O apoio financeiro foi fornecido a JMS do NIH em Biomecânica Medicina Regenerativa Programa de Formação de T32 (2T32EB003392), a QJ do Fellowship Dowd-ICES e AWF de New Innovator Award do Diretor NIH (1DP2HL117750).

1. Fabricação de Molde Mestre usando fotolitografia <ol><li> As nanofibras de proteínas ECM, nanofabrics e nanoestruturas a ser fabricados são primeiramente projetados usando software Computer Aided Design (CAD). Este arquivo CAD é então transferido para um photomask. O tipo de fotomáscara dependerá da resolução das características; com um photomask baseada em transparência adequada para o recurso tamanhos até ~ 10 m. Características menores &lt;10 m exigirá um cromo em photomask vidro. Todas as nanofibras e nanoestruturas aqui apresentados foram fabricados usando um photomask baseado em transparência e, portanto, foram à escala nanométrica de espessura, mas não dimensões laterais. Nota: É importante distinguir quais as regiões da fotomáscara será escuro (luz UV para evitar a passar) e que vai ser transparente (permitir que a luz UV para passar através) como este, juntamente com o tipo de material fotosensitivo (positivo ou negativo) , vai ditar a topografia final do molde mestre. </li><li> Para iniciar o fabrico do molde mestre, desidratar uma bolacha 4 &quot;de silício, colocando-o numa placa de aquecimento configurado para 150 ° C durante 15 min. </li><li> Centralize o wafer sobre o chuck vácuo de um spin-coater. Despeje SU8-2015 fotorresistente negativo para o meio da bolacha e continuar vertendo em círculos concêntricos, até cerca de dois terços da bolacha é coberto. Nota: Manter a garrafa de SU8 perto da bolacha quando vazar para minimizar a formação de bolhas. </li><li> Programar a spincoater como se segue: <ul><li> Ciclo Spread: 500 rpm com uma aceleração de 100 rpm / s por 10 s. </li><li> Ciclo de centrifugação: 4000 rpm com uma aceleração de 100 rpm / seg para 30 seg. </li></ul> Nota: Esta receita spincoating vai formar uma camada foto-resistente, que é de aproximadamente 10 um de espessura. Ao alterar a velocidade de rotação ou da formulação SU8, a espessura pode ser ajustada. </li><li> Mole cozer a bolacha, colocando-o numa placa de aquecimento configurado a 95 ° C durante 3 min. </li><li> Expor o wafer com luz UV através defotomáscara para uma dose total de 140 mJ / cm 2. Nota: SU8 é uma fotorresistência negativo, por conseguinte, as regiões onde a luz ultravioleta é capaz de passar através da foto-mascara permanecerá após o desenvolvimento e tornou características levantadas sobre o molde mestre. </li><li> Após a exposição cozer a bolacha, colocando-o numa placa de aquecimento configurado a 95 ° C durante 4 min. </li><li> Desenvolver o wafer, colocando-o desenvolvedor SU8 por 3 min. Após 3 min, lavar o wafer com álcool isopropílico. Se uma película branca é produzido durante a lavagem, a pastilha não é totalmente desenvolvido e deve ser colocada de volta no revelador durante mais 30 seg. Enxágüe novamente com álcool isopropílico. Repita esse processo até que uma película branca não formar durante a lavagem álcool isopropílico. </li><li> Seca-se a bolacha em uma corrente de azoto e em lugar de uma placa de petri de 150 milímetros para proteger da poeira. </li></ol> 2. Fazendo as PDMS selos <ol><li> Preparar o pré-polímero de PDMS, combinando a base de elastómero e de agente de cura numa10:1 w / w. Tipicamente, 80 g de base e 8 g de agente de cura são utilizados para garantir que há PDMS suficientes para cobrir o molde mestre de uma camada de 1 cm de espessura. </li><li> Misture e degas do PDMS utilizando um misturador centrípeta definido para o seguinte: <ul><li> Misturar: 2000 rpm durante 2 min </li><li> Desgaseifica: 2000 rpm durante 2 min. </li></ul></li><li> Se um misturador está indisponível misturar os PDMS com a mão por 10 min usando uma pipeta de 10 ml sorológica. Desgaseificar a mistura, colocando-o em um exsicador de vácuo durante 30 min para remover as bolhas. </li><li> Despeje suficiente pré-polímero de PDMS sobre o molde mestre (pastilha de silício modelado) para formar uma camada de 1 cm de espessura. Curar o PDMS por cozedura