Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH / NCI Grants Número 1R01CA158372-01 (para Qi) e New Drug Estado Chave Projeto Grant Número 009ZX09102-205 (para Qi). Escrevendo assistência foi prestada pelo Dr. Judy Racadio, e foi financiado pela Universidade de Cincinnati Departamento de Hematologia e Oncologia. Vontz Núcleo de Imagem Lab (VCIL) na Faculdade de Medicina da Universidade de Cincinnati.

Declaração de ética do uso de animais. Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use, da Universidade de Cincinnati (Número IACUC Protocolo: 11-05-05-02) e Fundação do Cincinnati Children Research Hospital (Bem-Estar Animal Número Assurance A3108-01). Todos os experimentos envolvendo ratos seguiu as orientações de cuidados de animais da Universidade de Cincinnati e Fundação de Pesquisa do Hospital Infantil de Cincinnati. 1. Prepare Modelos Animais Nota: Três diferentes modelos animais descritos abaixo foram usados ​​nos nossos estudos anteriores: <ol><li> Ortotópico de tumor no cérebro do rato: Use ratinhos nu / nu atimicos fêmea que foram injectados por via intracraniana com células U87-ΔEGFR-Luc humanos. Estes ratos desenvolver um tumor agressivo, mostrando características típicas de glioblastoma humano. </li><li> Modelos de cérebro de rato tumor geneticamente modificados 13: Raça Mut3 (GFAP-Cre; Nf1loxP / +; Trp53-/ +) camundongos machos com Trp53loxP/loxP; Fêmeas PtenloxP / loxP para gerar camundongos Mut6 (GFAP-Cre; Nf1loxP / +; Trp53-/loxP; PtenloxP / +). Manter camundongos Mut3 em B6CBAF1 / J tensão por meio de cruzamento camundongos machos Mut3 com camundongos B6CBAF1 fêmea / J. Genótipo os ratos entre P9 e P12 e confirmar os genótipos após a colheita seus tecidos. </li><li> Artrite K / BxN: ratos Use C57Bl/6J que foram administrados por via intraperitoneal com 150 mL soros de camundongos F1 KRN x NOD. Estes ratinhos desenvolvem artrite de 24 a 48 horas após a injecção de soro. Imagiologia de ratinhos artríticos é realizada no dia 7 após a administração de soro, um ponto de tempo em que os ratos apresentam artrite macroscópica evidente. Ratos devem ser avaliados com base nos critérios definidos na próxima etapa. <ol><li> Avaliação de ratinhos para a artrite macroscópica utilizando um sistema de pontuação do índice de artrite macroscópica como se segue: 0 = nenhuma artrite detectável, 1 = inchaço e / ou vermelhidão da pata ou de um dígito, 2 = duas articulações envolvidas, 3 = três articulações envolvived, e 4 = artrite grave de toda a pata e dígito. O sistema de pontuação artrítica é usado para determinar o número de articulações afectadas e a gravidade da artrite nas patas do rato. Até mesmo os ratos com a maior pontuação possível artrite raramente mostram sinais de imobilidade. No entanto, a artrite é 3x/semana monitorado e camundongos com dor excessiva (como imobilidade severa de patas inchadas que inibe consumo de alimentos e água) são sacrificados. </li><li> Nota: Os fluidos injectados IV na veia da cauda do rato foram mantidas a esterilidade durante todo o experimento. ,, Seringas descartáveis ​​estéreis limpas e frascos são utilizados para a preparação e administração da solução de estudo. