העניקה תמיכה כספית לJMS מיומכניקה NIH בתכנית רפואת רגנרטיבית T32 הדרכה (2T32EB003392), לQJ ממלגת דאוד-ICES וAWF מפרס ממציא ניו המנהל של NIH (1DP2HL117750).

1. ייצור של עובש מאסטר באמצעות photolithography <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Nanofibers חלבון ECM, nanofabrics וננו להיות מפוברק נועדו ראשון באמצעות תכנון בעזרת מחשב תוכנה (CAD). קובץ CAD זה הוא הועבר לאחר מכן לphotomask. הסוג של photomask יהיה תלוי ברזולוציה של התכונות; עם photomask מבוסס שקיפות נאותה לגדלי תכונה עד ~ 10 מיקרומטר. תכונות קטנות &lt;10 מיקרומטר ידרשו כרום על photomask זכוכית. כל nanofibers וננו שהוצג כאן היו מפוברק באמצעות photomask מבוסס שקיפות, וכך היו בקנה מידה ננומטרי בעובי אבל ממדים לא לרוחב. הערה: חשוב להבחין אילו אזורים של photomask יהיו כהים (למנוע אור UV לעבור) ושיהיה שקוף (מאפשר אור UV לעבור) כמו זה, יחד עם הסוג של photoresist (חיובי או שלילי) , יכתיב את הטופוגרפיה הסופית של עובש האב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל ייצור של עובש האב, מייבש את פרוסות סיליקון 4 &quot;על ידי הצבתו על פלטה חמה להגדיר ל-C ° 150 ל15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכז את רקיק על צ&#39;אק הוואקום של ספין coater. יוצקים SU8-2015 photoresist השלילי על אמצע רקיק ותמשיך לשפוך במעגלים קונצנטריים, עד כשני שליש מהפרוסות מכוסה. הערה: שמור את בקבוק קרוב SU8 לרקיק כאשר לשפוך כדי למזער את היווצרותן של בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנת את spincoater כדלקמן: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור התפשטות: סל&quot;ד 500 עם האצת 100 סל&quot;ד / שניות ל10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סחיטה: 4,000 סל&quot;ד עם האצת 100 סל&quot;ד / שניות ל30 שניות. </li></ul> הערה: מתכון spincoating זה יהווה שכבת photoresist שהיא ~ 10 מיקרומטר בעובי. על ידי שינוי מהירות ספינינג או ניסוח SU8, ניתן להתאים את העובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רך לאפות את רקיק על ידי הצבתו על פלטה חמה שנקבעה ל95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את רקיק עם אור האולטרה סגול דרךphotomask למינון כולל של 140 mJ / 2 סנטימטר. הערה: SU8 הוא photoresist שלילי ולכן האזורים בהם אור UV הוא מסוגל לעבור photomask יישארו לאחר הפיתוח ולהפוך לתכונות שהועלו על תבנית האב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חשיפה לאפות את רקיק על ידי הצבתו על פלטה חמה להגדיר ל-C ° 95 למשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את רקיק על ידי הצבתו במפתח SU8 במשך 3 דקות. לאחר 3 דקות, לשטוף את רקיק עם אלכוהול איזופרופיל. אם סרט לבן מופק במהלך השטיפה, רקיק אינו מפותח באופן מלא וזה צריך להיות ממוקם בגב המפתח ל30 שניות אחרת. לשטוף שוב עם אלכוהול איזופרופיל. חזור על תהליך זה עד שסרט לבן לא הטופס במהלך שטיפת אלכוהול איזופרופיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את רקיק בזרם של חנקן ומניחים בצלחת פטרי 150 מ&quot;מ כדי להגן מפני אבק. </li></ol> 2. ביצוע בולים PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את prepolymer PDMS על ידי שילוב של בסיס אלסטומר וסוכן הריפוי ב10:01 יחס w / w. בדרך כלל 80 גרם של בסיס ו8 גרם של סוכן ריפוי נמצא בשימוש על מנת להבטיח שיש PDMS מספיק כדי לכסות את התבנית השנייה בשכבה בעובי 1 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים ודגת PDMS בעזרת מערבל הצנטריפטלי מוגדר הבא: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים: 2,000 סל&quot;ד 2 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגה: 2,000 סל&quot;ד במשך 2 דקות. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מערבל אינו זמין לערבב PDMS ביד עבור 10 דקות באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מיליליטר. דגה את התערובת על ידי הצבתו בייבוש ואקום ל30 דקות כדי להסיר בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים prepolymer PDMS מספיק על עובש האב (פרוסות סיליקון בדוגמת) כדי ליצור שכבה בעובי 1 סנטימטר. Cure PDMS על ידי אפייה ב65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות או בטמפרטורת חדר למשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שנרפא, ניתן לחתוך את האזורים המכילים את התבניות כדי ליצור את חותמות PDMS. כדי להבדיל בין צד התכונה מהישבן של חותמת PDMS, לחתוך חריץ מאחת הפינות בצד האחורי של הבול. </li></ol> 3. Microcontact Printing של דפוסי ECM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips זכוכית קוטר 25 מ&quot;מ נקי על ידי sonication ב95% אתנול עבור שעה 1 ולאחר מכן יבשה בתנור 65 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון PIPAAm ידי המסת PIPAAm ב1-butanol בריכוז של 10% (w / v, 1 גרם בדרך כלל ב10 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכז coverslip זכוכית על צ&#39;אק הוואקום של spincoater ופיפטה 200 μl של פתרון PIPAAm כך שכל משטח הזכוכית מכוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spincoat coverslip ב6,000 סל&quot;ד דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את בולי PDMS על ידי sonication ב50% אתנול ל30 דקות ולאחר מכן יבשה תחת זרם של חנקן. הערה: ייבוש והשלבים הבאים צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי כדי לשמור על סטריליות ליישומים שבם ננו ECM ישמש בתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעייל את פני השטח בדוגמתו של כל PDMS להחתים עם 200 μl של פתרון החלבון, בדרך כלל 50 מיקרוגרם / מיליליטר במים מזוקקים סטריליים לFN. דגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. הערה: ההוא ציפוי הנפח הוא לחותמת PDMS 1.5 2 סנטימטר וצריכה להיות מותאם בהתאם לגודל של בול PDMS, חלבון ECM משמש ואת הריכוז של חלבון ECM בתמיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את בולי PDMS במים מזוקקים כדי להסיר חלבון ויבש עודפים ביסודיות תחת זרם של חנקן. הערה: כל מים שנשארו על החותמת יפעילו את הפירוק המוקדם של ציפוי PIPAAm על coverslip ולמנוע העברת חלבון תקינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ייצור סטרילי, הנח את coverslips מצופה PIPAAm בתוך צלחת פטרי סגורה ולעקר באמצעות חשיפה לקרינת UV, 45 דקות תחת אור UV בארון בטיחות ביולוגי הוא מספיק. אם אין צורך בסטריליות ניתן להשמיט את הצעד הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדפסת microcontact על ידי הצבת בצד התכונה של חותמת PDMS במגע עם coverslip מצופה PIPAAm. במידת צורך, להשתמש במלקחיים כדי לנצל באורח קל בצד האחורי של הבולים כדי להסיר כל בועות אוויר ולהבטיח מגע אחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 ק&quot;מn, לקלף את חותמת PDMS מcoverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, ניתן בדוגמת חלבוני ECM נוספים כדי ליצור מבנים מורכבים יותר וmulticomponent. עד 3 הדפסות אומתו לעבוד עם תהליך זה, ועוד יכול להיות ריאלי. </li></ol> 4. שחרור ECM Nanofibers וננו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslip PIPAAm הדוגמת המצופה בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ ולבדוק את נאמנות הדפוס באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב. בהתאם לדגם, מצלמת CCD עשויה להיות נחוצה כדי לפתור את התכונות של הדפוס. גם מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול לשמש כדי לבדוק את הדפוס סיפק את חלבוני ECM שכותרתו fluorescently. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר של מים 40 ° C מזוקקים לצלחת פטרי ולאפשר למים קרירים בהדרגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירוקה של שכבת PIPAAm ושחרורו של דפוסי חלבון ECM ניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב. אם היישום אינו מאפשר השימוש בטק האופטיhniques, השחרור יכול להיות במעקב על ידי מדידת טמפרטורת הפתרון. בדרך כלל, המים מקוררים לטמפרטורת חדר, גם מתחת לLCST של PIPAAm (32 מעלות צלזיוס), כדי להבטיח את ננו חלבון ECM כבר פורסם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שחרורו, nanofibers, nanofabrics וננו האחר צפים במים. כדי להשתמש בם ליישומים נוספים שהם צריכים לטפל. הגישה המדויקת תהיה תלויה במטרה הניסיונית ועשויה לכלול צעדים כגון לשתק על משטח אחר, נעו עם מערכת micromanipulator או ההטבעה בהידרוג&#39;ל. </li></ol>

