Se prestó apoyo financiero a JMS de los NIH Biomecánica en el Programa de Capacitación T32 Medicina Regenerativa (2T32EB003392), a QJ del Dowd-ICES Fellowship y para AWF del Premio Innovador Nueva del director del NIH (1DP2HL117750).

1. Fabricación de Molde Maestro Usando Fotolitografia <ol><li> Las nanofibras de proteínas ECM, nanofabrics y nanoestructuras para ser fabricados primero se diseñaron utilizando diseño asistido por ordenador (CAD) software. Este archivo CAD se transfiere entonces a una fotomáscara. El tipo de fotomáscara dependerá de la resolución de las características; con una foto máscara basada en la transparencia adecuada para la función de los tamaños de hasta ~ 10 micras. Características más pequeñas &lt;10 micras requerirá un cromo en photomask vidrio. Todas las nanofibras y nanoestructuras presentados aquí fueron fabricados utilizando una fotomáscara a base de la transparencia, y por lo tanto eran a escala nanométrica en espesor pero no dimensiones laterales. Nota: Es importante distinguir qué regiones del photomask serán oscuro (evitar que la luz UV para pasar a través) y que será transparente (permite que la luz pase a través de los rayos UV), ya que, junto con el tipo de fotoprotector (positivo o negativo) , dictará la topografía final del molde maestro. </li><li> Para empezar la fabricación del molde maestro, deshidratar una oblea de 4 &quot;de silicio colocándolo en una placa caliente ajustado a 150 ° C durante 15 min. </li><li> Centre la oblea en el plato de vacío de un spin-revestidor. Vierta SU8-2015 fotorresistente negativa sobre el centro de la oblea y continuar vertiendo en círculos concéntricos hasta aproximadamente dos tercios de la oblea está cubierto. Nota: Mantenga la botella de SU8 cerca de la oblea cuando se vierte a minimizar la formación de burbujas. </li><li> Programar el spincoater de la siguiente manera: <ul><li> Ciclo de propagación: 500 rpm con una aceleración de 100 rpm / s durante 10 s. </li><li> El ciclo de centrifugado: 4000 rpm con una aceleración de 100 rpm / s durante 30 seg. </li></ul> Nota: Esta receta spincoating formará una capa fotorresistente que es de ~ 10 m de espesor. Al cambiar la velocidad de hilatura o la formulación de SU8, el espesor se puede ajustar. </li><li> Soft hornear la oblea colocándolo en una placa caliente ajustado a 95 ° C durante 3 min. </li><li> Exponer la oblea con luz UV a travésla fotomáscara para una dosis total de 140 mJ / cm 2. Nota: SU8 es un fotoprotector negativo, por tanto, las regiones donde la luz UV es capaz de pasar a través de la fotomáscara permanecerán después del revelado y convertido en características planteadas en el molde maestro. </li><li> Publique exposición hornear la oblea, colocándolo sobre una placa caliente ajustado a 95 ° C durante 4 min. </li><li> Desarrollar la oblea colocándolo en desarrollador SU8 durante 3 min. Después de 3 minutos, enjuague la oblea con alcohol isopropílico. Si se produce una película en blanco durante el enjuague, la oblea no está completamente desarrollado y debe ser colocado de nuevo en el revelador durante otros 30 seg. Enjuague de nuevo con alcohol isopropílico. Repita este proceso hasta que una película en blanco no se forma durante el enjuague de alcohol isopropílico. </li><li> Seque la oblea en una corriente de nitrógeno y colocar en una placa de Petri de 150 mm para proteger del polvo. </li></ol> 2. Realización de los Sellos de PDMS <ol><li> Preparar el prepolímero de PDMS mediante la combinación de la base de elastómero y agente de curado en un10:01 relación w / w. Normalmente se utilizan 80 g de base y 8 g de agente de curado para asegurar que no PDMS suficientes para cubrir el molde maestro en una capa de 1 cm de espesor. </li><li> Mezclar y desgasificar el PDMS utilizando un mezclador centrípeta se establece en lo siguiente: <ul><li> Mezclar: 2000 rpm durante 2 minutos </li><li> Degas: 2000 rpm durante 2 min. </li></ul></li><li> Si no está disponible un mezclador mezclar los PDMS con la mano durante 10 min utilizando una pipeta serológica de 10 ml. Desgasificar la mezcla mediante la colocación en un desecador de vacío durante 30 min para eliminar las burbujas. </li><li> Vierta suficiente prepolímero de PDMS sobre el molde maestro (modelado de la oblea de silicio) para formar una capa de 1 cm de espesor. Curar el PDMS por cocción a 65 ° C durante 4 horas