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de fluorescência marcado SAPC-DOPS nanovesículas <ol><li> SAPC produção de proteína: proteína recombinante SAPC com sequência exata SAPC humano foi produzido em E. células de E. coli, como descrito anteriormente com modificações 4.SAPC foi precipitado com etanol, seguido por purificação cromatografia líquida de alto desempenho. Após liofilização, SAPC seco foi usado e a sua concentração foi determinada pelo seu peso. </li><li> Misturar a proteína SAPC como anteriormente descrito 7,10,11. Mistura DOPS (0,18 mg) e CVM (0,03 mg) em um tubo de vidro e usar gás de azoto para evaporar solventes lipídicos. </li><li> Adicionar SAPC proteína em pó (0,32 mg) à mistura, a suspensão da mistura seca, em 1 ml de tampão PBS e banho de sonicação durante cerca de 15 minutos, como anteriormente descrito 7,10,11. Em seguida, passar a suspensão através de uma coluna de Sephadex G25 (PD-10) para remover o corante CVM livre. Excitação e máximos de emissões do produto final, ou seja, nanovesículas SAPC-DOPS-CVM, são 653 nm e 677 nm, respectivamente. </li></ol> 3. Imagem <ol><li> Use tumor cerebral e modelos de artrite de ratinho (descrito acima no Passo 1) para testar o sistema de Maroi. Anestesiar ratos para efectuar com 2% de isoflurano. 1-2% de isoflurano é maintainada por a duração do procedimento de imagiologia. O ar quente é continuamente e suavemente entregue para a câmara de imagiologia para a duração das imagens. Uma pequena gota de lágrimas artificiais estéril pomada é aplicada a cada olho do rato, de modo a cobrir e lubrificar o olho. Coloque ratinhos no sistema MARS posicionando os ratos numa posição supina com a sua coluna, inicialmente dirigido para a câmara (Figura 1). Calibre o filme apoio ° MARS 380 e posicione o mouse usando o software de rotação no separador protocolo Bruker MI. Obtenção de imagens da linha de base de ratinhos antes da administração SAPC-DOPS-CVM da maneira descrita abaixo. </li><li> Injetar 200 mL de SAPC-DOPS-CVM por via intravenosa na veia da cauda do rato. Administrar com ratinhos de controlo e ratos portadores de tumores cerebrais ou artríticas. </li><li> Camundongos Imagem 24 hr pós injeção e novamente em 7-9 dias após a injeção, tomando de fluorescência (25 seg tempo de exposição) e de raios-X (10 seg tempo de exposição) imagos em 10 ° incrementos ao longo de um curso de 380 °, criando uma ligeira sobreposição para garantir que não haja lacunas no conjunto de dados de rotação. Usando o software Bruker MI, sobrepor fluorescente para imagens de raios-X para a localização anatômica. </li></ol> 4. Image Analysis <ol><li> Desenhar um ROI rectangular abrangendo a largura do campo de visão (FOV) do local da doença (tumor e artrite). O ROI deve ser grande o suficiente para manter a função da doença dentro do FOV que o animal se move ao longo da rotação de 380 °. Para os ratos com tumor cerebral (modelos ortotópicos e transgênicas), use o mesmo ROI retangular em cada modelo de tumor e suas três (3) camundongos respectivo controle para todos os momentos (basal, 24 hr, e 9 dias). O posicionamento do ROI retangular para cada rato é preservada sobre todos os pontos temporais, utilizando marcos anatômicos em correspondentes imagens de raios-X de cada animal. O marco (s) anatômica identificada no modelo de tumor também deve ser usado para place ROIs retangulares idênticas em seus respectivos controles de cada modelo. Marcos anatômicos identificados nas imagens de raios-X que permitem a colocação de ROI consistente incluem a base do crânio e da face posterior do arco zigomático. Eles são visualizados na direita e à esquerda lateral do crânio na imagem póstero-anterior (PA). </li><li> Depois de fundo automática subtração, determinar a intensidade de fluorescência média para cada imagem. Converta as imagens de fluorescência para fótons / s / mm 2, utilizando software de imagem Bruker MI. Plotar os valores de fluorescência em função dos ângulos de imagem, e aplicar como erro impede o desvio-padrão dos valores médios de fluorescência obtidas de camundongos de controle usando Excel ou outro software gráfico. </li></ol>

