius, ou NanoSep da Pall Corporation). </li></ol> Parte 3: Calibração de espectrômetro de massa para medições de massa de alta A maioria dos experimentos conduzidos na proteína multi-complexos são realizadas usando um electrospray nano quadrupolo-tempo-of-flight (Q-TOF) instrumento. É sugerido que você use um filtro de massa quadrupolar ajustado para baixas freqüências, para permitir a transmissão ea massa análise de íons com alta m / z valores 7,8. Étambém recomendou que entradas de gás 7,8 ou 9 mangas ser adicionado ao instrumento no guia de íons em primeiro lugar, para permitir o controle da pressão na fase de vácuo em primeiro lugar. Este último permite a otimização da transmissão, e dessolvatação de íons muito grande 7-9. Atualmente, comercial ESI-TOF e Q-TOF instrumentos estão disponíveis em diversos fabricantes (por exemplo, Waters, SCIEX, Bruker, ou Agilent), que podem ser modificados de forma relativamente fácil e econômica, para aplicações nativas MS 7,8. É possível, no entanto, para usar as configurações padrão ou ToF QToF em instrumentos como LCT ou QToF1 (Waters) para adquirir espectros de massa para complexos até 1 MDA, sem a necessidade de modificações de hardware 5. O protocolo descrito a seguir foi realizado em um instrumento Synapt (Waters). <ol><li> Prepare 100 mg / ml de CsI em água purificada. CsI ​​é usado para a calibração de massa de alta como os clusters de sal isoladamente cobrado (CSI) n Cs + se estendem por uma vasta massa de largura, a partir de 393 m / z para mais de 10.000 (Fig. 2). </li><li> Usando uma pinça sem corte, faça um capilar revestido da placa de Petri e 2μL carga da solução CsI no capilar, usando uma ponta de GeLoader Eppendorf. </li><li> Inserir o capilar no suporte capilar, e ajuste o capilar de tal forma que a ponta é de aproximadamente 10 mm de distância da borda do titular. </li><li> Deslize a solução para a ponta do capilar manualmente ou usando um adaptador de spin down. </li><li> Coloque o capilar sob um microscópio óptico e aparar a ponta, utilizando as afiadas AA-tipo pinça. </li><li> Conecte o suporte à interface capilar ES nanofluxo. Gire o estágio xyz para trás para evitar danos ao capilar, e empurre o palco para a sua posição ativada. O capilar deve ser colocado 1-10 mm do orifício de cone. </li><li> Aplique a tensão capilar (1050-1400 V) e pressão nanofluxo baixa (0,00-0,03 bar) até spray é iniciado, em seguida, tentar reduzir a pressão nanofluxo para um valor mínimo. </li><li> Otimizar a intensidade do sinal, ajustando a localização do palco xyz, a tensão capilar, a pressão nanofluxo, eo fluxo de gás dessolvatação. </li><li> Para detectar uma ampla gama de massa CsI pico da série, as tensões de aceleração deve ser otimizada (nós usamos os seguintes parâmetros: 1,3-1,7 kV capilar, cone amostra 80-150V, extração de cone 03/01 V). </li><li> Para otimizar a transmissão de íons de alta massa, que exigem condições dessolvatação suave, a pressão de apoio na fase inicial de vácuo, entre a fonte eo analisador, deve ser levantada. Isto pode ser conseguido com cuidado reduzindo a condutância da linha de vácuo de origem para a bomba de deslocamento, por parte de fechar a válvula de isolamento (SpeediValve). , A fim de definir o ponto ótimo, este último deve ser feito durante o monitoramento do efeito da intensidade do sinal (geralmente usamos mBar 3,0-6,5). </li><li> Coletar cerca de 30 scans em 1 scan / seg, em uma faixa de m / z entre 1.000 a 15.000 m / z. </li><li> Após a aquisição, calibrar o TOF usando a tabela de calibração adequadas. </li></ol> Parte 4: MS análise de complexos de proteínas intactas <ol><li> Carregar sua amostra, como descrito (Parte 3, secções 2-5), e iniciar spray. </li><li> Comece por otimização inicial do spray (Parte 3, secções 6-9), até que o sinal é detectado. A posição exata dos estados de carga é a proteína-dependente, no entanto, pode ser previsto, utilizando a relação entre a massa de íons e estado de carga média, assim: (Z médio) 10: Z = 0,0778 av √ (m), em que m é a massa do complexo em Daltons. Para evitar a dissociação complexo, não aquecem a fonte de íons: ou mudar o aquecedor desligado, ou manter a temperatura abaixo de 40 ° C. </li><li> Variar a posição capilar, cone de amostra e tensões extractor para maximizar a transmissão de íons, e verificar as mudanças resultantes nos espectros. Um possível ponto de partida poderia ser tensão cone 100 V; extractor cone: 1 V; tensão capilar 1,5 kV. Otimizar esses parâmetros, em combinação com a pressão nanofluxo. </li><li> Para melhorar dessolvatação e retirar a água residual e componentes buffer, aumentar a tensão de polarização ea pressão do gás na célula de colisão. Esta etapa deve ser realizada com cuidado, para evitar a dissociação do complexo. Tensões de polarização típica estão dentro da faixa de 10-100 V, com um fluxo de gás armadilha de 10-10 ml / min (Fig. 3). Ajuste manual da configuração RF e perfil quadrupolo pode