O objetivo central para o desenvolvimento da técnica csBN-MS foi obter acesso abrangente à organização e montagem de complexos proteicos que fundamentam a transdução de sinais na membrana plasmática de vários tipos de tecidos e órgãos. atualmente, o CSBN-MS fornece a maior versatilidade de resolução para análise do complexo proteico nativo e sua composição subunidade, em especial no que diz respeito às proteínas da membrana. Embora a técnica csBN-MS tenha sido desenvolvida para analisar misturas complexas de conjuntos de proteínas de membrana no cérebro de roedores, ela pode ser facilmente adaptada à análise de qualquer tipo de amostra biológica.
Um dos passos-chave do nosso método é a incorporação da peça de gel e seu alinhamento correto ao plano de corte antes de cortar. Tenha cuidado para não rasgar ou comprimir o gel e certifique-se de que ele não está inclinado para o plano de corte, pois isso reduziria a resolução da análise. Nossa técnica csBN-MS tem várias etapas práticas que são cruciais para bons resultados.
É mais fácil mostrar como executar essas etapas em detalhes do que apenas descrevê-las. Para iniciar este procedimento use um misturador de gradiente de duas câmaras agitado conduzido por uma bomba para lançar um gel linear ou um gradiente de poros hiperbólico. Prepare soluções para a câmara de mistura frontal e câmara de reservatório, conforme descrito no protocolo de texto.
Inicie o agitador e adicione 30 microliters de APS e 2,5 microliters de TEMED à solução na câmara frontal. Em seguida, ligue a bomba e abra a válvula dianteira. Após aproximadamente um minuto, adicione 90 microliters de APS e cinco microliters de TEMED à câmara do reservatório e abra a conexão da câmara.
Deixe o gel polimerizar lentamente e completamente por pelo menos 24 horas à temperatura ambiente para gerar um gradiente de tamanho de poros homogêneo. Se mantido úmido, o gel polimerizado pode ser armazenado em pé a quatro graus Celsius por até uma semana. Em seguida, prepare as ranhuras de carregamento inserindo os espaços apropriados entre as placas de vidro para separar entre 0,5 e 2,0 miligramas de proteína.
As ranhuras devem ter pelo menos três centímetros de largura. Para os buffers de corrida, prepare um tampão de cátodo em pé composto por 50 milimolars tricine, 50 milimolares Bis-Tris e 0,01% Coomassie G-250. Prepare um tampão de ânodo padrão composto por 50 mililitros Bis-Tris.
Solubilize aproximadamente 2,5 miligramas de membrana e dois mililitros de tampão de solubilização contendo 1% de detergente não desnaturado no gelo por 30 minutos. Em seguida, ultracentrifuuge a 130.000 vezes G por 11 minutos. Concentre o solubilisato em um gradiente curto de passo de sacarose de 50%20% por ultracentrifugação a 400.000 vezes G durante uma hora.
Depois disso, retire o gradiente de sacarose da parte inferior do tubo, adicione 0,05% Coomassie G-250 ao solubilisato e carregue a amostra no gel. Execute um BN-PAGE preparatório a 10 graus Celsius durante a noite usando um protocolo de tensão de três etapas, conforme descrito no protocolo de texto. Depois que o gel tiver executado escaneie os géis para fins de documentação, mantendo-o entre as placas de vidro.
Inspecione a qualidade da separação do gel. Em seguida, dissimule as placas e extirver os trechos de pista de interesse. Conserte as pistas duas vezes com 30% de etanol e ácido acético de 15% por pelo menos 30 minutos.
Transfira a amostra do meio de incorporação e permita que ela mergulhe e equilibre por pelo menos duas horas, mantendo a placa de gel em câmera lenta em um agitador orbital. Em seguida, corte as faixas de gel fixa em seções exatamente paralelas à frente de migração de proteínas, ou padrão de banda. Coloque cada seção em um suporte de filme plástico com dimensões iguais para facilitar o manuseio.
