Os autores gostariam de agradecer Eliana Beraldi para a realização de transdução viral de linhagens de células tumorais e Ben Deeley para sua instrução sobre o uso do pequeno animal plataforma ultra-sonografia. Este projecto foi apoiado pelo Sistema Alemão Foundation (DFG; JA 2117/1-1: 1), o Instituto de Pesquisa Canadian Cancer Society e uma Mentored Médico Scientist Award de Vancouver Coastal Research Institute Health. A plataforma ultra-sonografia foi financiado pela Fundação Canadense para Inovação.

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care (CCAC). O protocolo foi aprovado pelo Comitê Animal Care, da Universidade de British Columbia (número do protocolo: A10-0192). 1. Preparação de Linhas Celulares <ol><li> Confirmar a identidade das respectivas linhas celulares de cancro da bexiga humana por DNA fingerprinting 7. </li><li> Para a análise de crescimento de tumores de xenoenxerto por bioluminescência, transfecção de linhas celulares com uma construção lentiviral portador do gene da luciferase de vaga-lume 3. </li><li> Descongelar e expandir linhas de células existentes no meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ° C em atmosfera húmida 5% de CO2. Passagem das células, pelo menos 3x mas evitar tempos de cultura superior a 3 meses. </li></ol> 2. Preparação da suspensão celular <ol><li> Descongele Matrigel. Manter a temperatura abaixo de4 ° C para evitar o aumento da viscosidade do gel. </li><li> Tripsinizar as células a uma confluência de 70% e suspensão em meios de crescimento normal. </li><li> Contar o número de células com um hemocitômetro ou contador automático de células. </li><li> Girar a suspensão de células durante 5 min a 200 x g. Remover o sobrenadante. </li><li> Adicionar o volume apropriado de meio DMEM (10% de FBS) e Matrigel (1:1) de modo a alcançar a concentração de células desejada, que é dependente da linha celular utilizada e da cinética de crescimento desejada (8-15 x 10 6 / ml). O volume injectado de suspensão de células do tumor será de 40 ul. </li><li> Misture bem por pipetagem cima e para baixo (P1000), evitar a criação de bolhas de ar na suspensão. </li></ol> 3. Preparação de Animais Nota: Devido à necessidade potencial de cateterização transuretral no passo 4.7, camundongos fêmeas são o sexo preferido neste modelo animal. <ol><li> Camundongos casa de acordo com gu institucional e cuidados com os animais nacionalidelines. Obter aprovação comitê de ética para todos os experimentos envolvendo ratos. </li><li> Anestesiar os ratos com 3% de mistura de isoflurano / oxigénio. Confirme anesthetization adequado dos animais (por exemplo, falta de resposta aos pitadas dedo do pé). </li></ol> 4. Instalação Experimental <ol><li> Cortar a estabilização da bexiga a partir de qualquer tipo de material de plástico rígido liso [Figura 2 I]. Inspecione cuidadosamente a alça e remover quaisquer arestas vivas antes da aplicação para os ratos. </li><li> Montar o animal sobre a mesa aquecida imagem [Figura 1 I] do animal plataforma pequena imagem com monitoramento contínuo dos sinais vitais. Corrigir os membros inferiores com um elástico [Figura 1 III]. </li><li> Desinfetar o abdômen com 2% de gluconato de clorexidina e limpe a pele com um cotonete estéril. </li><li> Imobilizar a bexiga com a tira de estabilização da bexiga [Figura 2 II]. Assim, uma evasãoda bexiga durante a injecção intramural no passo 5.6 será evitado. </li><li> Aplique o gel de ultra-som estéril para a parte inferior do abdômen. </li><li> Aproximar lentamente a cabeça da sonda de ultra-som (freqüência de 40 MHz) [Figura 1 IV] para a pele (longitudinal com um ângulo de 45-70 ° craniana) e visualizar a bexiga na tela do ultra-som [Figura 3 I]. </li><li> Se a bexiga está vazia, preenchê-lo com 50 ul tampão fosfato estéril, quente (PBS), através de um G angiocateter transuretral 24. </li></ol> 5. Separação das camadas da parede da bexiga <ol><li> Anexar uma seringa de 1,0 ml com PBS e ligado a um 30 L, ¾ de agulha (chanfro dirigida anteriormente) para o grampo de seringa. </li><li> Posicionar a agulha no sentido da pele logo acima do osso púbico, em um ângulo de 30-45 ° (80-90 ° em relação ao eixo longitudinal da cabeça da sonda de ultra-sons [Figura 1]). </li><li> Detectar a agulhana tela de ultra-som. </li><li> Lentamente perfurar a pele e os músculos da parede abdominal [Figura 3 II]. </li><li> Gire o bisel da agulha 180 ° (agora dirigida posteriormente). </li><li> Inserir a ponta da agulha para dentro da parede da bexiga, sem penetrar na mucosa [Figura 3 III] </li><li> Lentamente injectar 50 ul de PBS entre a camada muscular e mucosa, a fim de criar um espaço artificial [Figura 3 IV]. Nota: Se a mucosa é acidentalmente perfurada durante o passo 5.6, lentamente puxe a agulha e injetar 50 mL de PBS após a camada mucosa tem virado para trás sobre a ponta da agulha. </li><li> Retire a agulha. </li></ol> 6. Intramuros inoculação de células de câncer da bexiga <ol><li> Anexar uma segunda seringa de 1,0 ml (cheio de células cancerosas suspensas em Matrigel) com a 30 G, ¾ de agulha para a braçadeira de seringa. </li><li> Guiar a ponta da agulha para a mesmaEspaço PBS-cheia, que foi criado no passo 5.7. </li><li> Injecte 40 ul da suspensão de células para dentro deste espaço [Figuras 3 V e VI]. </li><li> Retire a agulha. </li></ol> 7. Cuidados de suporte pós-intervencionista <ol><li> Desmonte o mouse a partir da plataforma de imagem. </li><li> Manter o animal em um ambiente acolhedor e confortável sob vigilância contínua durante a recuperação da anestesia. </li><li> Depois de recobrar a consciência e retomar a deambulação normal, coloque o animal de volta em sua gaiola. </li></ol>