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+crosstalk+between+the+extracellular+matrix+and+the+cytoskeleton.">Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).</li><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate.">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14, 213-221 (2008).</li><li>Teo, W. E., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+electrospinning+design+and+nanofibre+assemblies.">A review on electrospinning design and nanofibre assemblies.</a> Nanotechnology. 17, (2006).</li><li>Reneker, D. H., Chun, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometre+diameter+fibres+of+polymer,+produced+by+electrospinning.">Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning.</a> Nanotechnology. 7, 216-21 (1996).</li><li>Ma, P. X., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+nano-scale+fibrous+extracellular+matrix.">Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 46, 60-72 (1999).</li><li>Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biodegradable+nanofiber+scaffold+by+electrospinning+and+its+potential+for+bone+tissue+engineering.">A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).</li><li>Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+structure:+a+novel+scaffold+for+tissue+engineering.">Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 60, 613-621 (2002).</li><li>Matthews, J. A., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electrospinning of Collagen Nanofibers. Biomacromolecules. 3, 232-238 (2002).</li><li>Huang, Z. -. M., Zhang, Y. Z., Ramakrishna, S., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+and+mechanical+characterization+of+gelatin+nanofibers.">Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers.</a> Polymer. 45, 5361-5368 (2004).</li><li>Wnek, G. E., Carr, M. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electrospinning of Nanofiber Fibrinogen Structures. Nano Letters. 3, 213-216 (2002).</li><li>Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+chitosan-based+nanofibers+and+their+cellular+compatibility.">Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility.</a> Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).</li><li>Jin, H. -. J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G. H., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow+stromal+cell+responses+on+electrospun+silk+fibroin+mats.">Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats.</a> Biomaterials. 25, 1039-1047 (2004).</li><li>Wierzbicka-Patynowski, I., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+fibronectin+matrix+assembly.">The ins and outs of fibronectin matrix assembly.</a> Journal of Cell Science. 116, 3269-3276 (2003).</li><li>Mosher, D. F., Johnson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+formation+of+disulfide-bonded+fibronectin+multimers.">In vitro formation of disulfide-bonded fibronectin multimers.</a> Journal of Biological Chemistry. 258, 6595-6601 (1983).</li><li>Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+to+mechanically+tune+and+optically+probe+fibrillar+fibronectin+conformations+from+fully+relaxed+to+breakage.">Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage.</a> Matrix Biology. 27, 451-461 (2008).</li><li>Ulmer, J., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-induced+fibronectin+fibrillogenesis+in+vitro.">Force-induced fibronectin fibrillogenesis in vitro.</a> Soft Matter. 4, 1998-2007 (2008).</li><li>Klotzsch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+forms+the+most+extensible+biological+fibers+displaying+switchable+force-exposed+cryptic+binding+sites.">Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. , (2009).</li><li>Feinberg, A. W., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-Initiated+Assembly+of+Protein+Nanofabrics.">Surface-Initiated Assembly of Protein Nanofabrics.</a> Nano Letters. 10, 2184-2191 (2010).</li><li>Deravi, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Contributions+of+Conformation+Extension+and+Domain+Unfolding+to+Properties+of+Fibronectin+Nanotextiles.">Differential Contributions of Conformation Extension and Domain Unfolding to Properties of Fibronectin Nanotextiles.</a> Nano Letters. 12, 5587-5592 (2012).</li><li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing+of+Proteins+for+Cell+Biology.">Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology.</a> J Vis Exp. , 1065 (2008).</li><li>Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+Involving+Multimodular+Proteins:+Converting+Force+into+Biochemical+Signals.">Mechanotransduction Involving Multimodular Proteins: Converting Force into Biochemical Signals.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שיטת SIA מוצגת כאן מחקה הרכבה מטריצת תא בתיווך ומאפשרת להנדסה של nanofibers חלבון ECM וננו עם גודל מתכונן, ארגון וקומפוזיציה. אמנם לא זהה לECM-תא שנוצר, SIA יוצר ECM מורכב מסיבי חלבון ננו 20 שעוברים קיפול הפיך / התגלגלות במהלך מאמץ מכאני 21 ויכולים להיקשר לתאים 20. זה...