a 65 ° C durante 4 horas ou à temperatura ambiente durante 48 horas. </li><li> Uma vez curada, as regiões que contêm os padrões pode ser cortado para formar os selos PDMS. Para distinguir o lado do recurso na parte de trás do selo PDMS, cortar um entalhe de um dos cantos na parte de trás do selo. </li></ol> 3. Microcontact Printing de padrões de ECM <ol><li> Limpo lamelas de vidro 25 mm de diâmetro por sonicação em etanol a 95% durante 1 hora e em seguida seco num forno de 65 ° C. </li><li> Preparar a solução PIPAAm dissolvendo PIPAAm em 1-butanol, a uma concentração de 10% (w / v, tipicamente 1 g em 10 ml). </li><li> Centrar uma lamela de vidro sobre o mandril de vácuo dos spincoater e pipeta 200 uL da solução PIPAAm modo que a superfície de vidro inteiro é coberto. </li><li> Spincoat a lamela a 6.000 rpm durante 1 min. </li><li> Limpar os selos PDMS por sonicação em etanol a 50% durante 30 min e, em seguida, seca sob uma corrente de azoto. Nota: A secagem e passos subsequentes devem ser realizados numa câmara de biossegurança para manter a esterilidade para aplicações em que as nanoestruturas ECM serão utilizados com células. </li><li> Revestir a superfície padronizada de cada selo de PDMS com 200 ul da solução de proteína, tipicamente 50 ug / ml em água destilada estéril para FN. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Nota: Thé o revestimento de volume é um PDMS selo 1,5 cm 2 e terá de ser ajustada, dependendo do tamanho do selo PDMS, a proteína da MEC utilizado e a concentração da proteína na solução de ECM. </li><li> Lave os selos PDMS em água destilada para remover o excesso de proteína e seco cuidadosamente sob uma corrente de azoto. Nota: Qualquer água deixada sobre o selo irá desencadear a dissolução prematura do revestimento PIPAAm na lamela e evitar a transferência de proteína adequada. </li><li> Para a fabricação estéril, coloque as lamelas PIPAAm revestidos no interior de uma placa de Petri fechada e esterilizar utilizando a exposição UV, 45 min sob a luz UV em uma cabine de segurança biológica é suficiente. Se a esterilidade não é necessário este passo pode ser omitido. </li><li> Executar impressão microcontact colocando lado a característica do selo PDMS em contato com a lamela PIPAAm-revestido. Se necessário, utilize uma pinça para bater levemente na parte de trás dos selos para remover as bolhas de ar e garantir o contato uniforme. </li><li> Após 5 min, retire o selo PDMS da lamela. </li><li> Nesta fase, as proteínas de ECM adicionais, pode ser modelado para criar estruturas mais complexas e de componentes múltiplos. Até 3 impressões foram verificados para trabalhar com este processo, e muito mais pode ser viável. </li></ol> 4. Lançamento de ECM nanofibras e Nanoestruturas <ol><li> Coloque o PIPAAm lamela revestida modelada em um 35 milímetros placa de Petri e fiscalizar a fidelidade padrão usando microscopia de contraste de fase. Dependendo do padrão, uma câmara CCD pode ser necessário, para resolver as características do padrão. A microscopia de fluorescência também pode ser utilizado para inspeccionar o padrão fornecidas as proteínas de ECM são marcadas por fluorescência. </li><li> Adicionar 3 ml de água destilada, 40 ° C para a placa de petri e permite que a água a arrefecer gradualmente. </li><li> A dissolução da camada PIPAAm e a libertação dos padrões de proteínas de ECM podem ser monitorizadas através de microscopia de contraste de fase. Se o aplicativo não permite o uso de tec ópticahniques, a libertação pode ser monitorizado através da medição da temperatura da solução. Tipicamente, a água é arrefecida até à temperatura ambiente, bem abaixo da TCIS de PIPAAm (32 ° C), para assegurar que as nanoestruturas de proteínas de ECM foram libertados. </li><li> Após a liberação, as nanofibras, nanofabrics e outras nanoestruturas estão flutuando na água. Para usá-los para outras aplicações que necessitam para ser manipulado. A abordagem exacta dependerá do objectivo experimental e pode incluir passos tais como a imobilização para outra superfície, movendo-se com um sistema micromanipulador ou incorporação num hidrogel. </li></ol>