<ol>
	<li>Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+orthotopic+models+for+bladder+cancer+research.">Mouse orthotopic models for bladder cancer research.</a> BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).</li><li>Kubota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+models+of+human+cancer+xenografted+in+the+nude+mouse:+the+importance+of+orthotopic+transplantation.">Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation.</a> J. Cell. Biochem. 56, 4-8 (1994).</li><li>Hadaschik, B. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+bladder+cancer+xenograft+bioluminescence+with+magnetic+resonance+imaging:+the+significance+of+hypoxia+and+necrosis.">Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis.</a> BJU Int. 106, 1799-1804 (2010).</li></ol>

Acesso aberto para este vídeo-artigo é patrocinado pela FUJIFILM VisualSonics, Inc.

Quase todos os grandes avanços na terapia do câncer exigirá testes em modelos animais antes de iniciar os ensaios clínicos. Os modelos animais de câncer são ferramentas essenciais que permitem aos pesquisadores estudar a biologia do tumor in vivo. Modelos de xenoenxerto ortotópico permanecer padrão ouro 1,2 e continuar a oferecer o máximo de flexibilidade (em termos de seleção de linhagens de células) e têm a utilidade mais prática. O procedimento ilustrado é uma modificação minimamente invasiva do modelo ortotópico previamente descrito por 12 Ðîññèÿ et al. Estabelecemos tumores xenoenxerto guiada por ultra-som injeção percutânea de três linhagens celulares diferentes, com uma taxa de sucesso técnico de 100%. Durante acompanhamento contínuo, 98% dos ratos demonstraram aumento constante no volume do tumor. Ao realizar uma técnica minimamente invasiva, fomos capazes de lidar com as limitações existentes do modelo intramural. Além respecting bem-estar animal, a invasividade reduzida deste processo contribui também para a reprodutibilidade dos experimentos in vivo, pela diminuição do número de complicações cirúrgicas. É altamente eficaz do tempo para evitar uma laparotomia abdominal e necessidade associada para o fechamento da ferida. Fomos capazes de diminuir significativamente o tempo de procedimento por animal para 3,4 min (± 1,6). No entanto, a principal vantagem da nossa nova abordagem é a sua precisão. De alta resolução ultra-sons permite visualizar o espaço criado pela injecção de solução salina sob a mucosa da parede da bexiga. Este primeiro passo de injecção facilita a injecção de células de tumor, num segundo passo e minimiza o risco de derramamento de células de tumor. Isto contrasta com a técnica de injeção intramural após laparotomia, onde é impossível visualizar a colocação da agulha e há sempre um elemento de incerteza em relação à profundidade exata da injeção. Além disso, como estamos a inoculação de células tumorais estritamente na parede da bexiga anterior, growt tumorh na parede posterior da bexiga é evitada. Subsequentemente, a taxa de complicações obstrutivas devido ao crescimento do tumor na proximidade dos orifícios ureterais é extremamente rara. Este efeito permite que acompanha os períodos de crescimento e de tratamento mais longos. A principal limitação da inoculação do tumor guiada por ultra-som é a necessidade de equipamento técnico adequado. Por conseguinte, o desempenho deste procedimento será provavelmente restrita aos centros que são especializados em modelos animais de cancro humano. Isto deve encorajar a colaboração entre grupos de pesquisa fora dessas instituições e os grupos com experiência em modelagem, tais animais romance. Embora dependente da familiaridade com ultra-sonografia e alguma destreza manual, este modelo é fácil de aprender sob a instrução competente. O passo chave no processo é a criação de um espaço artificial submucosa da parede da bexiga com solução salina. Uma vez que este espaço é criado sem perfuração of a camada mucosa, que permanece estável durante vários minutos. A orientação da segunda agulha para dentro deste espaço, a fim de inocular as células tumorais são relativamente simples. A principal complicação durante a criação do espaço submucosa é a perfuração da agulha para dentro do lúmen da bexiga. A criação de um espaço na submucosa, no entanto, continua a ser viável. A agulha tem de ser retirada lentamente para dentro da parede da bexiga e da solução salina injectada apenas quando a camada mucosa vira a ponta da agulha. Após esta manobra, o espaço submucosa é menos estável (solução salina escorra para dentro do lúmen da bexiga 30-60 seg) e a injecção de células de tumor tem de ser realizado rapidamente. O derramamento de células de tumor para dentro do lúmen da bexiga podem ocorrer nestes casos com a perfuração da mucosa. Embora a perda de células tumorais a partir do espaço intramuros pode levar a uma diminuição do volume do tumor durante o seguimento, nós nunca ter observado qualquer captação tumoral intravesical. Outro potencial complication é o derramamento de células tumorais para a cavidade peritoneal através do canal de injecção. Observou-se apenas uma disseminação de células tumorais intraperitoneal em 50 animais, e isso ocorreu em uma de nossas primeiras tentativas. Atribuímos isso à injeção de um volume demasiado importante suspensão de células do tumor. Isto foi corroborado pelo facto de que a redução do volume de 50-40 mL resultou em não mais derramamento intraperitoneal. Esta inoculação minimamente invasivo de murino ortotópico xenotransplante câncer de bexiga representa uma modificação inovadora do &quot;modelo intramural&quot; existente, beneficiando tanto o investigador e os animais da mesma forma. As vantagens deste modelo de encorajar a sua adaptação a outros órgãos, tais como rim, próstata e fígado, a fim de estabelecer tumores de xenoenxerto ortotópicos de uma forma minimamente invasiva.