המטריצה ​​תאית (ECM) ברקמות מורכבת מחלבונים רב תכליתיים המעורבים בויסות פיסיקלית וכימית של תהליכים בתא מרובים, כולל הידבקות, התפשטות, התמיינות, ואפופטוזיס 1-3. ECM הוא מסונתז, התאסף, ומאורגן על ידי תאים ויש להם את סיבי החלבון המרכיבים את יצירות ייחודיות, גודל סיבים, גיאומטריות וארכיטקטורות המחוברים ביניהם משתנות עם סוג רקמה ושלב התפתחותי. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי ECM יכול לספק מאלפות רמזים שינחה את התאים ליצירת רקמות מהונדסות 4, המצביעה על כך משחזר ECM במונחים של הרכב ומבנה עשוי לאפשר הפיתוח של חומרי biomimetic עבור יישומי הנדסה וביוטכנולוגיה רקמות. מספר שיטות ייצור פותחו כדי להנדס פיגומים פולימריים שיכול לחקות היבטים של ECM ברקמות. לדוגמא, electrospinning ומפריד, שלבation שניהם הפגין היכולת ליצור מטריצות נקבוביות של סיבים בקטרים ​​הנעים בין עשרות מיקרומטר עד עשרות ננומטרים 5-7. גם שני הטכניקות הראו כי מטריצות נקבוביות ביותר של nanofibers יכולות לתמוך הידבקות תא וחדיר לפיגום 8. עם זאת, גישות אלו מוגבלות בגיאומטריות סיבים, אוריינטציות ו3D הארכיטקטורות אפשריות שיכול להיות שנוצרו. Electrospinning בדרך כלל מייצר פיגומים בסיבים או בכיוון או מיושרים מאוד באופן אקראי ואילו הפרדת פאזות מייצרת פיגומים עם סיבים בכיוון באופן אקראי. יש גם מגבלות על החומרים, עם חוקרים בדרך כלל משתמשים בפולימרים סינטטיים, כגון פולי (ε-caprolactone) 8 ופולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) 9, כי הם מצופים לאחר מכן עם חלבוני ECM לקדם הידבקות תא. biopolymers הטבעית משמשות גם, לרבות סוג קולגן אני 10, ג&#39;לטין 11, פיברינוגן 12,chitosan 13, ומשי 14, אבל מייצגים קבוצה קטנה בלבד של החלבונים הנמצאים ברקמות מקומיות. רוב הרקמות מכילות סביבה גדולה יותר של חלבוני ECM וסוכרים כוללים פיברונקטין (FN), laminin (LN), סוג IV קולגן וחומצה היאלורונית שקשים או בלתי אפשריים לפברק nanofibers תוך שימוש בשיטות קיימות. כדי להתמודד עם אתגר זה, אנו מתמקדים מאמצי המחקר שלנו במחקו את הדרך בה תאים לסנתז, להרכיב ולארגן את סיבי חלבון ECM בסביבתם. בעוד תהליך fibrillogenesis הספציפי משתנה לחלבוני ECM שונים, בדרך כלל שינוי קונפורמציה במולקולת חלבון ECM מופעל על ידי האנזימטית או אינטראקציה קולטן בתיווך, אשר חושף אתרי הרכבה עצמית נסתרים. כאן אנו משתמשים FN כמערכת מודל להבין את תהליך fibrillogenesis טוב יותר. בקצרה, homodimers FN להיקשר לקולטנים integrin על פני התא באמצעות רצף חומצות אמינו RGD בסוג 10th השניאני חוזר ליחידה. ברגע שחייב, integrins לנוע בנפרד באמצעות התכווצות actomyosin ולהתפתח הדימרים FN לחשוף אתרי הרכבה עצמית נסתרים. החשיפה של האתרים הללו FN-FN המחייבים מאפשרת הדימרים FN להרכיב ליפון מסיס תקין על פני תא 15. עבודה במערכות תא ללא הוכיחה שיכולים להתגלות אתרי FN-FN נסתרים מחייבים דרך התגלגלות באמצעות denaturants 16 או מתח פנים בנוזל מוצק אוויר ממשק 17-19. עם זאת, סיבי FN נוצרו על ידי טכניקות אלה מוגבלים לגדלי סיבים ספציפיים וגיאומטריות ומחויבות בדרך כלל למשטח. כאן אנו מתארים הרכבה גישה שמכונה ביוזמת פני השטח (SIA) 20 שמתגברת על מגבלות אלה על ידי ניצול אינטראקציות חלבון פני השטח כדי ליצור nanofibers חופשי עומד מסיס, nanofabrics (גיליונות 2D) ואחרים ננו מורכב מחלבוני ECM בודדים או מרובים (איור 1 ). בעמ &#39;זהrocess, חלבוני ECM הם adsorbed מקונפורמציה קומפקטית, כדורית בפתרון ומפוגל באופן חלקי (פרש) על גבי חותמת בדוגמת, polydimethylsiloxane הידרופובי (PDMS). אז חלבוני ECM מועברים במצב זה על פולי תרמית מגיבים (N-isopropylacrylamide) פני השטח (PIPAAm) באמצעות הדפסת microcontact 22. כאשר hydrated עם מים 40 ° C PIPAAm נותר מוצק, אבל כאשר התקררו 32 מעלות צלזיוס הוא עובר דרך טמפרטורה קריטית נמוך פתרון (LCST) שבו הוא הופך להיות הידרופילי, מתנפח עם מים ולאחר מכן מתמוסס, משחרר ננו ECM התאסף הנחה של על פני השטח. שיטת SIA מספקת שליטה על הממדים עם דיוק בקנה מידה ננומטרי. על ידי שליטה בפרמטרים מרכזיים כמו הרכב, גיאומטריה סיבים, ואדריכלות, אפשר לשחזר מאפיינים רבים של ECM מצאו in vivo ולפתח פיגומים מתקדמים עבור יישומי הנדסה וביוטכנולוגיה רקמות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm</td>
			<td style="width:145px;">Polysciences</td>
			<td style="width:123px;">21458-10</td>
			<td style="width:167px;">40,000 Mw</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone kit (PDMS)</td>
			<td style="width:145px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;">Mix 10 parts base with 1 part curing agent.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Butanol</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354008</td>
			<td style="width:167px;">Human, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Laminin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354239</td>
			<td style="width:167px;">Ultrapure, mouse, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Negative Photoresist</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;">SU8-2015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SU8 Developer</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:216px;">Sonicator Branson M3510</td>
			<td style="width:145px;">Branson Ultrasonic Corporation</td>
			<td style="width:123px;">CPN-952-318</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">Thinky ARE-250 Mixer</td>
			<td style="width:145px;">Thinky Corporation</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Spincoater</td>
			<td style="width:145px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:123px;">G3P-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glass cover 25mm diameter, No 1.5</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-86</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ecm protein nanofibers and nanostructures engineered using surface-initiated assembly