<ol>
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método aqui apresentado SIA imita montagem matriz mediada por células e permite que a engenharia de proteínas ECM nanofibras e nanoestruturas com tamanho ajustável, organização e composição. Apesar de não ser idêntico ao ECM gerado pelo celular, SIA cria ECM composta de fibrilas da proteína em nanoescala 20 que sofrem de dobramento reversível / desdobramento durante tensão mecânica 21 e podem ligar células 20. Isto proporciona uma capacidade única para construir materia...

A matriz extracelular (ECM) dos tecidos é composta de proteínas multifuncionais envolvidos na regulação física e química de vários processos celulares, incluindo adesão, proliferação, diferenciação e apoptose 1-3. O ECM é sintetizada, montado e organizado pelas células e as fibras de proteína constituintes têm composições únicas, tamanho da fibra, geometrias e arquiteturas interligadas que variam com o tipo de tecido e estágio de desenvolvimento. Trabalhos recentes têm demonstrado que o ECM pode fornecer pistas instrutivas para orientar células para formar tecidos artificiais 4, sugerindo que recapitulando a ECM em termos de composição e estrutura pode permitir o desenvolvimento de materiais biomiméticos para aplicações em engenharia de tecidos e biotecnologia. Um número de métodos de fabrico têm sido desenvolvidos para manipular andaimes poliméricos que podem imitar aspectos da ECM em tecidos. Por exemplo, eletrofiação e separ faseção têm ambos demonstraram a capacidade para formar matrizes porosas de fibras com diâmetros que variam entre dezenas de micrómetros deslocamento de dezenas de nanómetros de 5-7. Ambas as técnicas têm também mostrado que as matrizes altamente porosas de nanofibras pode suportar a adesão de células e infiltração no andaime 8. No entanto, estas abordagens estão limitadas nas geometrias possíveis orientações de fibra, e 3D arquitecturas que podem ser criados. Electrospinning normalmente produz andaimes com fibras ou orientadas aleatoriamente ou altamente alinhadas ao passo que a separação de fase produz andaimes com fibras orientadas aleatoriamente. Também existem limitações sobre o material, com investigadores tipicamente utilizando polímeros sintéticos, tais como poli (ε-caprolactona) 8 e poli (ácido láctico-co-glicólico), 9, que são posteriormente revestidos com proteínas de ECM para promover a adesão celular. Biopolímeros naturais também são utilizados, incluindo o colágeno tipo I 10, 11 gelatina, fibrinogênio 12,quitosana 13 e 14 de seda, mas representam apenas um pequeno subconjunto das proteínas encontradas no tecido nativo. A maioria dos tecidos contêm um meio maior de proteínas da MEC e polissacarídeos incluindo a fibronectina (FN), laminina (LN), o colagénio tipo IV e ácido hialurónico que são difíceis ou impossíveis de fabricar utilizando nanofibras de métodos já existentes. Para enfrentar esse desafio, temos focado nossos esforços de pesquisa sobre imitando a forma como as células sintetizar, montar e organizar fibrilas da proteína ECM em seus arredores. Enquanto o processo de fibrilogénese específica varia para diferentes proteínas da MEC, tipicamente uma alteração conformacional na molécula de proteína da MEC é desencadeada por um enzimática ou interacção mediada por receptor, o que expõe locais de auto-montagem crípticos. Aqui usamos FN como um sistema modelo para entender melhor o processo fibrilogênese. Resumidamente, FN homodímeros se ligam a receptores de integrina sobre a superfície celular através da sequência de aminoácidos RGD no 10 tipo IIRepito unidade. Uma vez ligado, as integrinas se afastam via contração actomiosina e desdobrar os dímeros FN para expor sites de auto-montagem enigmáticas. A exposição a estes locais de ligação de NF-FN permite que os dímeros de FN para montar em uma fibrila insolúvel direita na superfície da célula 15. Trabalho em sistemas livres de células demonstrou que os sítios de ligação FN-FN enigmáticas pode ser revelado através de desdobramento usando desnaturantes 16 ou tensão superficial em um ponto sólido-líquido interface de ar 17-19. No entanto, as fibras de FN criada por estas técnicas são restritas para os tamanhos e geometrias de fibras específicas e está tipicamente ligado a uma superfície. Aqui nós descrevemos um conjunto iniciou-superfície denominado abordagem (SIA) 20, que supera estas limitações, utilizando interações proteína de superfície para criar nanofibras sem pé insolúveis, nanofabrics (folhas 2D) e outras nanoestruturas compostas de proteínas individuais ou múltiplas de ECM (Figura 1 ). Neste process, proteínas da MEC são absorvidos a partir de uma conformação compacta, globular em solução e parcialmente desnaturado (desdobrado) em um, polidimetilsiloxano hidrofóbico (PDMS) selo padronizado. As proteínas são então transferidas ECM neste estado num poli resposta térmica (N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) superfície através microcontact impressão 22. Quando hidratado com água de 40 ° C a PIPAAm continua a ser um sólido, mas, quando arrefecida a 32 ° C que passa através de uma temperatura crítica inferior de solução (TCIS), onde ela se torna hidrofílico, incha com água e, em seguida, dissolve-se, libertando as nanoestruturas ECM montados fora de a superfície. O método SIA fornece controle sobre as dimensões com precisão à escala nanométrica. Ao controlar os parâmetros-chave, tais como a composição, a geometria da fibra, e arquitetura, é possível recapitular muitas propriedades da ECM encontradas in vivo e desenvolver suportes avançados para aplicações de engenharia de tecidos e biotecnologia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm</td>
			<td style="width:145px;">Polysciences</td>
			<td style="width:123px;">21458-10</td>
			<td style="width:167px;">40,000 Mw</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone kit (PDMS)</td>
			<td style="width:145px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;">Mix 10 parts base with 1 part curing agent.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Butanol</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354008</td>
			<td style="width:167px;">Human, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Laminin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354239</td>
			<td style="width:167px;">Ultrapure, mouse, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Negative Photoresist</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;">SU8-2015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SU8 Developer</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:216px;">Sonicator Branson M3510</td>
			<td style="width:145px;">Branson Ultrasonic Corporation</td>
			<td style="width:123px;">CPN-952-318</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">Thinky ARE-250 Mixer</td>
			<td style="width:145px;">Thinky Corporation</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Spincoater</td>
			<td style="width:145px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:123px;">G3P-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glass cover 25mm diameter, No 1.5</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-86</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ecm protein nanofibers and nanostructures engineered using surface-initiated assembly