Pesquisa sobre o câncer é dependente de modelos animais de câncer humano, usando linhas de células derivadas de tumores de pacientes, a fim de aprofundar a nossa compreensão da biologia do tumor. Pois na análise de crescimento vivo sob diferentes estratégias de tratamento de câncer de bexiga modelos murino ortotópico permanecer o padrão de referência 1,2. A inoculação de células de câncer de bexiga humanos em camundongos imunocomprometidos (modelo de xenotransplante) conta com a instilação intravesical (&quot;modelo intravesical&quot;) 3,4,5 ou injeção direta na parede da bexiga (&quot;modelo intramural&quot;) 6,7. Ambas as técnicas podem também ser realizadas em ratos 8,9. Instilação intravesical induz a formação de tumores na superfície uroteliais de bexiga, que, em seguida, são passíveis de subsequente instilação intravesical de novos agentes de tratamento. No entanto, o número de linhas de células que são fiavelmente tumorigénicas quando entregues através deste método é limitado ad uma dessas linhas celulares, KU7, foi recentemente demonstrado ser HeLa 4,10. Instilação intravesical também é demorado devido ao tempo de espera necessários, e freqüentemente induz o crescimento do tumor em elementos adjacentes do trato urinário, incluindo uretra, ureter e pelve renal 11. Além disso, a instilação intravesical frequentemente conduz ao crescimento do tumor no chão da bexiga, onde os ureteres entrar na bexiga, e este pode causar a obstrução do tracto superior e insuficiência renal concomitante. Xenoenxertos de cancro da bexiga invasivo primários que sejam adequados para tratamentos sistémicos são criados através de injecção directa de células tumorais na parede da bexiga 12. Apesar de numerosas linhas celulares de crescer adequadamente, neste modelo, a limitação é a capacidade de invasão do modelo relacionada com a necessidade de uma incisão abdominal 13. O modelo também é um desafio para aprender devido à dificuldade técnica de injeção de células precisamente na parede do músculoda bexiga. Uma nova abordagem para estabelecer ortotópico primários xenografts câncer de bexiga invasivo em ratos foi desenvolvido em nosso serviço, a fim de colmatar as lacunas existentes do &quot;modelo intramural&quot;. Nós fomos capazes de otimizar a, injeção percutânea guiada por ultra-som de células de câncer de bexiga na parede da bexiga anterior, resultando nesta nova técnica para substituir com sucesso o modelo invasivo estabelecida. Além disso, temos, potencialmente, aumentar a precisão e reprodutibilidade do &quot;modelo intramural&quot;.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine gluconate (2%)</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>82-319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:64px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:64px;">SH3008101</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:64px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:64px;">SH3007103</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:64px;">Matrigel</td>
			<td style="width:64px;">BD Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:64px;">356234</td>
			<td style="width:64px;">Keep between 2-4&#8304;C</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:64px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:64px;">Baxter Corporation</td>
			<td style="width:64px;">402-069-02</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:64px;">Trypsin (0.25%)</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:64px;">SH3004202</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:64px;">Syringe (1ml)</td>
			<td style="width:64px;">BD Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:64px;">309659</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:64px;">Hypodermic needle (30G; &#190; inch)</td>
			<td style="width:64px;">Kendall</td>
			<td align="right" style="width:64px;">830340</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:64px;">Angiocatheter (24G)</td>
			<td style="width:64px;">BD Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:64px;">381112</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:64px;">Vevo 770 small animal imaging platform</td>
			<td style="width:64px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:64px;">RMV 706 ultrasound scanhead</td>
			<td style="width:64px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:64px;">IVIS Lumina III</td>
			<td style="width:64px;">&#160;Caliper Life Science</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimally invasive establishment of murine orthotopic bladder xenografts

Ortotópico xenografts câncer de bexiga são o padrão ouro para o estudo manipulações moleculares e celulares novos agentes terapêuticos in vivo. As linhas celulares adequadas são inoculados por instilação intravesical (modelo de crescimento invasivo nonmuscle) ou injecção intramural na parede da bexiga (modelo de crescimento invasivo). Ambos os processos são complexos e altamente consumidora de tempo. Além disso, o modelo superficial tem as suas limitações devido à falta de linhas celulares que são a seguir instilação tumorigénico. Injeção intramuros, por outro lado, é marcada pela invasão do procedimento e a morbidade associada para o mouse host. Com estas limitações em mente, nós modificamos os métodos anteriores para desenvolver uma abordagem minimamente invasiva para a criação de ortotópico xenografts câncer de bexiga. Usando a orientação do ultra-som que temos realizado com sucesso inoculação percutânea das linhas celulares de cancro da bexiga UM-UC1, UM-UC3 e UM-UC13 em 50 nu atímico. Temos sido capazes de demonstrar que esta abordagem é tempo eficiente, preciso e seguro. Com esta técnica, inicialmente, é criado um espaço sob a mucosa da bexiga com PBS, e as células tumorais são então injectado para dentro deste espaço, em uma segunda etapa. O crescimento do tumor é monitorada em intervalos regulares com imagem de bioluminescência e ultra-som. Os volumes médios de tumor aumentou de forma constante nos em todos, mas um de nossos 50 ratos durante o período de estudo. Em nossa instituição, esta nova abordagem, que permite a inoculação de xenotransplante câncer de bexiga, de forma minimamente invasiva, rápida e altamente precisa, substituiu o modelo tradicional.