<ol>
	<li>Pizzonia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodality+animal+rotation+imaging+system+(Mars)+for+in+vivo+detection+of+intraperitoneal+tumors.">Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors.</a> Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).</li><li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+depth+of+cellular+imaging+in+the+intact+lung+using+far-red+and+near-infrared+fluorescent+probes.">Increased depth of cellular imaging in the intact lung using far-red and near-infrared fluorescent probes.</a> Int J Biomed Imaging. , (2006).</li><li>Gertner-Dardenne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells.">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol Invest. 36, 665-685 (2007).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+saposins+expressed+in+Escherichia+coli.+Evidence+for+binding+and+activation+properties+of+saposins+C+with+acid+beta-glucosidase.">Functional human saposins expressed in Escherichia coli. Evidence for binding and activation properties of saposins C with acid beta-glucosidase.</a> J Biol Chem. 269, 16746-16753 (1994).</li><li>Wang, Y., Grabowski, G. A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+vesicle+fusion+induced+by+saposin.">Phospholipid vesicle fusion induced by saposin.</a> C. Arch Biochem Biophys. 415, 43-53 (2003).</li><li>Qi, X., Chu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusogenic+domain+and+lysines+in+saposin.">Fusogenic domain and lysines in saposin.</a> C. Arch Biochem Biophys. 424, 210-218 (2004).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-selective+targeting+and+cytotoxicity+by+liposomal-coupled+lysosomal+saposin+C+protein.">Cancer-selective targeting and cytotoxicity by liposomal-coupled lysosomal saposin C protein.</a> Clin Cancer Res. 15, 5840-5851 (2009).</li><li>Kaimal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saposin+C+coupled+lipid+nanovesicles+enable+cancer-selective+optical+and+magnetic+resonance+imaging.">Saposin C coupled lipid nanovesicles enable cancer-selective optical and magnetic resonance imaging.</a> Mol Imaging Biol. 13, 886-897 (2011).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4+can+recognize+SapC-DOPS+to+stimulate+macrophages+to+express+several+cytokines.">Toll-like receptor 4 can recognize SapC-DOPS to stimulate macrophages to express several cytokines.</a> Inflamm Res. 60, 153-161 (2011).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saposin+C+coupled+lipid+nanovesicles+specifically+target+arthritic+mouse+joints+for+optical+imaging+of+disease+severity.">Saposin C coupled lipid nanovesicles specifically target arthritic mouse joints for optical imaging of disease severity.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Abu-Baker, S., Chu, Z., Stevens, A. M., Li, J., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+and+selectivity+in+skin+cancer+by+SapC-DOPS+nanovesicles.">Cytotoxicity and selectivity in skin cancer by SapC-DOPS nanovesicles.</a> Journal of Cancer Therapy. 3, 321-326 (2012).</li><li>Wojton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+SapC-DOPS+has+antiangiogenic+and+antitumor+effects+against+glioblastoma.">Systemic delivery of SapC-DOPS has antiangiogenic and antitumor effects against glioblastoma.</a> Mol Ther. 21, 1517-1525 (2013).</li><li>Kwon, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+haploinsufficiency+accelerates+formation+of+high-grade+astrocytomas.">Pten haploinsufficiency accelerates formation of high-grade astrocytomas.</a> Cancer Res. 68, 3286-3294 (2008).</li></ol>

Não há nada a divulgar.