A matriz extracelular (ECM) dos tecidos é sintetizada e montada pelas células para formar um fibrilar 3D, rede com proteína fortemente regulada diâmetro da fibra, da composição e organização. Além de proporcionar um suporte estrutural, as propriedades físicas e químicas do ECM desempenham um papel importante em vários processos celulares, incluindo adesão, diferenciação e apoptose. In vivo, a ECM é montado expondo críptico automontagem locais (fibrilogênese) dentro de proteínas . Este processo varia para diferentes proteínas, mas a fibronectina (FN) fibrilogênese é bem caracterizado, e serve como um sistema modelo para a montagem de ECM mediada por células. Especificamente, as células utilizam receptores de integrina sobre a membrana celular para ligar dímeros de FN e forças contrácteis gerado-actomiosina para desdobrar e expor os locais de ligação para a montagem em fibras insolúveis. Este processo mediado por receptores de células permite montar e organizar o ECM do tecido celular para scales. Aqui, apresentamos um método denominado montagem iniciou-superfície (SIA), que recapitula a montagem da matriz mediada por células usando interações proteína-superfície a se desdobrar proteínas da MEC e montá-las em fibras insolúveis. Primeiro, proteínas da MEC são adsorvidos um polidimetilsiloxano hidrofóbico (PDMS) superfície onde eles parcialmente desnaturar (desdobrar) e expor domínios de ligação enigmáticas. As proteínas desdobradas em seguida, são transferidos em bem definidas micro e nanopatterns através de impressão em uma microcontacto poli resposta térmica (N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) superfície. Dissolução termicamente acionado do PIPAAm leva à montagem final e liberação de proteínas insolúveis nanofibras ECM e nanoestruturas com geometrias bem definidas. Arquiteturas complexas são possíveis por padrões de engenharia definidos nos selos PDMS utilizados para impressão microcontact. Além disso a FN, o processo de PEI poderá ser usado com laminina, fibrinogénio e colagénios do tipo I e IV para criar multi-componente nanostruc ECMturas. Assim, o SIA pode ser utilizado para manipular os materiais à base de proteínas de ECM com o controlo preciso sobre a composição de proteína, fibra de geometria e arquitectura de andaime, a fim de recapitular a estrutura e composição da MEC in vivo.