<html> Injeção intramural de três linhagens de células tumorais diferentes (UM-UC1 luc, UM-UC3 Luc e UM-UC13 luc) foi realizada em 50 animais sob ultra-som-orientação em três dias consecutivos. A inoculação foi realizada de forma eficiente (tempo médio de 5,7 min / animal) e não foi associada a complicações intra ou pós-intervenção. Monitoramento do crescimento do tumor foi realizada por ultra-sonografia e bioluminescência. No dia # 3 um tumor poderia ser detectado por ultra-som na bexiga anterior de todos os 50 animais [Figura 4 I]. 98% dos camundongos mostraram o crescimento do tumor constante durante o período de seguimento [Os quadros 4 e 5]. Após a inoculação do UM-UC3 luc, um rato desenvolvido disseminação do tumor intraperitoneal eo tumor involuído após dia como 7 em um segundo animal [Tabela 1]. Este foi o primeiro grupo de ratinhos inoculados com esta nova técnica. nt &quot;&gt; Os ratinhos foram sacrificados no dia # 24, # 28 e # 37, após a inoculação de UM-UC3 luc, UM-UC1 luc e de UM-UC13 luc, respectivamente. tumores xenoenxertos foram colhidas e examinadas em hematoxilina e eosina (H &amp; E secções). Todos os tumores foram músculo invasivo e alguns infiltrados na gordura perivesical, mas nenhuma invasão em órgãos adjacentes foi observada [Figura 6 I]. de 60% ​​dos ratinhos portadores de tumores luc UM-UC13 e 20% dos ratinhos portadores de UM-UC3 luc tumores desenvolveram metástases em linfonodos retroperitoneais que foram confirmados por H &amp; E coloração [Figura 6 II]. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig1.jpg" /> Figura 1. Imagem e ilustração esquemática da configuração experimental. O rato é montado em cima da mesa aquecida operação (I) e realizada sob anestesia (&lt;strong&gt; II) com 3% de mistura de isoflurano / oxigénio. Os membros inferiores são fixados com um elástico (III). Depois de se aproximar da cabeça da sonda de ultra-sons (IV) para a pele (alinhamento longitudinal com um ângulo de 45-70 ° craniana) da bexiga (V) é visualizada no ecrã de ultra-som. Uma seringa com uma agulha 30 G (VI) é guiada para a pele, num ângulo de 30-45 ° (80-90 ° em relação ao eixo longitudinal da cabeça da sonda de ultra-sons). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig2.jpg" /> Figura 2. Imobilização da bexiga. Dimensões e ilustra a construção da correia de estabilização da bexiga (I), A correia está ligada a parte inferior do abdómen e imobiliza a bexiga (II). Assim, uma evasão do<html> bexiga durante a injeção intramural é evitado. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig3.jpg" /> Figura 3. Intramural inoculação de células tumorais. Visualização da bexiga na tela de ultra-sons (I). Perfuração da pele e músculos da parede abdominal (II). A inserção da agulha para dentro da parede da bexiga, sem penetração da mucosa (III). PBS (50 mL) entre a camada muscular e da mucosa após uma injecção lenta (IV). As células tumorais suspensas em Matrigel no espaço criado artificialmente intramural (V, ​​VI). 1123fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. . Acompanhamento por ultra-som contínuo acompanhamento por ultra-som mostrou aumento significativo do volume do tumor (I: dia # 3, II: dia # 7, III: dia # 13). <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig5.jpg" /> Figura 5. Follow-up por bioluminescência. Contínuo acompanhamento por bioluminescência mostraram aumento constante da luminescência durante o período de estudo. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig6.jpg" /> Figura 6. Histologia do tumor xenoenxerto e metástase linfonodal. In toto secção H &amp; E de um xenotransplante representante tu<html> mor demonstrando crescimento invasivo no músculo sem invasão em órgãos adjacentes (I). 60% dos camundongos com tumores luc UM-UC13 e 20% de camundongos portadores de tumores luc UM-UC3 apresentaram metástases em linfonodos retroperitoneais (II). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320"><colgroup><col span="5" /></colgroup><tbody><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Linhagem de células inoculadas </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> UM-UC1 luc </td><td style="width:64px;"> UM-UC3 luc </td><td style="width:64px;"> Luc UM-UC13 </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"> Número de ratinhos </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 20 </td><td style="width:64px;"> 15 </td><td style="width:64px;"> 15 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Volume injetado, mL </td>idth: 64px; &quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> 40 </td><td style="width:64px;"> 50 </td><td style="width:64px;"> 50 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> A contagem de células, absoluto </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 3,6 x 10 5 </td><td style="width:64px;"> 6 x 10 5 </td><td style="width:64px;"> 5,5 x 10 5 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Tempo por animal, min </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 3,4 (± 1,6) </td><td style="width:64px;"> 7,7 (± 3,7) </td><td style="width:64px;"> 6,8 (± 2,9) </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Incidência tumoral </td><td style="width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:192px;"> 49 (98%) </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"&gt; </td><td style="width:64px;"> 20 (100%) </td><td style="width:64px;"> 14 (93%) </td><td style="width:64px;"> 15 (100%) </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"> Linfonodo metástase </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 0 </td><td style="width:64px;"> 3 (20%) </td><td style="width:64px;"> 9 (60%) </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"> Acompanhamento (dias) </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 28 </td><td style="width:64px;"> 22 [antes do tratamento] </td><td style="width:64px;"> 28 [antes do tratamento] </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> O volume de tumor (mL) </td><td style="width:64px;"> dia 4 </td><td style="width:64px;"> 11,6 (± 1,3) </td><td style="width:64px;"> 12,5 (± 1,7) </td><td style="width:64px;"> 14,4 (± 1,3) </td></tr><tr height="20"><td height="61" rowspan = &quot;2&quot; style = &quot;height: 61px; width: 64px;&quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> final </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 394,6 (± 72,4) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 288,7 (± 66,1) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 78,3 (± 13,4) </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"> follow-up </td></tr><tr height="56"><td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:64px;"> Tumor luminescência (fótons / s) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> dia 4 </td><td style="width:64px;"> 4,6 x 10 8 </td><td style="width:64px;"> 2,0 x 10 8 </td><td style="width:64px;"> 5,8 x 10 8 </td></tr><tr height="44"><td height="44" style="height:44px;width:64px;"> (± 9,4 x 10 7) </td><td style="width:64px;"> (± 3,7 x 10 7) </td><td style="width:64px;"> (± 1,3 x 10 8) </td></tr><tr height="23"><td height="67" rowspan="2"style = &quot;height: 67px; width: 64px;&quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> final </td><td style="width:64px;"> 1,9 x 10 10 </td><td style="width:64px;"> 1,4 x 10 10 </td><td style="width:64px;"> 1,5 x 10 10 </td></tr><tr height="44"><td height="44" style="height:44px;width:64px;"> follow-up </td><td style="width:64px;"> (± 4,0 x 10 9) </td><td style="width:64px;"> (± 2,3 x 10 9) </td><td style="width:64px;"> (± 1,9 x 10 9) </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Injeção de células tumorais de ultra-som-guiada - procedimento e resultados.