המטריצה ​​תאית (ECM) ברקמות היא מסונתזת ונאספה על ידי תאים ליצירת סיבי 3D, רשת חלבון עם מוסדר היטב בקוטר סיבים, קומפוזיציה וארגון. בנוסף למתן תמיכה מבנית, התכונות הפיסיקליות וכימיות של ECM לשחק תפקיד חשוב בתהליכים תאיים רבים, כולל הידבקות, בידול, ואפופטוזיס. בvivo, ECM מורכב על ידי חשיפת הרכבה עצמית הנסתרת אתרים (fibrillogenesis) בתוך חלבונים . תהליך זה משתנה לחלבונים שונים, אבל fibrillogenesis פיברונקטין (FN) מאופיין היטב ומשמש כמערכת מודל להרכבת ECM תא בתיווך. באופן ספציפי, תאים משתמשים בקולטנים integrin על קרום התא כדי לאגד הדימרים FN וכוחות התכווצות-actomyosin נוצר כדי להתפתח ולחשוף את אתרי קישור להרכבה לסיבים לא מסיסים. תהליך בתיווך קולטן זה מאפשר לתאים כדי להרכיב ולארגן ECM מהסלולרי לSCA רקמהles. כאן, אנו מציגים שיטת הרכבה מכונה ביוזמת פני השטח (SIA), אשר משחזרת הרכבה מטריצת תא בתיווך באמצעות אינטראקציות חלבון פני השטח כדי להתפתח חלבוני ECM ולהרכיב אותם לסיבים לא מסיסים. ראשית, חלבוני ECM הם על adsorbed polydimethylsiloxane הידרופובי פני השטח (PDMS) שבו הם לפגל באופן חלקי (unfold) ולחשוף תחומים המחייבים נסתרים. אז חלבוני פרש מועברים במייקרו וnanopatterns המוגדרים היטב באמצעות הדפסת microcontact על פולי תרמית מגיבים (N-isopropylacrylamide) פני השטח (PIPAAm). פירוק תרמי-מופעל של PIPAAm מוביל להרכבה ושחרורו של nanofibers מסיס חלבון ECM וננו בגיאומטריות מוגדרות היטב סופיים. ארכיטקטורות מורכבות אפשריות על ידי דפוסים הנדסיים מוגדר על בולי PDMS המשמשים להדפסת microcontact. בנוסף לFN, תהליך SIA ניתן להשתמש עם laminin, פיברינוגן וcollagens להקליד אני ורביעי כדי ליצור nanostruc ECM מרובה רכיביםטורס. לפיכך, SIA יכול לשמש מהנדס חומרים מבוסס חלבון ECM עם שליטה מדויקת על הרכב חלבון, סיבי הגיאומטריה ואדריכלות פיגום על מנת לשחזר את המבנה והרכב של ECM in vivo.