o a temperatura ambiente durante 48 h. </li><li> Una vez curado, Las regiones que contienen los patrones se pueden cortar para formar los sellos PDMS. Para distinguir el lado característica de la parte trasera del sello PDMS, cortar una muesca de una de las esquinas en la parte trasera del sello. </li></ol> 3. Microcontacto PrInting de Patrones de ECM <ol><li> Limpiar cubreobjetos de vidrio de diámetro 25 mm por sonicación en etanol al 95% durante 1 hora y luego se seca en un horno de 65 ° C. </li><li> Preparar la solución de PIPAAm disolviendo PIPAAm en 1-butanol a una concentración de 10% (w / v, típicamente de 1 g en 10 ml). </li><li> Centre un cubreobjetos de vidrio en el plato de vacío de los spincoater y de pipeta 200 l de la solución PIPAAm de modo que toda la superficie de vidrio está cubierta. </li><li> Spincoat el cubreobjetos a 6.000 rpm durante 1 min. </li><li> Limpiar los sellos PDMS por sonicación en etanol al 50% durante 30 min y luego seco bajo una corriente de nitrógeno. Nota: El secado y pasos posteriores deben realizarse en una cabina de bioseguridad para mantener la esterilidad para aplicaciones donde se utilizan las nanoestructuras de ECM con las células. </li><li> Cubra la superficie estampada de cada PDMS sello con 200 l de la solución de proteína, típicamente 50 mg / ml en agua destilada estéril para FN. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Nota: Thes el recubrimiento de volumen es para un sello de PDMS 1,5 cm 2 y tendrá que ser ajustada en función del tamaño del sello de PDMS, la proteína de ECM utilizado y de la concentración de la proteína en solución de ECM. </li><li> Lave los sellos PDMS en agua destilada para eliminar el exceso de proteínas y seque bien bajo una corriente de nitrógeno. Nota: Cualquier agua que queda en el sello se activará la disolución prematura de la capa PIPAAm sobre el cubreobjetos y evitar la transferencia de la proteína adecuada. </li><li> Para la fabricación estéril, colocar el cubreobjetos recubiertos de PIPAAm dentro de una caja de petri cerrada y esterilizar mediante exposición a rayos UV, 45 minutos bajo la luz UV en un gabinete de bioseguridad es suficiente. Si no se requiere esterilidad este paso se puede omitir. </li><li> Realizar la impresión por microcontacto mediante la colocación de la parte característica de la marca de PDMS en contacto con el cubreobjetos recubiertos de PIPAAm. Si es necesario, el uso de fórceps para golpear ligeramente en la parte posterior de los sellos para eliminar las burbujas de aire y asegurar un contacto uniforme. </li><li> Después de 5 millasn, retire el sello PDMS del cubreobjetos. </li><li> En esta etapa, las proteínas ECM adicionales pueden ser modelados para crear estructuras más complejas y de múltiples componentes. Hasta 3 impresiones han sido verificados para trabajar con este proceso, y más pueden ser factibles. </li></ol> 4. Liberación de ECM nanofibras y nanoestructuras <ol><li> Coloque el PIPAAm cubreobjetos recubiertos con dibujos en una placa de Petri de 35 mm e inspeccionar la fidelidad patrón usando microscopía de contraste de fase. Dependiendo del modelo, una cámara CCD puede ser necesario para resolver las características del patrón. La microscopía de fluorescencia también se puede utilizar para inspeccionar el patrón proporcionado las proteínas ECM están etiquetados con fluorescencia. </li><li> Añadir 3 ml de agua destilada a 40 ° C a la placa de Petri y dejar que el agua poco a poco fresco. </li><li> La disolución de la capa de PIPAAm y la liberación de los patrones de proteínas de ECM se pueden monitorizar mediante microscopía de contraste de fase. Si la aplicación no permite el uso de tec ópticahniques, la liberación se puede controlar mediante la medición de la temperatura de la solución. Típicamente, el agua se enfría a temperatura ambiente, muy por debajo de la LCST de PIPAAm (32 ° C), para garantizar las nanoestructuras de proteínas ECM han sido puestos en libertad. </li><li> Después de la liberación, las nanofibras, nanofabrics y otras nanoestructuras están flotando en el agua. Para utilizarlos para otras aplicaciones que necesitan para ser manipulados. El enfoque exacto dependerá del objetivo experimental y puede incluir etapas tales como la inmovilización sobre otra superficie, que se mueve con un sistema micromanipulador o incrustar en un hidrogel. </li></ol>