A determinação exata da localização e magnitude de tumores sólidos e focos inflamatórios em doenças reumáticas é fundamental para implementar o tratamento adequado e acompanhamento da progressão da doença ou remissão. Enquanto valiosas, as estratégias atuais de imagem (raios-X; ressonância magnética, ultrassom; tomografia computadorizada de raios-X) fornecer avaliações incompletas do estado da doença. Por exemplo, lesões articulares artrite é comumente avaliada por raios-X, que fornece informações sobre a estrutura óssea, mas não sobre a inflamação dos tecidos moles e destruição, característica dos estágios iniciais da doença. O método aqui apresentado Maroi combina as vantagens de ambos os raios-X e exames de imagem de tecidos moles sofisticadas (por exemplo, ressonância magnética ou ultra-som) em uma plataforma integrada, não-invasivo e mais simples que também permite um mapeamento completo 3D e reconstrução do tecido doente ou órgão pequenos animais, como ratos. Este método tira vantagem da afinidade selectiva of SAPC-DOPS nanovesículas de resíduos fosfatidilserina expostas, que são abundantes nas membranas de câncer e células inflamatórias. O determinante desta ligação é SAPC, uma proteína lisossómica fusogénico com uma forte afinidade para fosfolípidos aniónicos tais como fosfatidilserina 7,10,11. Quando conjugado com uma sonda fluorescente (CVM), sistemicamente injetado SAPC-DOPS pode ser atribuída a tumor e locais artríticas por imagem de fluorescência. As limitações deste método estão relacionadas com a sua sensibilidade, que atualmente restringe o seu uso a imagem de pequenos animais, como ratos. Como com outros métodos de imagem, o sinal fluorescente óptima para relação de ruído está restringida pelo tamanho do tumor ou a extensão da artrite, e pode ser comprometida quando imagiologia de tecidos ou órgãos com elevado efeito de fundo (autofluorescência), tais como as orelhas (imagiologia cerebral), intestinos / fezes (imagiologia abdominal) e patas (imagem dos membros posteriores). A este respeito, verificou-se que um corante vermelho distante como CVM próvides melhor separação resolução espectral e no vivo configuração em que as outras sondas fluorescentes na faixa visível. Outras armadilhas incluem o potencial de movimentação do animal durante o exame, tanto enquanto anestesiado e post mortem (rigor mortis). Posicionamento dos membros posteriores, particularmente, é muitas vezes difícil de estabilizar para evitar o movimento durante a rotação. Em seu estado atual, a técnica também é demorado, com tempos de varredura, enquanto 60 min necessário para completar uma rotação completa e adquirir imagens de alta qualidade. O método Maroi apresenta um número de vantagens sobre os outros métodos de imagem. A capacidade de um tecido doente de imagem a partir de 38 (ou mais) diferentes ângulos permite a visualização de fluorescência que pode ser impedida quando se avalia que a partir de um único plano; esta é útil em estudos com animais, porque pode ajudar a minimizar o número de falsos negativos que resultam de imagiologia em ângulos apropriados. Por Sobrecargade raios-X ying e imagens de fluorescência, uma localização anatómica precisa do local doente pode ser determinada. Finalmente, a possibilidade de ao vivo (in vivo) de imagem permite estudos longitudinais para ser executada.

Imagem animal inteiro tornou-se uma ferramenta poderosa no estudo da fisiopatologia animal. Entre os sistemas de imagem atuais, o MS FX PRO permite aos pesquisadores com precisão visualize fluorescente etiquetado (ou luminescente) compostos e / ou tecidos em ratos vivos, e, simultaneamente, obter imagens de raios-X. Com o sistema de rotação de animais recentemente introduzido várias modal (MARS) uma rotação completa e automatizada do mouse é alcançado, a fim de capturar tanto fluorescente / luminescentes e imagens de raios-X em ângulos específicos 1. A aquisição de imagens pode ser programado de tal forma que série de imagens sequenciais podem ser capturados em, ângulos incrementais específicos tão pequenas como 1 °. Isto permite que se identificar a orientação óptima do animal, isto é. aquele em que a distância entre o sinal fluorescente / luminescente gerado internamente e dispositivo de detecção do sistema é o mais curto. Este, por sua vez, facilita o reposicionamento preciso do animal para imagiologia subsequente sissions durante estudos longitudinais. Neste relatório, nós descrevemos a implementação de um sistema multi-ângulo de rotação de imagem óptica (Maroi) para in vivo a quantificação da intensidade marcador fluorescente. A análise da curva de sinal Maroi pode ser utilizado em estudos longitudinais para correlação directa de distribuição de sinal de fluorescência para mapear precisamente sítios doentes ou processos biológicos de interesse. Este sistema foi utilizado para monitorizar a absorção de marcação fluorescente nanovesículas SAPC-DOPS por tumores ortotópicos e espontâneos, bem como por focos de artrite, em ratos vivos; forneceu conjuntos de dados multi-espectrais e multimodais derivados de cobertura de rotação completa dos animais. Entre as numerosas sondas fluorescentes atualmente disponíveis para imagem in vivo, aqueles que emitem nas regiões do infravermelho próximo e vermelho-extremo do espectro conferir o menor interferência com a pele e os tecidos, e fornecer os mais altos res de penetração e de imagemlução. Usamos CellVue Maroon (CVM) 2,3, um vinculador célula fluorescente vermelha distante (Ex 647/Em 667), para rotular SAPC-DOPS (SAPC-DOPS-CVM) 4-12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1246">
	<colgroup>
		<col /> 
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td style="width:423px;">Gibco (Grand Island, NY)</td>
			<td style="width:307px;">11965</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:423px;">Gibco (Grand Island, NY)</td>
			<td style="width:307px;">16000077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:423px;">Hyclone (Logan, Utah)</td>
			<td style="width:307px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Dioleoylphosphatidylserine</td>
			<td style="width:423px;">Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)</td>
			<td style="width:307px;">840035C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CellVue Maroon</td>
			<td style="width:423px;">Molecular Targeting Technologies, Inc. (Exton, PA)</td>
			<td style="width:307px;">C-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sephadex G25 column PD-10</td>
			<td style="width:423px;">Amersham Pharmacia Biotech, (Piscataway, NJ)</td>
			<td style="width:307px;">17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:351px;">New Standard Stereotaxic for Rats and Mice</td>
			<td style="width:423px;">Harvard Apparatus (Holliston, MA)</td>
			<td style="width:307px;">726335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Bransonic Ultrasonic Cleaners Model 1510</td>
			<td style="width:423px;">Branson Ultrasonics (Danbury,CT)</td>
			<td style="width:307px;">CPN-952-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Multi-spectral FX system</td>
			<td>Bruker Corporation (Billerica, MA)</td>
			<td style="width:307px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-angle Rotational Optical Imaging Device</td>
			<td>Bruker Corporation (Billerica, MA)</td>
			<td style="width:307px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optical imaging of brain tumors and arthritis using fluorescent sapc-dops nanovesicles