SIA מסוגל nanofibers חלבון ECM ההנדסה עם שליטה מדויקת ממדי סיבים. כדי להמחיש זאת, מערכים של nanofibers FN עם ממדים מישוריים של 50 x 20 מיקרומטר היו בדוגמת על coverslip PIPAAm המצופה (איור 2 א). עם השחרור, הסיבים התכווצו בגלל שהם היו מתחת לפני מתח טבוע כאשר בדוגמת על פני השטח PIPAAm (איו...

Watch this Scientific Journal Video about ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly at JoVE.com

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

שיטה להשיג nanofibers וננו המורכב מחלבונים מטריצת חוץ תאיים בודדים או מרובים מתוארת. שיטה זו משתמשת באינטראקציות חלבון פני השטח כדי ליצור חומרים המבוססים על חלבונים חופשיים עומדים עם הרכב מתכונן וארכיטקטורה לשימוש במגוון רחב של יישומי הנדסה וביוטכנולוגיה רקמות.

Nanofibers חלבון ECM ועצרת ביוזמת פני שטח באמצעות ננו תכנון הנדסי

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

ecm-protein-nanofibers-nanostructures-engineered-using-surface

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K Views.  Carnegie Mellon University.  שיטה להשיג nanofibers וננו המורכב מחלבונים מטריצת חוץ תאיים בודדים או מרובים מתוארת. שיטה זו משתמשת באינטראקציות חלבון פני השטח כדי ליצור חומרים המבוססים על חלבונים חופשיים עומדים עם הרכב מתכונן וארכיטקטורה לשימוש במגוון רחב של יישומי הנדסה וביוטכנולוג?...

Video: ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

ויזואליזציה של דנ&quot;א רקומביננטי ו קומפלקסים חלבונים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological research. Perhaps the most widely used physical force to achieve noninvasive manipulation of small particles has been dielectrophoresis(DEP).1 However, DEP on its own lacks the versatility and precision that are desired when manipulating cells since it is traditionally done with stationary electrodes. Optical tweezers, which utilize a three dimensional electromagnetic field gradient to exert forces on small particles, achieve this desired versatility and precision.2 However, a major drawback of this approach is the high radiation intensity required to achieve the necessary force to trap a particle which can damage biological samples.3 A solution that allows trapping and sorting with lower optical intensities are optoelectronic tweezers (OET) but OET's have limitations with fine manipulation of small particles; being DEP-based technology also puts constraint on the property of the solution.4,5
This video article will describe two methods that decrease the intensity of the radiation needed for optical manipulation of living cells and also describe a method for orientation control. The first method is plasmonic tweezers which use a random gold nanoparticle (AuNP) array as a substrate for the sample as shown in Figure 1. The AuNP array converts the incident photons into localized surface plasmons (LSP) which consist of resonant dipole moments that radiate and generate a patterned radiation field with a large gradient in the cell solution. Initial work on surface plasmon enhanced trapping by Righini et al and our own modeling have shown the fields generated by the plasmonic substrate reduce the initial intensity required by enhancing the gradient field that traps the particle.6,7,8 The plasmonic approach allows for fine orientation control of ellipsoidal particles and cells with low optical intensities because of more efficient optical energy conversion into mechanical energy and a dipole-dependent radiation field. These fields are shown in figure 2 and the low trapping intensities are detailed in figures 4 and 5. The main problems with plasmonic tweezers are that the LSP's generate a considerable amount of heat and the trapping is only two dimensional. This heat generates convective flows and thermophoresis which can be powerful enough to expel submicron particles from the trap.9,10 The second approach that we will describe is utilizing periodic dielectric nanostructures to scatter incident light very efficiently into diffraction modes, as shown in figure 6.11 Ideally, one would make this structure out of a dielectric material to avoid the same heating problems experienced with the plasmonic tweezers but in our approach an aluminum-coated diffraction grating is used as a one-dimensional periodic dielectric nanostructure. Although it is not a semiconductor, it did not experience significant heating and effectively trapped small particles with low trapping intensities, as shown in figure 7. Alignment of particles with the grating substrate conceptually validates the proposition that a 2-D photonic crystal could allow precise rotation of non-spherical micron sized particles.10 The efficiencies of these optical traps are increased due to the enhanced fields produced by the nanostructures described in this paper.