SIA é capaz de ECM engenharia nanofibras de proteínas com um controle preciso sobre as dimensões das fibras. Para demonstrar isto, matrizes de nanofibras FN com dimensões planares de 50 x 20 um foram modelados para uma lamela PIPAAm revestido (Figura 2A). Após a liberação, as fibras contratados porque estavam sob uma pré-estresse inerente ao modeladas na superfície PIPAAm (Figura 2B). Análise das nanofibras FN revelou que foram pré-autorização monodisperso com um compriment...

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ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

Um método para obtenção de nanofibras e nanoestruturas de complexos de proteínas de matriz extracelular simples ou múltiplos é descrito. Este método utiliza as interações proteína de superfície para criar materiais à base de proteínas free-standing com composição sintonizável e arquitetura para o uso em uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos e biotecnologia.

Nanofibras ECM proteínas e Nanoestruturas Engineered Usando Assembléia iniciou-Surface

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K visualizações.  Carnegie Mellon University.  Um método para obtenção de nanofibras e nanoestruturas de complexos de proteínas de matriz extracelular simples ou múltiplos é descrito. Este método utiliza as interações proteína de superfície para criar materiais à base de proteínas free-standing com composição sintonizável e arquitetura para o uso em uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos e biotecnologia. 

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Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Bioengenharia

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological research. Perhaps the most widely used physical force to achieve noninvasive manipulation of small particles has been dielectrophoresis(DEP).1 However, DEP on its own lacks the versatility and precision that are desired when manipulating cells since it is traditionally done with stationary electrodes. Optical tweezers, which utilize a three dimensional electromagnetic field gradient to exert forces on small particles, achieve this desired versatility and precision.2 However, a major drawback of this approach is the high radiation intensity required to achieve the necessary force to trap a particle which can damage biological samples.3 A solution that allows trapping and sorting with lower optical intensities are optoelectronic tweezers (OET) but OET's have limitations with fine manipulation of small particles; being DEP-based technology also puts constraint on the property of the solution.4,5
This video article will describe two methods that decrease the intensity of the radiation needed for optical manipulation of living cells and also describe a method for orientation control. The first method is plasmonic tweezers which use a random gold nanoparticle (AuNP) array as a substrate for the sample as shown in Figure 1. The AuNP array converts the incident photons into localized surface plasmons (LSP) which consist of resonant dipole moments that radiate and generate a patterned radiation field with a large gradient in the cell solution. Initial work on surface plasmon enhanced trapping by Righini et al and our own modeling have shown the fields generated by the plasmonic substrate reduce the initial intensity required by enhancing the gradient field that traps the particle.6,7,8 The plasmonic approach allows for fine orientation control of ellipsoidal particles and cells with low optical intensities because of more efficient optical energy conversion into mechanical energy and a dipole-dependent radiation field. These fields are shown in figure 2 and the low trapping intensities are detailed in figures 4 and 5. The main problems with plasmonic tweezers are that the LSP's generate a considerable amount of heat and the trapping is only two dimensional. This heat generates convective flows and thermophoresis which can be powerful enough to expel submicron particles from the trap.9,10 The second approach that we will describe is utilizing periodic dielectric nanostructures to scatter incident light very efficiently into diffraction modes, as shown in figure 6.11 Ideally, one would make this structure out of a dielectric material to avoid the same heating problems experienced with the plasmonic tweezers but in our approach an aluminum-coated diffraction grating is used as a one-dimensional periodic dielectric nanostructure. Although it is not a semiconductor, it did not experience significant heating and effectively trapped small particles with low trapping intensities, as shown in figure 7. Alignment of particles with the grating substrate conceptually validates the proposition that a 2-D photonic crystal could allow precise rotation of non-spherical micron sized particles.10 The efficiencies of these optical traps are increased due to the enhanced fields produced by the nanostructures described in this paper.