Descreve-se um sistema (Maroi) para o monitoramento in vivo de processos fisiopatológicos marcadas com um marcador fluorescente multi-ângulo de rotação de imagem óptica. Modelos do rato (tumores e artrite cérebro) foram utilizados para avaliar a utilidade deste método. Saposina C (SAPC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesículas marcados com CellVue Maroon (CVM) fluorophore foram administrados por via intravenosa. Os animais foram, em seguida, colocado no suporte de rotação (MARS) do sistema de imagem in vivo. As imagens foram adquiridas em 10 ° etapas mais de 380 °. A região rectangular de interesse (ROI), foi colocada a toda a largura da imagem completa no local da doença modelo. Dentro do ROI, e para cada imagem, a intensidade de fluorescência média foi calculada após subtração de fundo. Nos modelos de ratos estudados, os nanovesículas marcados foram retomadas em ambos os tumores cerebrais ortotópico e transgênicas, e nos sites artríticas (dedos dos pés e tornozelos). Análise da curva de multi ângulo image ROIs determinado ângulo com o sinal mais elevado. Assim, o ângulo ideal para imagiologia de cada local da doença foi caracterizada. O método Maroi aplicada a imagem de compostos fluorescentes é uma ferramenta não invasiva, econômico, e preciso para in vivo análise quantitativa dos estados de doença nos modelos descritos no mouse.