Plasmonic tweezers and photonic crystal nanostructures are shown to produce useful enhancements in the efficiency and orientation control of optically trapping micro- and nano-particles.

ניצול של ננו גבישים פוטוניים Plasmonic ו מניפולציה מיקרו ו Nanoparticle משופרת

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

סינתזה, הרכבה, אפיון monolayer מוגן סרטים Nanoparticle זהב עבור אלקטרוכימיה monolayer חלבון

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

דש שריר כלי דם מהונדס

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

Scaling של שתלי כלי דם שהונדס בשיטות מדריכי 3D מודפס ואת שיטת נחת הטבעת

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial bypass. Characterization of the growth dynamics and remodeling process of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered blood vessels (TEBVs) with pulsatile stimulation is crucial for vascular tissue engineering. Optical imaging techniques stand out as powerful tools for monitoring vascularization of engineered tissue enabling high-resolution imaging in real-time culture. This paper demonstrates a nondestructive and fast real-time imaging strategy to monitor the growth and remodeling of TEBVs in long-term culture by using optical coherence tomography (OCT). Geometric morphology is evaluated, including vascular remodeling process, wall thickness, and comparison of TEBV thickness in different culture time points and presence of pulsatile stimulation. Finally, OCT provides practical possibilities for real-time observation of the degradation of polymer in the reconstructing tissues under pulsatile stimulation or not and in each vessel segment, by compared with the assessment of polymer degradation using scanning electron microscopic(SEM) and polarized microscope.

A step by step protocol for nondestructive and long-period monitoring the process of vascular remodeling and scaffold degradation in real-time culture of biodegradable polymeric scaffold-based tissue-engineered blood vessels with pulsatile stimulation using optical coherence tomography is described here.

ניטור לא הורסות של פיתוח מתכלה מבוססי לגרדום רקמות מהונדסים כלי דם באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

רקמת הנדסה לשיקום שחזור הוושט בחולדות

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

הרכבה עצמית של חומצות פפטידיות פפטיד שעברו שינוי גמא לתוך ננו-מבנים מורכבים בתערובות ממס אורגניות

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that cut outside of their recognition sites and create a short overhang. This modular cloning (MoClo) system uses a hierarchical workflow in which different DNA parts, such as promoters, coding sequences (CDS), and terminators, are first cloned into an entry vector. Multiple entry vectors then assemble into transcription units. Several transcription units then connect into a multi-gene plasmid. The Golden Gate cloning strategy is of tremendous advantage because it allows scar-less, directional, and modular assembly in a one-pot reaction. The hierarchical workflow typically enables the facile cloning of a large variety of multi-gene constructs with no need for sequencing beyond entry vectors. The use of fluorescent protein dropouts enables easy visual screening. This work provides a detailed, step-by-step protocol for assembling multi-gene plasmids using the yeast modular cloning (MoClo) kit. We show optimal and suboptimal results of multi-gene plasmid assembly and provide a guide for screening for colonies. This cloning strategy is highly applicable for yeast metabolic engineering and other situations in which multi-gene plasmid cloning is required.

The goal of this protocol is to provide a detailed, step-by-step guide for assembling multi-gene constructs using the modular cloning system based on Golden Gate cloning. It also gives recommendations on critical steps to ensure optimal assembly based on our experiences.

הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...