<ol>
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El método SIA presenta aquí imita la matriz de montaje mediada por células y permite la ingeniería de nanofibras y nanoestructuras de proteínas ECM con el tamaño sintonizable, organización y composición. Aunque no es idéntica a la ECM de células generadas, SIA crea ECM compuesta de fibrillas de proteína nanoescala 20 que se someten plegable reversible / desplegado durante la tensión mecánica 21 y se pueden unir las células 20. Esto proporciona una capacidad única para cons...

La matriz extracelular (ECM) en los tejidos se compone de proteínas multifuncionales implicadas en la regulación física y química de múltiples procesos celulares, incluyendo la adhesión, la proliferación, la diferenciación, la apoptosis y 1-3. El ECM está sintetizado, ensamblado, y organizada por las células y las fibrillas de proteínas constituyentes tienen composiciones únicas, tamaño de la fibra, geometrías y arquitecturas interconectadas que varían con el tipo de tejido y la etapa de desarrollo. Trabajos recientes han demostrado que el ECM puede proporcionar señales instructivas para guiar a las células para formar tejidos de ingeniería 4, lo que sugiere que la recapitulación de la ECM en términos de composición y estructura podría permitir el desarrollo de materiales biomiméticos para aplicaciones de ingeniería de tejidos y de biotecnología. Un número de métodos de fabricación se han desarrollado para diseñar andamios poliméricos que pueden imitar aspectos de la ECM en los tejidos. Por ejemplo, electrospinning y separ faseción han demostrado tanto la capacidad para formar matrices porosas de fibras con diámetros que van desde decenas de micrómetros abajo hasta decenas de nanómetros 5-7. Ambas técnicas han demostrado también que las matrices altamente porosas de nanofibras pueden apoyar la adhesión celular y la infiltración en el armazón 8. Sin embargo, estos métodos son limitados en las geometrías de fibra, orientaciones y 3D posibles arquitecturas que se pueden crear. Electrospinning produce típicamente andamios con fibras orientadas al azar o ya sea altamente alineados mientras que la separación de fases produce andamios con fibras orientadas al azar. También hay limitaciones en los materiales, con los investigadores típicamente usando polímeros sintéticos, tales como poli (ε-caprolactona) 8 y poli (ácido láctico-co-glicólico) 9, que posteriormente se recubre con proteínas de ECM para promover la adhesión celular. También se utilizan los biopolímeros naturales, incluyendo el colágeno de tipo I 10, gelatina 11, fibrinógeno 12,quitosano 13, 14 y seda, pero representan sólo una pequeña parte de las proteínas que se encuentran en el tejido nativo. La mayoría de los tejidos contienen un medio más grande de proteínas ECM y polisacáridos incluyendo la fibronectina (FN), laminina (LN), colágeno tipo IV y ácido hialurónico que son difíciles o imposibles de fabricar nanofibras utilizando métodos existentes. Para hacer frente a este desafío, hemos centrado nuestros esfuerzos de investigación en la imitación de la forma en las células de sintetizar, reunir y organizar las fibrillas de proteínas ECM en sus alrededores. Mientras que el proceso de fibrilogénesis específica varía para diferentes proteínas ECM, típicamente un cambio conformacional en la molécula de proteína de ECM se activa por un enzimática o la interacción mediada por receptor, que expone sitios de autoensamblaje crípticos. Aquí se utiliza FN como un sistema modelo para comprender mejor el proceso de fibrilogénesis. Brevemente, homodímeros FN se unen a los receptores de integrina en la superficie celular a través de la secuencia de aminoácidos RGD en el décimo tipo IIRepito unidad. Una vez unido, las integrinas se separan a través de la contracción actomiosina y despliegan los dímeros FN para exponer los sitios de autoensamblaje crípticos. La exposición de estos sitios de unión FN FN-permite a los dímeros de FN para montar en un fibrillas insolubles a la derecha en la superficie de la célula 15. El trabajo en sistemas libres de células se ha demostrado que los sitios crípticos vinculantes FN-FN pueden ser revelados a través de desarrollo usando desnaturalizantes 16 o la tensión superficial en la interfase aire-líquido-sólido 17-19. Sin embargo, las fibras FN creados por estas técnicas se limitan a los tamaños y geometrías de fibra específicas y típicamente se une a una superficie. Aquí se describe un conjunto iniciado por superficie denominado enfoque (SIA) 20 que supera estas limitaciones mediante la utilización de las interacciones proteína-superficie para crear exentas nanofibras insolubles, nanofabrics (planos 2D) y otras nanoestructuras compuestas de proteínas únicas o múltiples de ECM (Figura 1 ). En esta proceso, proteínas ECM se adsorben a partir de una conformación compacta, globular en solución y parcialmente desnaturalizado (desplegado) en una, polidimetilsiloxano (PDMS) hidrófobo el sello estampado. Las proteínas ECM se transfieren entonces en este estado en un poli térmicamente sensible (N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) superficie a través de la impresión por microcontacto 22. Cuando se hidrata con 40 ° C el agua la PIPAAm sigue siendo un sólido, pero cuando se enfría a 32 ° C que pasa a través de una temperatura de solución crítica inferior (LCST) donde se convierte en hidrófila, se hincha con agua y luego se disuelve, la liberación de las nanoestructuras de ECM montados fuera de la superficie. El método SIA proporciona control sobre las dimensiones con precisión a escala nanométrica. Mediante el control de los parámetros clave tales como la composición, la geometría de la fibra, y la arquitectura, es posible recapitular muchas propiedades de la ECM se han encontrado in vivo y para desarrollar andamios avanzados para aplicaciones de ingeniería de tejidos y de biotecnología.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm</td>
			<td style="width:145px;">Polysciences</td>
			<td style="width:123px;">21458-10</td>
			<td style="width:167px;">40,000 Mw</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone kit (PDMS)</td>
			<td style="width:145px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;">Mix 10 parts base with 1 part curing agent.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Butanol</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354008</td>
			<td style="width:167px;">Human, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Laminin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354239</td>
			<td style="width:167px;">Ultrapure, mouse, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Negative Photoresist</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;">SU8-2015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SU8 Developer</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:216px;">Sonicator Branson M3510</td>
			<td style="width:145px;">Branson Ultrasonic Corporation</td>
			<td style="width:123px;">CPN-952-318</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">Thinky ARE-250 Mixer</td>
			<td style="width:145px;">Thinky Corporation</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Spincoater</td>
			<td style="width:145px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:123px;">G3P-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glass cover 25mm diameter, No 1.5</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-86</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ecm protein nanofibers and nanostructures engineered using surface-initiated assembly