Nós demonstramos aqui que nanovesículas SAPC-DOPS marcadas com um corante vermelho-distante (CVM) acumular especificamente em tumores do cérebro do rato ortotópico e espontâneos, bem como nas articulações artríticas de ratinhos K / bxn. Imagens de fluorescência / raios-X em série adquiridos a partir de uma ROI colocado sobre cada local da doença durante rotações completas dos ratos foram submetidos a análise da curva de Maroi, que revelou o ângulo de imagem ideal, com a maior intensidade de fluorescência. O objectivo principal para o uso do sistema MARS é para determinar o ângulo óptimo de fluorescência de modo a que as medições mais precisas podem ser obtidas. Os resultados representativos de três experimentos com ratos com tumores cerebrais ou artrite são mostrados. Utilizando SAPC-DOPS-CVM e o sistema MARS (Figura 1), a melhor imagem possível ângulo de observação do tumor ou devido a inflamação da artrite foi determinada. As imagens de fluorescência, seguindo-se uma aquisição de raios-X, foi adquirida a cada 10 °durante uma rotação de 380 ° do mouse. Imagens de fluorescência foram sobrepostos nas imagens de raios-X correspondentes para visualização da imagem e geração de filme de rotação. Os resultados do modelo de tumor cerebral ortotópica são demonstradas na Figura 2. A imagem de fluorescência de um rato portador de tumor ortotópico representante (Ortho1) é mostrado na Figura 2A. O ângulo de imagem ideal para este animal é de 10 °, a posição em que a intensidade de fluorescência de fotões é a maior (Figura 2B). As medidas foram feitas antes da injeção com SAPC-DOPS-CVM (baseline) e 24 horas após a injeção. Os ratos de controlo (tumor livre) receberam um tratamento similar. A Figura 3 mostra dados comparáveis ​​a partir do modelo de ratinho de tumor cerebral por engenharia genética. As imagens de fluorescência e as medições de fotões foram tomadas antes da injecção com SAPC-DOPS-CVM (linha de base) e 24 h (Figuras 3A e &lt;forte&gt; 3B) e 9 dias (Figura 3C) após a injecção. Estes gráficos mostram que o ângulo de imagem ideal no animal portador de tumor (Tumor Mut49) é de 20 ° 24 hr pós injeção, mas muda para 10 ° 9 dias pós-injeção. Isto sugere que a alteração de sinal de fluorescência correlacionada com alterações morfológicas, provavelmente refletindo o crescimento do tumor. Como mostrado na Tabela 1, o método Maroi demonstra claramente que o sinal fluorescente diminui por projecções em aumento da rotação fora do ângulo de imagem óptima. Nos tumores do cérebro, uma diminuição média de 7% no sinal de fluorescência foi obtida se a orientação física do animal foi 10 ± compensados ​​a partir do ângulo de imagem óptima °. Uma redução média de 21% no sinal fluorescente foi medida em ± 20 °. Assim, relativamente pequenos deslocamentos do ângulo ideal pode resultar em atenuação do sinal significativo. Utilizando a técnica de Maroi para o posicionamento da imagem permitirá que investigators para produzir dados mais consistentes e confiáveis. O método Maroi foi finalmente usada para avaliar o direccionamento das articulações artríticas de SAPC-DOPS-CVM 24 horas após a injecção de SAPC-DOPS-CVM. Este animal marcou 3 com três articulações artríticas. Imagens de fluorescência do dedo do pé e tornozelo do rato com artrite são apresentados nas Figuras 4A e 4B. Medições de fótons correspondentes a 10 ° intervalos de rotação são representados graficamente nas Figuras 4C e 4D. Os ângulos de imagem ideais encontrados para o dedo do pé e tornozelo são 140 ° e 120 °, respectivamente. Em resumo, a combinação do sistema Maroi com fluorescentes nanovesículas SAPC-DOPS representa uma estratégia não invasiva, precisa e altamente sensível para imagens em tempo real, que permite estudos quantitativos de tumor e progressão da artrite em animais de pequeno porte. A possibilidade de aquisição de um conjunto de dados de 360 ​​° de imagem multimodal improv consideravelmenteanálise e interpretação dos dados es, em comparação com o que é alcançável através de técnicas individuais de imagem de ângulo. <img alt="Tabela 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187table1.jpg" width="600px" /> Tabela 1. Ângulos de imagem ideal para cada modelo do rato. As diferenças entre o ângulo de fluorescência fóton máxima (FLR ângulo ideal) eo ângulo anatômica normal (raio-X) podem ser vistos. Quando estes dois ângulos tornado cada vez mais diferentes, o sinal medido muda significativamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1.jpg" width="600px"/&gt; Figura 1. Multi-ângulo de rotação do dispositivo de imagem óptica (Maroi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2.jpg" width="600px" /> Fluorescência sinal vs ângulo Figura 2. Imagem em um modelo de camundongo ortotópico tumor cerebral. (A). Imagem do sinal de pico de fluorescência, com o ângulo de imagem ideal de 10 °. A caixa azul mostra o ROI para quantificar os fótons emitidos. (B). Gráfico do ângulo de imagem contra emissão de fóton. O rato-bearing tumor ortotópico representante (Ortho1) é representada graficamente contra valores de fluorescência média entre ROIs idêntico em três ratos não tumorais. As medidas foram realizadas no início do estudo (antes da injeção) e pós 24 horas injection. As barras de erro representam o desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3.jpg" width="600px" /> Sinal de fluorescência Figura 3. Vs ângulo de imagem em um tumor cerebral espontânea de um modelo de camundongo geneticamente modificado. (A). Imagem do sinal fluorescente pico de ROI 1 (top box azul) no ângulo de imagem ideal de 20 °. (B) e (C). Gráficos do ângulo de imagem contra emissão de fóton de ROI 1. Valores de um representante do rato portador de tumor cerebral espontânea, Tumor-Mut 49, são representados graficamente em relação aos valores médios de três ratos não tumorais. As medidas foram realizadas no início do estudo (antes da injeção) e 24 horas (B) e 9 dias (C) após a injeção. Erro b<html> ars representam Desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4.jpg" width="600px" /> Fluorescência sinal vs ângulo Figura 4. Imagem em um rato com artrite do dedo do pé e tornozelo. (A) e (B). Imagens que mostram o sinal de pico fluorescente para os dedos dos pés (a) e tornozelo (B), dentro dos ROIs mostrados na caixa vermelha. (C). Gráfico do ângulo versus média emissão de fóton para o dedo do pé. Emissão de fóton Peak pode ser visto em um ângulo de 140 ° (D) Gráfico de ângulo versus média emissão de fóton para o tornozelo..; intensidade máxima ocorre com um ângulo de 120 °.target = &quot;_blank&quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada.