Transfira as pistas para um tubo aberto com rolhas que estão fechadas na parte inferior e perfuradas centralmente na parte superior, ambas precisamente alinhadas com as extremidades superior e inferior da seção de gel. Mergulhe o cilindro no nitrogênio líquido brevemente para iniciar rapidamente a solidificação. O meio de incorporação transparente solidifica em segundos e se torna branco na cor.
Encha a cavidade com meio de incorporação, mergulhe brevemente o cilindro em nitrogênio líquido e, em seguida, deixe congelar completamente a menos 20 graus Celsius por várias horas. Após a desmontagem, remova a película plástica e transfira o bloco com a seção de gel incorporado para um cilindro de metal resfriado. O cilindro tem maior diâmetro e selado por fora com meio de incorporação.
É colocado em um suporte plano. Encha o cilindro com meio de incorporação e congele bem como mencionado anteriormente. Repita este procedimento com o outro lado do cilindro para obter um bloco sólido com uma superfície inferior coplanar.
Em seguida, remova o bloco do cilindro e use o meio de incorporação para colar-o a um suporte de metal pré-resfriado. Insira o suporte de metal na máquina de criosco. O suporte deve estar cuidadosamente alinhado em relação ao plano de corte.
Deixe que o bloco se equilibre até a temperatura ideal para o processo de corte. Após esta colheita, o gel corta um após o outro com uma espessura final desejada de 0,25 milímetros de tamanho de passo e transferi-los individualmente para tubos de reação com baixas propriedades de ligação proteica. Em seguida, as fatias são submetidas à digestão trippética e análise espectrométrica de massa.
Este protocolo estende a aplicação de perfil complexome de alta resolução a membranas não mitocondriais expressando proteínas de baixa abundância. A separação complexa mostra bandas de proteínas fortemente manchadas com muito poucos artefatos migratórios. Desvios de sinais de peptídeos em massa e tempo de retenção indicam uma taxa muito baixa para atribuição de volume de pico falso positivo.
As variações run-to-run são facilmente eliminadas pelo redimensionamento dos conjuntos de dados de volume de pico. As informações resultantes da intensidade do peptídeo são então usadas para reconstruir 2545 perfis proteicos de abundância relativa. A relevância do tamanho da etapa de amostragem de gel para a resolução de complexos proteicos foi avaliada pela junção de conjuntos de dados de fatias adjacentes.
A 0,25 milímetros, a separação de tamanho das populações complexas associadas ao TPC1 está muito bem de acordo com os resultados da análise de manchas ocidentais. A junção de mais de duas fatias aboli a discriminação das subpopulações complexas do TPC1. Por fim, a análise fornece informações sobre complexos bem caracterizados e demonstra a existência de novas subunidades e montagens complexas.
Para a ferritina, os perfis de subunidade ajustados para sua abundância relativa sugerem a existência de pelo menos três isoformas complexas com distintas estoquitometrias de cadeia pesada/leve. Em contraste, os complexos nicalin-nomo1, o complexo núcleo gama-secretase, e as máquinas GPI-transamidase mostram proporções fixas de abundância de suas subunidades principais ao longo de toda a gama de tamanho e independentes da associação com proteínas adicionais. O parâmetro-chave da análise da CSBN-MS é a resolução efetiva dos complexos, que é determinada pela bioquímica amostral, qualidade do gel BN, alinhamento adequado durante a incorporação e fatiamento e qualidade dos dados adquiridos de MS.
O pentear csBN-MS com rotulagem de isótopos de proteínas e amostras permitirá a comparação direta de complexos em diferentes estados fisiofisiológicos, biológicos ou de desenvolvimento. csBN-MS realizada em membranas do cérebro de roedores revelou a enorme diversidade de receptores, canais de íons e transportadores em relação à sua composição subunidade e sua função, e será fundamental para a análise da estrutura 3D nas preparações nativas.