La matriz extracelular (ECM) en los tejidos se sintetiza y ensambla por las células para formar un fibrilar 3D, la red de proteínas con estrictamente regulados diámetro de la fibra, la composición y la organización. Además de proporcionar soporte estructural, las propiedades físicas y químicas de la ECM desempeñan un papel importante en varios procesos celulares que incluyen la adhesión, diferenciación y apoptosis. In vivo, el ECM se ensambla mediante la exposición de críptico de auto-ensamblaje (fibrilogénesis) sitios dentro de las proteínas . Este proceso varía para diferentes proteínas, pero la fibronectina (FN) fibrilogénesis es bien caracterizado y sirve como un sistema modelo para el montaje de ECM mediada por células. Específicamente, las células utilizan receptores de la integrina en la membrana celular para unirse dímeros FN y las fuerzas contráctiles de actomiosina-generada para desplegar y exponer sitios de unión para el montaje en fibras insolubles. Este proceso mediado por receptor permite que las células de montar y organizar el ECM desde el celular al tejido scales. A continuación, presentamos un conjunto iniciado por superficie método denominado (SIA), que recapitula el montaje matriz mediada por células mediante interacciones proteína-superficie para desplegar proteínas ECM y ensamblarlos en fibras insolubles. En primer lugar, las proteínas ECM se adsorben sobre un polidimetilsiloxano (PDMS) hidrófobo superficie donde se desnaturalizan parcialmente (desplegar) y exponen dominios de unión crípticos. Las proteínas no plegadas se transfieren luego en bien definidos micro y nanopatterns través de la impresión microcontacto sobre un poli térmicamente sensible (N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) superficie. Disolución térmicamente activado de la PIPAAm conduce hasta el montaje final y la liberación de nanofibras de proteínas ECM insolubles y nanoestructuras con geometrías bien definidas. Arquitecturas complejas son posibles por los patrones de ingeniería se define en los sellos PDMS utilizados para la impresión por microcontacto. Además de FN, el proceso de SIA se puede utilizar con la laminina, fibrinógeno y colágenos de tipo I y IV a crear nanoestructuras ECM de componentes múltiplesturas. Por lo tanto, SIA se puede utilizar para diseñar materiales a base de proteínas de ECM con un control preciso sobre la composición de proteínas, la geometría de la fibra y la arquitectura andamio con el fin de recapitular la estructura y la composición de la MEC in vivo.