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Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

A técnica criada para inocular xenografts ortotópico de câncer de bexiga invasivo primário requer laparotomia e mobilização da bexiga. Este procedimento inflige morbidade significativa nos ratinhos, é tecnicamente difícil e demorado. Por isso, desenvolvemos um de alta precisão, a abordagem percutânea utilizando a orientação do ultra-som.

Minimamente Invasiva Estabelecimento de murino ortotópico bexiga Xenoenxertos

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.8K visualizações.  University of British Columbia.  A técnica criada para inocular xenografts ortotópico de câncer de bexiga invasivo primário requer laparotomia e mobilização da bexiga. Este procedimento inflige morbidade significativa nos ratinhos, é tecnicamente difícil e demorado. Por isso, desenvolvemos um de alta precisão, a abordagem percutânea utilizando a orientação do ultra-som. 

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An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Um modelo de tumor de bexiga ortotópico e Avaliação de Tratamento de sarna intravesical

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Medicina

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Um modelo de cancro da bexiga para Ortotópico Gene Estudos de entrega

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary orthotopic xenografts recapitulate the histopathological and molecular features of malignant glioma subtypes in preclinical animal models. To model WHO grades III and IV malignant gliomas in transplantation assays, human tumor cells are xenografted into an orthotopic site, the brain, of immunocompromised mice. In contrast to secondary xenografts that utilize cultured tumor cells, human glioma cells are dissociated from resected specimens and transplanted without prior passage in tissue culture to generate primary xenografts. The procedure in this report details tumor sample preparation, intracranial transplantation into immunocompromised mice, monitoring for tumor engraftment and tumor harvesting for subsequent passage into recipient animals or analysis. Tumor cell preparation requires 2 hr and surgical procedure requires 20 min/animal.

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary orthotopic xenografts recapitulate the histopathological and molecular features of malignant glioma subtypes in preclinical animal models.