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In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

Descreve-se um sistema (Maroi) para in vivo quantificação de um marcador fluorescente entregue por saposina C (SAPC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesículas multi-ângulo de rotação de imagem óptica. Utilizando modelos de ratinho de cancro e artrite, é mostrado como a análise da curva de sinal Maroi pode ser utilizado para o mapeamento preciso e caracterização biológica de processos de doença.

In Vivo Imagem Óptico de tumores cerebrais e artrite Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

11.2K visualizações.  University of Cincinnati College of Medicine.  Descreve-se um sistema (Maroi) para in vivo quantificação de um marcador fluorescente entregue por saposina C (SAPC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesículas multi-ângulo de rotação de imagem óptica. Utilizando modelos de ratinho de cancro e artrite, é mostrado como a análise da curva de sinal Maroi pode ser utilizado para o mapeamento preciso e caracterização biológica de processos de doença. 

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Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&amp;#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

Medição precisa e simples do pró-inflamatórias IL-1β citocinas usando um ensaio Estimulação Sangue Total

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Medicina

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Avaliação de Captação de nanopartículas em tumores em tempo real usando imagens intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Probing the Brain in Autism Using fMRI and Diffusion Tensor Imaging

Newly emerging theories suggest that the brain does not function as a cohesive unit in autism, and this discordance is reflected in the behavioral symptoms displayed by individuals with autism. While structural neuroimaging findings have provided some insights into brain abnormalities in autism, the consistency of such findings is questionable. Functional neuroimaging, on the other hand, has been more fruitful in this regard because autism is a disorder of dynamic processing and allows examination of communication between cortical networks, which appears to be where the underlying problem occurs in autism. Functional connectivity is defined as the temporal correlation of spatially separate neurological events1. Findings from a number of recent fMRI studies have supported the idea that there is weaker coordination between different parts of the brain that should be working together to accomplish complex social or language problems2,3,4,5,6. One of the mysteries of autism is the coexistence of deficits in several domains along with relatively intact, sometimes enhanced, abilities. Such complex manifestation of autism calls for a global and comprehensive examination of the disorder at the neural level. A compelling recent account of the brain functioning in autism, the cortical underconnectivity theory,2,7 provides an integrating framework for the neurobiological bases of autism. The cortical underconnectivity theory of autism suggests that any language, social, or psychological function that is dependent on the integration of multiple brain regions is susceptible to disruption as the processing demand increases. In autism, the underfunctioning of integrative circuitry in the brain may cause widespread underconnectivity. In other words, people with autism may interpret information in a piecemeal fashion at the expense of the whole. Since cortical underconnectivity among brain regions, especially the frontal cortex and more posterior areas 3,6, has now been relatively well established, we can begin to further understand brain connectivity as a critical component of autism symptomatology.
A logical next step in this direction is to examine the anatomical connections that may mediate the functional connections mentioned above. Diffusion Tensor Imaging (DTI) is a relatively novel neuroimaging technique that helps probe the diffusion of water in the brain to infer the integrity of white matter fibers. In this technique, water diffusion in the brain is examined in several directions using diffusion gradients. While functional connectivity provides information about the synchronization of brain activation across different brain areas during a task or during rest, DTI helps in understanding the underlying axonal organization which may facilitate the cross-talk among brain areas. This paper will describe these techniques as valuable tools in understanding the brain in autism and the challenges involved in this line of research.

Neuroimaging techniques, such as functional MRI and Diffusion Tensor Imaging have become increasingly useful in characterizing the cognitive and neural deficits in autism. An examination of brain connectivity in autism at a network level along with adaptations for scanning children with developmental disabilities is presented.

Sondando o cérebro no autismo utilizando fMRI e Difusão Tensor Imagem

Newly emerging theories suggest that the brain does not function as a cohesive unit in autism, and this discordance is reflected in the behavioral ...

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

Não-invasivo de medição óptica do metabolismo cerebral e Hemodinâmica em Lactentes

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

In vivo Macrophage Imaging Using MR Targeted Contrast Agent for Longitudinal Evaluation of Septic Arthritis

Macrophages are key-cells in the initiation, the development and the regulation of the inflammatory response to bacterial infection. Macrophages are intensively and increasingly recruited in septic joints from the early phases of infection and the infiltration is supposed to regress once efficient removal of the pathogens is obtained. The ability to identify in vivo macrophage activity in an infected joint can therefore provide two main applications: early detection of acute synovitis and monitoring of therapy.
In vivo noninvasive detection of macrophages can be performed with magnetic resonance imaging using iron nanoparticles such as ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO). After intravascular or intraarticular administration, USPIO are specifically phagocytized by activated macrophages, and, due to their magnetic properties, induce signal changes in tissues presenting macrophage infiltration. A quantitative evaluation of the infiltrate is feasible, as the area with signal loss (number of dark pixels) observed on gradient echo MR images after particles injection is correlated with the amount of iron within the tissue and therefore reflects the number of USPIO-loaded cells.
We present here a protocol to perform macrophage imaging using USPIO-enhanced MR imaging in an animal model of septic arthritis, allowing an initial and longitudinal in vivo noninvasive evaluation of macrophages infiltration and an assessment of therapy action.

In vivo Macrophage Imaging Using MR Targeted Contrast Agent for Longitudinal Evaluation of Septic Arthritis

We demonstrate how to perform macrophage MR imaging using ultrasmall superparamagnetic contrast agent (USPIO) in septic arthritis, allowing an initial and longitudinal in vivo non-invasive evaluation of macrophages infiltration and an assessment of therapy efficacy.

In vivo macrófagos Imagem Usando MR alvejado agente de contraste para avaliação longitudinal de artrite séptica

Macrophages are key-cells in the initiation, the development and the regulation of the inflammatory response to bacterial infection. Macrophages are ...

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &amp;#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

Combinado<em&gt; In vivo</em&gt; Optical e μCT imagem para monitorar infecções, inflamações, and Bone Anatomy em uma infecção Orthopaedic Implant em Ratos

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

Criando anatomicamente precisos e reprodutíveis intracraniana Xenoenxertos de tumores cerebrais humanos

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rosa Bengala Fototrombose por imageamento óptico confocal<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um Modelo de curso Veículo Individual

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depleção de células do rato de xenoenxertos de tumor humano Melhora Significativamente Análise Downstream de células alvo

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

Na Vivo Imagem de Cx3cr1gfp/gfp repórter ratos com a tomografia de coerência óptica espectral-domínio e digitalização Laser Oftalmoscopia

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...