SIA es capaz de ECM Ingeniería nanofibras de proteínas con un control preciso sobre dimensiones de la fibra. Para demostrar esto, las matrices de nanofibras FN con dimensiones planas de 50 x 20 m eran iguales en un cubreobjetos PIPAAm recubierto (Figura 2A). Tras la liberación, las fibras contratados porque estaban bajo una pre-tensión inherente al patrón en la superficie PIPAAm (Figura 2B). Análisis de las nanofibras FN reveló que eran monodispersas de pre-liberación con una lo...

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ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

Un método para obtener nanofibras y nanoestructuras complejas de proteínas de la matriz extracelular individuales o múltiples se describe. Este método utiliza las interacciones proteína-superficie para la creación de materiales a base de proteínas exentas con la composición sintonizable y la arquitectura para el uso en una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos y de biotecnología.

Las nanofibras ECM proteínas y Uso Asamblea Superficie iniciadas Nanoestructuras Engineered

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

ecm-protein-nanofibers-nanostructures-engineered-using-surface

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K vistas.  Carnegie Mellon University.  Un método para obtener nanofibras y nanoestructuras complejas de proteínas de la matriz extracelular individuales o múltiples se describe. Este método utiliza las interacciones proteína-superficie para la creación de materiales a base de proteínas exentas con la composición sintonizable y la arquitectura para el uso en una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos y de biotecnología. 

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Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Investigación

Bioingeniería

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological research. Perhaps the most widely used physical force to achieve noninvasive manipulation of small particles has been dielectrophoresis(DEP).1 However, DEP on its own lacks the versatility and precision that are desired when manipulating cells since it is traditionally done with stationary electrodes. Optical tweezers, which utilize a three dimensional electromagnetic field gradient to exert forces on small particles, achieve this desired versatility and precision.2 However, a major drawback of this approach is the high radiation intensity required to achieve the necessary force to trap a particle which can damage biological samples.3 A solution that allows trapping and sorting with lower optical intensities are optoelectronic tweezers (OET) but OET's have limitations with fine manipulation of small particles; being DEP-based technology also puts constraint on the property of the solution.4,5
This video article will describe two methods that decrease the intensity of the radiation needed for optical manipulation of living cells and also describe a method for orientation control. The first method is plasmonic tweezers which use a random gold nanoparticle (AuNP) array as a substrate for the sample as shown in Figure 1. The AuNP array converts the incident photons into localized surface plasmons (LSP) which consist of resonant dipole moments that radiate and generate a patterned radiation field with a large gradient in the cell solution. Initial work on surface plasmon enhanced trapping by Righini et al and our own modeling have shown the fields generated by the plasmonic substrate reduce the initial intensity required by enhancing the gradient field that traps the particle.6,7,8 The plasmonic approach allows for fine orientation control of ellipsoidal particles and cells with low optical intensities because of more efficient optical energy conversion into mechanical energy and a dipole-dependent radiation field. These fields are shown in figure 2 and the low trapping intensities are detailed in figures 4 and 5. The main problems with plasmonic tweezers are that the LSP's generate a considerable amount of heat and the trapping is only two dimensional. This heat generates convective flows and thermophoresis which can be powerful enough to expel submicron particles from the trap.9,10 The second approach that we will describe is utilizing periodic dielectric nanostructures to scatter incident light very efficiently into diffraction modes, as shown in figure 6.11 Ideally, one would make this structure out of a dielectric material to avoid the same heating problems experienced with the plasmonic tweezers but in our approach an aluminum-coated diffraction grating is used as a one-dimensional periodic dielectric nanostructure. Although it is not a semiconductor, it did not experience significant heating and effectively trapped small particles with low trapping intensities, as shown in figure 7. Alignment of particles with the grating substrate conceptually validates the proposition that a 2-D photonic crystal could allow precise rotation of non-spherical micron sized particles.10 The efficiencies of these optical traps are increased due to the enhanced fields produced by the nanostructures described in this paper.

Plasmonic tweezers and photonic crystal nanostructures are shown to produce useful enhancements in the efficiency and orientation control of optically trapping micro- and nano-particles.

Utilización de nanoestructuras fotónicas de cristal plasmónicos y para la manipulación mejorada de Micro y nanopartículas

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Síntesis, de la Asamblea, y caracterización de una sola capa de nanopartículas de oro protegidas Films de Electroquímica de proteínas monocapa

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

Diseñado vascularizado colgajo de músculo

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

El escalado de Engineered injertos vasculares Usando 3D Impreso guías y el método de anillo de apilamiento

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial bypass. Characterization of the growth dynamics and remodeling process of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered blood vessels (TEBVs) with pulsatile stimulation is crucial for vascular tissue engineering. Optical imaging techniques stand out as powerful tools for monitoring vascularization of engineered tissue enabling high-resolution imaging in real-time culture. This paper demonstrates a nondestructive and fast real-time imaging strategy to monitor the growth and remodeling of TEBVs in long-term culture by using optical coherence tomography (OCT). Geometric morphology is evaluated, including vascular remodeling process, wall thickness, and comparison of TEBV thickness in different culture time points and presence of pulsatile stimulation. Finally, OCT provides practical possibilities for real-time observation of the degradation of polymer in the reconstructing tissues under pulsatile stimulation or not and in each vessel segment, by compared with the assessment of polymer degradation using scanning electron microscopic(SEM) and polarized microscope.

A step by step protocol for nondestructive and long-period monitoring the process of vascular remodeling and scaffold degradation in real-time culture of biodegradable polymeric scaffold-based tissue-engineered blood vessels with pulsatile stimulation using optical coherence tomography is described here.

Monitoreo no destructivos del desarrollo Degradable andamio base ingeniería de tejido vascular mediante tomografía de coherencia óptica

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

Injerto con ingeniería de tejido para la reconstrucción esofágica circunferencial en ratas

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

Autoensamble de ácidos nucleicos de péptidos modificados con gamma en nanoestructuras complejas en mezclas de disolventes orgánicos

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that cut outside of their recognition sites and create a short overhang. This modular cloning (MoClo) system uses a hierarchical workflow in which different DNA parts, such as promoters, coding sequences (CDS), and terminators, are first cloned into an entry vector. Multiple entry vectors then assemble into transcription units. Several transcription units then connect into a multi-gene plasmid. The Golden Gate cloning strategy is of tremendous advantage because it allows scar-less, directional, and modular assembly in a one-pot reaction. The hierarchical workflow typically enables the facile cloning of a large variety of multi-gene constructs with no need for sequencing beyond entry vectors. The use of fluorescent protein dropouts enables easy visual screening. This work provides a detailed, step-by-step protocol for assembling multi-gene plasmids using the yeast modular cloning (MoClo) kit. We show optimal and suboptimal results of multi-gene plasmid assembly and provide a guide for screening for colonies. This cloning strategy is highly applicable for yeast metabolic engineering and other situations in which multi-gene plasmid cloning is required.

The goal of this protocol is to provide a detailed, step-by-step guide for assembling multi-gene constructs using the modular cloning system based on Golden Gate cloning. It also gives recommendations on critical steps to ensure optimal assembly based on our experiences.

Montaje rápido de construcciones multigénicas mediante clonación modular Golden Gate

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...