Glioma Xenoenxertos Ortotópicos Primários Recapitulam crescimento infiltrativo e isocitar mutação desidrogenase I

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary ...

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.
The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.
In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.

Avaliação da Eficácia da<em&gt; H. pylori</em&gt; Protein HP-NAP como uma ferramenta terapêutica para o tratamento de cancro da bexiga em um Modelo murino Orthotopic

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Encapsulation termogênico pré-adipócitos para transplante em adiposo Depots Tissue

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard open-chest transverse aortic constriction (TAC). Although transverse aortic constriction is a highly functional method for the induction of high pressure in the left ventricle, it is a more difficult and lengthy procedure due to its use of artificial ventilation with tracheal intubation. TAC is oftentimes also less survivable, as the newer method, MTAC, neither requires the cutting of the ribs and intercostal muscles nor tracheal intubation with a ventilation setup. In MTAC, as opposed to a thoracotomy to access to the chest cavity, the aortic arch is reached through a midline incision in the anterior neck. The thyroid is pulled back to reveal the sternal notch. The sternum is subsequently cut down to the second rib level, and the aortic arch is reached simply by separating the connective tissues and thymus. From there, a suture can be wrapped around the arch and tied with a spacer, and then the sternal cut and skin can be closed. MTAC is a much faster and less invasive way to induce left ventricular hypertension and enables the possibility for high-throughput studies. The success of the constriction can be verified using high-frequency trans-thoracic echocardiography, particularly color Doppler and pulsed-wave Doppler, to determine the flow velocities of the aortic arch and left and right carotid arteries, the dimension of the blood vessels, and the left ventricular function and morphology. A successful constriction will also trigger significant histopathological changes, such as cardiac muscle cell hypertrophy with interstitial and perivascular fibrosis. Here, the procedure of MTAC is described, demonstrating how the resulting flow changes in the carotid arteries can be examined with echocardiography, gross morphology, and histopathological changes in the heart.

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) conserves the essentials of regular transverse aortic constriction (TAC) while eliminating the use of a ventilator with tracheal intubation. It proves to be a highly desirable method for high-throughput studies on left ventricular overload, particularly in translational studies.

Minimamente Invasiva transversal aórtica constrição em Ratos

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard ...

An Anatomical Study of Nerves at Risk During Minimally Invasive Hallux Valgus Surgery

The growing popularity of minimally invasive surgical (MIS) procedures makes it necessary that new anatomical references arise, to aid in tridimensional orientation and localization of structures that are not directly visible to the surgeon. This is especially critical for structures at risk like nerves or blood vessels. Optimization of the handling of cadaveric material and the combination of multiple techniques compensate for the limited availability of adequate specimens. The described protocol combines anatomical plane-by-plane dissection and sectional anatomy of fresh-frozen specimens to help localize relevant structures, such as nerves, arteries, veins and to correctly position the portals during MIS procedures. Depiction of these structures in anatomy textbooks can differ from what is encountered in the surgical field; and for this reason, new anatomical studies with a surgical orientation are needed. However, this is a complex, time-consuming technique requiring specific training. The anatomical references described with the so-called 'clock method' provide the surgeon with an easy and reproducible system to locate the path of the nerves at risk in Hallux Valgus MIS procedures. This model can be extrapolated to many other minimally invasive surgical procedures.

Minimally invasive surgical (MIS) procedures rely on anatomical references to localize structures not directly visible to the surgeon. This manuscript describes a combined method of plane-by-plane dissection and sectional anatomy of fresh-frozen specimens to locate the structures at risk during MIS procedures.

Um estudo anatômico dos nervos em risco durante a cirurgia valgo do hálux minimamente invasiva

The growing popularity of minimally invasive surgical (MIS) procedures makes it necessary that new anatomical references arise, to aid in tridimensional ...

Endoscopic Septoplasty with Limited Two-line Resection: Minimally Invasive Surgery for Septal Deviation

Endoscopic septoplasty is a surgical procedure in otolaryngology that is commonly performed to treat nasal airway obstruction caused by nasal septal deviation. It has a long history with multiple variations. In this article, a modified endoscopic septoplasty procedure using the limited two-line resection (2LoRs) technique at the posterior and inferior junction of the cartilaginous and bony septum is presented based on embryologic and anatomic knowledge of the nasal septum and the biomechanics of cartilaginous behavior. With this procedure, the quadrangular cartilage can be preserved as much as possible, which is helpful in retaining the supporting framework and rigidness of the septum. 2LoRs has been proven effective and sound for the correction of nasal septal deviation with rare complications. This modified procedure can be applied to correct the deviated nasal septum in the absence of any external nasal deformity to improve nasal patency or to improve access to the middle meatus or to the axillary region of the middle turbinate. It may also be used to expand the indications of septoplasty to children and adolescents because of its minimally invasive approach.