melhorar a transmissão de íons de alta massa. </li><li> Ajuste Trap e energias de colisão de Transferência. Muitas vezes, altas tensões são necessárias para a transmissão de íons de massa elevada (geralmente dentro da faixa de 10-30 V). Neste ponto, é importante para evitar a colisão induzida dissociação do complexo. </li><li> Após um sinal estável é reached, recomenda-se que a pressão ea tensão capilar nanofluxo ser reduzida para valores mínimos, mantendo pulverização estável. </li></ol> Parte 5: espectrometria de massas Tandem: complexos de proteína dissociar <ol><li> Uma vez que um sinal ótima e estável foi obtida, selecione um íon precursor. Definir o centro de massa e largura de isolamento (geralmente usamos uma resolução LM, de 12, e uma resolução de HM entre 13 e 15). Use uma ampla variedade de massas para detectar a massa de alta / products carga baixa dissociação. É recomendável que você defina o intervalo de m / z para o nível máximo, e depois reduzi-lo para os valores desejados. Sugerimos ainda a superposição de MS e MS / MS espectros, para validar o isolamento do íon precursor escolhido. </li><li> Para executar MS / MS, dissociar o íon precursor, aumentando a energia de colisão (CE) ea pressão na célula de colisão. Aumentar ou Armadilha ou Transferência CE gradualmente, em passos de 10-20V, e elevar a pressão do gás de colisão para 0-5 ml / min (valores comuns). Monitorar as mudanças nos espectros até que as condições ótimas de ativação são alcançados. Energia de ativação elevada pode induzir a dissociação de uma ou mais subunidades do complexo intacta, e esclarecer as afinidades interação de diferentes subunidades. Normalmente usamos Argon como um gás de colisão nas células Armadilha / Transferência, embora os benefícios de usar um gás mais pesado (por exemplo, Xe ou SF 6) foram relatados, no entanto, esses gases são substancialmente mais caros 11 (Fig. 3). </li><li> Recomenda-se que mais de um estado de carga ser selecionado para MS / MS análise. No caso de componentes sobrepostos, a aquisição de um conjunto de espectros em tandem MS vai ajudar a resolver a série de carga das diferentes populações. Além disso, os estados superiores carga vai se dissociam mais facilmente, em comparação aos estados carga mais baixa 12. </li><li> Além da caracterização do complexo intacta, sugere-se que subcomplexes menores em solução será gerado, em condições moderadamente desnaturação. As análises de MS e MS / MS de subcomplexes formam a base para a definição da arquitetura subunidade do complexo 13. De ruptura parcial da subunidade subunidade interações, gradualmente adicionar solventes orgânicos (por exemplo, metanol, isopropanol ou acetonitrila) até uma concentração de 50%, ou alterar o pH da solução pela adição de amônia ou ácido fórmico (até uma concentração de 4 %). </li><li> Para determinar as massas das unidades individuais que compõem o complexo, é importante para adquirir um espectro em condições de desnaturação. Isto pode ser efectuado através de Zip Tip-C 4 (Millipore), com uma relação água / acetonitrila 25:75, com 1% de ácido fórmico como o solvente de eluição. </li></ol> Parte 6: Processamento de dados e análise <ol><li> Os dados são analisados ​​off-line, usando um programa de análise espectral para MS espectros. Normalmente usamos o programa MassLynx (Waters). </li><li> Para espectros que abrangem toda uma gama m / z de largura, recomendamos que diferentes regimes de alisamento e parâmetros centróide ser aplicado para a alta e baixa m / z regiões, de modo a reflectir a diferença na resolução de pico destas regiões. </li><li> Para identificar série de carga e calcular os estados de carga e massas, o &quot;manual encontrar&quot; função de MassLynx pode ser aplicada. Em casos de espectros de massa complexa com componentes que se sobrepõem, o cálculo manual de massas pode ser mais fácil. </li><li> Para facilitar estes processos de atribuição, software adicional pode ser usado, por exemplo: MaxEnt para espectros deconvolução 14, SOMMS para a montagem de pico e 15 de simulação, e SUMMIT para atribuir a composição e estequiometria da subcomplexes proteína e gerar redes de interação protéica 13,16,17 . </li></ol> Parte 7: Resultados Representante <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Preparando-se revestidas de ouro nano-electrospray capilares. A. Coloque duas tiras dupla face adesiva a uma placa de Petri, 2 cm. Para apoiar os vasos capilares preparado, coloque uma vareta de vidro (8 cm x 5 mm) no centro de uma das almofadas. B. Cole a extremidade sem corte dos capilares preparado para o adesivo, e magra a ponta da vareta de vidro. C. Uma vez que a placa de Petri é preenchido com os capilares preparado, revesti-los com o ouro até que uma fina película de ouro é depositado uniformemente sobre a superfície externa dos capilares. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Calibração de massa de alta usando íons iodeto de césio. Os grandes aglomerados e monisotopic de CsI tornaram o composto de escolha para a calibração de espectrômetros de massa para análise de massa elevada. A série de picos igualmente espaçados se estendem por uma ampla gama, de m / z 393 para mais de 10.000. Eles são ASSIGned às isoladas cobrado aglomerados sal da composição geral (CSI) n + Cs. Sinais adicionais entre os picos principais são causadas por espécies de duplo e triplo-carregada da série; [(CSI) n CS2] 2 + e [(CSI) n Cs3] 3 +, respectivamente. Aumentando a pressão na fase inicial de vácuo é essencial para detectar os clusters de alta massa. O efeito da pressão sobre os picos de alta massa é demonstrado nos Painéis A. e B. readbacks com pressão de 1,2 e 5,3, respectivamente. C. Expansão do espectro de massa mostrado em B. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Nanofluxo espectros de massa por electrospray de uma lectina pentamérica. A. A espectrometria de massa de um complexo variante lectina (derivado de lib1 B7 por evolução dirigida 18) dá origem a uma distribuição de carga de estado entre 3.000 e 5.000 m / z, no entanto, devido à dessolvatação inadequada dos íons, os picos são largos. Comparação de painel de A. e B. mostram o efeito de aumentar a voltagem de 4V (A). A 15V (B). Sobre a largura do pico. Este aumento nas condições de aceleração faz com que o stripping de água residual e de componentes do tampão, produzindo um espectro altamente resolvido. A massa medida (60.240 ± 38 Da) corresponde a um complexo pentamérica. C. O estado de carregamento 15 foi, então, selecionados para análise em tandem MS (sombreados em cinza no painel B). D. O aumento da energia de colisão provoca a libertação de um monômero altamente carregada, centrado em 1.664 m / z, e um complexo despojado tetramérica, na faixa de 5.000 - 8.000 m / z. Todos os espectros foram obtidos a partir de uma amostra contendo 20 mM de solução em acetato de amónio 0,5 M.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+multiplexed+mass+spectrometric+analyses+of+endogenously+expressed+yeast+nuclear+and+cytoplasmic+exosomes.">Comparative multiplexed mass spectrometric analyses of endogenously expressed yeast nuclear and cytoplasmic exosomes.</a> J Mol Biol. 385 (4), 1300-1313 (2009).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+the+19S+proteasome+lid:+insights+from+MS+of+intact+complexes.">Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes.</a> PLoS Biol. 4 (8), e267-e267 (2006).</li><li>Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+reveals+modularity+and+a+complete+subunit+interaction+map+of+the+eukaryotic+translation+factor+eIF3.">Mass spectrometry reveals modularity and a complete subunit interaction map of the eukaryotic translation factor eIF3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18139-18144 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para adquirir a atenção espectros de alta qualidade deve ser dada às etapas de preparação de amostra, que incluem concentração da amostra e troca de buffer. Mais de amostras diluídas renderá um sinal de baixa, enquanto que amostras altamente concentrada pode ser bastante viscoso, e bloquear a agulha electrospray. Além disso, os aditivos solução, tais como sais, glicerol, detergentes, íons metálicos e agentes redutores (DTT ou β-mercaptoetanol), tendem a aderir na superfície externa das proteínas, e causar alargamento dos picos. Portanto, a fim de alcançar o bem-resolvida picos, esses componentes devem ser adicionados nas concentrações mais baixas possíveis. Outro parâmetro importante é a posição do nanofluxo capilar, em relação ao orifício espectrômetro de massa. Encontrar o &quot;sweet spot&quot; pode ser um desafio para usuários inexperientes, no entanto, que influencia significativamente a qualidade dos espectros. Também é importante analisar o nanofluxo capilar antes do início do spray. O tamanho da gota é uma função do diâmetro da ponta, que deve ser ~ 1 Hm. Pequenas gotículas levar a ionização mais eficiente, e, portanto, ser vantajoso. Também é importante para validar que não há bolhas de ar dentro do capilar que possam bloquear o fluxo, e que o revestimento de ouro não é despojado do capilar durante a aquisição, em caso afirmativo, mais aparar a ponta. Tenha em mente que uma quantidade excessiva de amostra aumentará a possibilidade de otimizar as condições MS, tais como a tensão capilar, voltagens de aceleração, pressão e energia de colisão. No geral, os procedimentos explicados no protocolo têm sido usados ​​para determinar a composição, estequiometria e arquitetura de complexos de proteínas numerosos (ver comentários 2,3,4). Análise de grandes complexos MDa como o ribossomo e 19 capsídeos do vírus altamente ordenada 20-22, na definição de substrato de ligação para máquinas moleculares 23-25, ou a caracterização das redes de interação subunidade 26,17,16,17,27,28 servir como apenas alguns exemplos do valor desta abordagem.