Plasmonic tweezers and photonic crystal nanostructures are shown to produce useful enhancements in the efficiency and orientation control of optically trapping micro- and nano-particles.

Utilização de Nanoestruturas Cristal plasmônicos e Fotônica para Manipulação de Micro-e Nanopartículas melhorada

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Síntese, Assembléia e Caracterização de monocamada Protected Films nanopartículas de ouro para Eletroquímica monocamada Protein

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

Projetado retalho do músculo vascularizada

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

A escala do Engineered enxertos vasculares Usando 3D Impresso Guides and the Ring método de empilhamento

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial bypass. Characterization of the growth dynamics and remodeling process of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered blood vessels (TEBVs) with pulsatile stimulation is crucial for vascular tissue engineering. Optical imaging techniques stand out as powerful tools for monitoring vascularization of engineered tissue enabling high-resolution imaging in real-time culture. This paper demonstrates a nondestructive and fast real-time imaging strategy to monitor the growth and remodeling of TEBVs in long-term culture by using optical coherence tomography (OCT). Geometric morphology is evaluated, including vascular remodeling process, wall thickness, and comparison of TEBV thickness in different culture time points and presence of pulsatile stimulation. Finally, OCT provides practical possibilities for real-time observation of the degradation of polymer in the reconstructing tissues under pulsatile stimulation or not and in each vessel segment, by compared with the assessment of polymer degradation using scanning electron microscopic(SEM) and polarized microscope.

A step by step protocol for nondestructive and long-period monitoring the process of vascular remodeling and scaffold degradation in real-time culture of biodegradable polymeric scaffold-based tissue-engineered blood vessels with pulsatile stimulation using optical coherence tomography is described here.

Monitoramento não destrutiva de desenvolvimento degradáveis baseados em andaime engenharia de tecidos dos vasos sanguíneos, usando a tomografia de coerência óptica

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

Enxerto projetado por tecido para reconstrução circunferencial do Esôfago em Ratos

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

Auto-montagem de ácidos nucleicos de peptídeos modificados gama em nanoestruturas complexas em misturas de solventes orgânicos

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that cut outside of their recognition sites and create a short overhang. This modular cloning (MoClo) system uses a hierarchical workflow in which different DNA parts, such as promoters, coding sequences (CDS), and terminators, are first cloned into an entry vector. Multiple entry vectors then assemble into transcription units. Several transcription units then connect into a multi-gene plasmid. The Golden Gate cloning strategy is of tremendous advantage because it allows scar-less, directional, and modular assembly in a one-pot reaction. The hierarchical workflow typically enables the facile cloning of a large variety of multi-gene constructs with no need for sequencing beyond entry vectors. The use of fluorescent protein dropouts enables easy visual screening. This work provides a detailed, step-by-step protocol for assembling multi-gene plasmids using the yeast modular cloning (MoClo) kit. We show optimal and suboptimal results of multi-gene plasmid assembly and provide a guide for screening for colonies. This cloning strategy is highly applicable for yeast metabolic engineering and other situations in which multi-gene plasmid cloning is required.

The goal of this protocol is to provide a detailed, step-by-step guide for assembling multi-gene constructs using the modular cloning system based on Golden Gate cloning. It also gives recommendations on critical steps to ensure optimal assembly based on our experiences.

Montagem rápida de construções multigênicas usando clonagem modular de golden gate

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...