Endoscopic septoplasty is a time-honored surgical procedure with multiple variations. This paper focuses on a step-by-step surgical approach to perform a modified septoplasty procedure known as limited two-line resection. This surgical technique can be applied to correct a deviated nasal septum in the absence of an external nasal deformity.

A septoplastia endoscópica com ressecção limitada de duas linhas: cirurgia minimamente invasiva para desvio do septo

Endoscopic septoplasty is a surgical procedure in otolaryngology that is commonly performed to treat nasal airway obstruction caused by nasal septal ...

Electromagnetic Navigation Transthoracic Nodule Localization for Minimally Invasive Thoracic Surgery

The increased use of chest computed tomography (CT) has led to an increased detection of pulmonary nodules requiring diagnostic evaluation and/or excision. Many of these nodules are identified and excised via minimally invasive thoracic surgery; however, subcentimeter and subsolid nodules are frequently difficult to identify intra-operatively. This can be mitigated by the use of electromagnetic transthoracic needle localization. This protocol delineates the step-by-step process of electromagnetic localization from the pre-operative period to the postoperative period and is an adaptation of the electromagnetically guided percutaneous biopsy previously described by Arias et al. Pre-operative steps include obtaining a same day CT followed by the generation of a three-dimensional virtual map of the lung. From this map, the target lesion(s) and an entry site are chosen. In the operating room, the virtual reconstruction of the lung is then calibrated with the patient and the electromagnetic navigation platform. The patient is then sedated, intubated, and placed in the lateral decubitus position. Using a sterile technique and visualization from multiple views, the needle is inserted into the chest wall at the prechosen skin entry site and driven down to the target lesion. Dye is then injected into the lesion and, then, continuously during needle withdrawal, creating a tract for visualization intra-operatively. This method has many potential benefits when compared to the CT-guided localization, including a decreased radiation exposure and decreased time between the dye injection and the surgery. Dye diffusion from the pathway occurs over time, thereby limiting intra-operative nodule identification. By decreasing the time to surgery, there is a decrease in wait time for the patient, and less time for dye diffusion to occur, resulting in an improvement in nodule localization. When compared to electromagnetic bronchoscopy, airway architecture is no longer a limitation as the target nodule is accessed via a transparenchymal approach. Details of this procedure are described in a step-by-step fashion.

Presented here is a protocol for lung nodule localization using dye marking via electromagnetically navigated transthoracic needle access. The technique described here can be accomplished in the peri-operative period to optimize nodule localization and to successful resection when performing minimally invasive thoracic surgery.

Localização do nódulo transtorácico de navegação eletromagnética para cirurgia torácica minimamente invasiva

The increased use of chest computed tomography (CT) has led to an increased detection of pulmonary nodules requiring diagnostic evaluation and/or ...

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many areas of biomedical research due to its cost-effectiveness and its translation to humans. This protocol describes a method to create a preclinical free skin flap model in rats with ischemia-reperfusion injury. The described 3 cm x 6 cm rat free skin flap model is easily obtained after the placement of several vascular ligatures and the section of the vascular pedicle. Then, 8 h after the ischemic insult and completion of the microsurgical anastomosis, the free skin flap develops the tissue damage. These ischemia-reperfusion injury-related damages can be studied in this model, making it a suitable model for evaluating therapeutic agents to address this pathophysiological process. Furthermore, two main monitoring techniques are described in the protocol for the assessment of this animal model: transit-time ultrasound technology and laser speckle contrast analysis.

Here, we describe a pre-clinical animal model for studying the pathophysiology of ischemia-reperfusion injury in reconstructive microsurgery. This free skin flap model based on the superficial caudal epigastric vessels in the rat may also allow for the evaluation of different therapies and compounds to counteract ischemia-reperfusion injury-related damage.

Um modelo pré-clínico do rato para o estudo da lesão da Isquemia-reperfusion na microcirurgia reconstrutiva

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...