Requisitos da amostra: <table border="1"><tr><td> Amostra </td><td> Exigência </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Volume </td><td> 1-2 mL </td><td> Por capilar </td></tr><tr><td> Concentração </td><td> 1-20Hm </td><td> Por complexos </td></tr><tr><td> Amortecedor </td><td> Aquanos tampão volátil como o acetato de amônio em pH = 6-8 </td><td> Tipicamente 5 mM-1M </td></tr><tr><td> Detergente </td><td> Mínimo </td><td> Aglomerados de moléculas de detergente produzir picos largos e sem solução </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Mínima (até 5%) </td><td> Adere inespecificamente às proteínas e, conseqüentemente, ampla picos são observados </td></tr><tr><td> Solventes orgânicos </td><td> Até 50% </td><td> Pode desnaturar proteínas complexos </td></tr><tr><td> Ácidos </td><td> Até 4% </td><td> Desnaturar complexos de proteína </td></tr><tr><td> Sais </td><td> Mínimo </td><td> Adutos de sal levar a picos largos e sem solução </td></tr><tr><td> TDT </td><td> Mínimo </td><td> M 02/01 pode estar presente </td></tr><tr><td> Agentes quelantes </td><td> Mínimo </td><td> Acima de 250 mM levar à formação de aduto extensa </td></tr></table>

analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry

Células vivas controlar e regular seus processos biológicos por meio da ação coordenada de um grande número de proteínas que se reúnem em uma matriz de dinâmica, proteína multi-complexos 1. Para obter uma compreensão mecanicista dos vários processos celulares, é crucial para determinar a estrutura de complexos de proteínas tais, e revelam como a sua organização estrutural determina sua função. Muitos aspectos da proteína multi-complexos são, no entanto, difícil de caracterizar, devido à sua natureza heterogênea, a estrutura assimétrica e dinâmica. Portanto, novas abordagens são necessárias para o estudo dos níveis de organização superior de proteína. Uma das ferramentas de biologia estrutural emergentes para a análise de complexos macromoleculares é a espectrometria de massa (MS) 2-5. Este método produz informações sobre a composição das proteínas complexas, estequiometria subunidade, e topologia estrutural. O poder do MS deriva de sua alta sensibilidade e, como conseqüência exigência de amostra, baixo, o que permite o exame de complexos de proteínas expressas em níveis endógenos. Outra vantagem é a rapidez da análise, que permite o monitoramento de reações em tempo real. Além disso, a técnica pode medir simultaneamente as características das populações separadas co-existentes em uma mistura. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para a aplicação de MS estruturais para a análise de conjuntos de proteínas de grande porte. O procedimento começa com a preparação de ouro revestidas de capilares para nanofluxo ionização electrospray (Nesi). Em seguida, continua com a preparação da amostra, enfatizando as condições de buffer que deve ser compatível com Nesi por um lado, e permitem manter intacta complexos, de outro. Em seguida, explicar, passo-a-passo, como otimizar as condições experimentais para medições de massa de alta e adquirir MS e tandem MS espectros. Finalmente, o gráfico de processamento de dados e análises que se seguem. Ao invés de tentar caracterizar cada aspecto dos conjuntos de proteínas, este protocolo apresenta procedimentos básicos MS, permitindo o desempenho de MS e MS / MS experimentos sobre a não-covalente complexos. No geral, nosso objetivo é fornecer aos pesquisadores não familiarizados com o campo da MS estrutural, com o conhecimento das principais ferramentas experimentais.

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Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Espectrometria de massa tem provado ser uma ferramenta valiosa para a análise de grandes complexos de proteínas. Este método permite insights sobre a arquitetura de estequiometria, composição e global da subunidade multi-montagens. Aqui, descrevemos, passo-a-passo, como realizar uma análise de espectrometria de massa estrutural, e caracterizar as estruturas macromoleculares.

Analisar grandes complexos de proteínas por espectrometria de massa estruturais

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

analyzing-large-protein-complexes-by-structural-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biology

24.0K visualizações.  Weizmann Institute of Science. Espectrometria de massa tem provado ser uma ferramenta valiosa para a análise de grandes complexos de proteínas. Este método permite insights sobre a arquitetura de estequiometria, composição e global da subunidade multi-montagens. Aqui, descrevemos, passo-a-passo, como realizar uma análise de espectrometria de massa estrutural, e caracterizar as estruturas macromoleculares.

Vídeo: Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biologia

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-wave Ion Mobility Spectrometry massa: Basic Procedimentos para Análise Experimental Protein Complex

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

Pressão atmosférica Imagem Molecular de tecidos biológicos e Biofilmes por LAESI Espectrometria de Massa

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Análise direta de células individuais por Espectrometria de Massa à pressão atmosférica

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Perfil de metiltransferases e Outros S-Adenosil- L Homocisteína-Proteínas de Ligação de captura por Espectrometria de Massa Compound (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Profiling Proteome Redox tiol Usando Isótopos Espectrometria de Massa Tagging

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado<sup&gt; 15</sup&gt; Etiquetagem N Metabólica, imunoprecipitação, Quantitativa Espectrometria de Massa e Affinity Modulação

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa