Agradecemos drs. Alex Gelbard e Willem Overwijk para aconselhamento sobre a transferência de genes hidrodinâmico. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH (AI098099, SSW), o Centro MD Anderson para o cancro da Epigenética, o Centro MD Anderson de Inflamação e do Câncer (SSW), eo Fundo de Educação Bob Smith RE (HSL).

Aprovação Institucional deve ser obtida com antecedência para todas as manipulações experimentais aqui descritos envolvendo camundongos. Estes incluem o uso de ratos C57BL6 para o isolamento de células progenitoras de medula óssea, o IFNAR - / - murganhos como receptores para a transferência adoptiva de células progenitoras hematopoiéticas e à utilização de HGT para a sobre-expressão de citoquinas, in vivo. Habitação adequada e cuidados com os animais também deve ser fornecido pelo investigador ou instituição. Além disso, a aprovação institucional pode ser necessário para os plasmídeos utilizados na transferência de genes hidrodinâmico (isto aprovação de ADN recombinante). Os estudos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use a UT MD Anderson Cancer Center. 1. Transferência de Gene hidrodinâmica (HGT) Esta etapa deve ser realizada 2 dias antes da transferência adoptiva de LDC para induzir circulando Flt3L para expansão DC in vivo 5. Prepare pelo menos 5 destinatário ratinhos / grupo. <ol><li> Para alcançar eficiente HGT, os vasos sanguíneos do receptor IFNAR - / - murganhos (CD45.2 +) deve ser dilatada por expor os ratos a uma lâmpada de aquecimento durante 5-10 minutos. </li><li> Posicione o mouse em um dispositivo limitador e desinfectar a sua cauda com etanol 70%. </li><li> Injectar 5 ug de plasmídeo Flt3L, em 2 ml de PBS estéril, na veia da cauda usando uma agulha G 27. Para o grupo de controlo, injecta-se 5 ug de vector vazio (pORF) através da veia da cauda, ​​tal como indicado. </li><li> Monitorar os ratos para 15-30 min para garantir que não haja efeitos deletérios da injeção veia da cauda. Retornar ratos para instalação de alojamento para 2 dias. </li></ol> 2. Isolamento de hematopoéticas Progenitores de Rato Medula Óssea Esta etapa deve ser realizada 2 dias após HGT. Use CD45.1 congênica + ratinhos como fonte de células progenitoras da medula óssea para a transferência adoptiva para receptor IFNAR - /- animais (CD45.2 +). Neste protocolo, estirpes congénicas devem distinguir doador e DCs derivada do receptor, bem como para evitar a depleção imune-mediada, devido à incompatibilidade do MHC. Aproximadamente 10-20 ratos serão obrigados a fornecer um número suficiente de células progenitoras hematopoiéticas (10 5 células / rato destinatário) para os experimentos de transferência. <ol><li> Eutanásia 10 congênica CD45.1 + ratos por asfixia CO 2 e deslocamento cervical. </li><li> Coloque cada carcaça em uma bandeja de dissecação e esterilizar o abdômen e pernas com etanol 70%. </li><li> Faça uma incisão no meio do abdômen e cortar a pele do abdômen para cada perna, cortando a pele para baixo o comprimento da perna. </li><li> Remova cuidadosamente a pele de cada perna, e cortar e remover as pernas da carcaça ao nível da articulação do quadril usando tesouras afiadas. </li><li> Remova cuidadosamente os músculos do fêmur e da tíbia de cada perna usando uma lâmina afiada. </li><li> Removerambas as extremidades do fémur e da tíbia com um bisturi afiado e colocar ossos numa placa de cultura contendo meio RPMI completo (RPMI com 10% de soro inactivado por calor fetal bovino, 1% de penicilina / estreptomicina, piruvato de sódio 1 mM e 50 uM β-mercaptoetanol) . </li><li> Prepare uma seringa contendo 1 ml de RPMI completo, conectado a uma agulha G 27. </li><li> Insira a agulha de 27 G em uma extremidade do fêmur ou tíbia. Lave a medula óssea do fêmur ou tíbia injetando suavemente o RPMI completo dentro do osso. Certifique-se de que as células de medula óssea são removidos a partir do osso, o que pode ser conseguido por meios de detecção visual expelido que aparece turvo. </li><li> Repita a lavagem cada fêmur ea tíbia 3x para remover completamente as células da medula óssea. </li><li> Prepare uma suspensão única célula cuidado pipetando células para cima e para baixo 3-5x na placa de cultura. </li><li> Remover os detritos, passando as células de medula óssea por meio de um filtro de 40 | iM de células, colocando as células de exsudados para um novo culture prato. Interromper quaisquer aglomerados de células que aparecem no filtro através de pressão suave com a extremidade de um êmbolo de seringa estéril. </li><li> Lise das células vermelhas do sangue (RBC) presentes na suspensão total de células de medula óssea com tampão de lise comercial RBC acordo com as instruções do fabricante. Utilizar 2 ml de lise buffer/4-6 x 10 7 células (em geral, as células de um rato) e um tempo de incubação de 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lave as células da medula óssea por células granulação por centrifugação durante 4 minutos a 500 x g, aspiração suavemente o meio de cultura, ressuspensão em 10 ml de tampão de FACS (PBS 1x + 2 mM de EDTA e 1% de FBS), as células de revestimento por centrifugação e suavemente aspiração lavagem tampão. </li><li> Repetir a lavagem, tal como descrito no passo 2.13, para um total de duas lavagens. </li></ol> 3. Celular ativado por fluorescência (FACS) para isolar CDPs Este passo requer acesso a um separador de células MidiMACS e colunas MACS LD por um processo de selecção inicial negativo,, bem como uma máquina de FACS com, pelo menos, três lasers para purificar o subconjunto de células progenitoras multicolor após coloração com anticorpos conjugados com fluorescência. <ol><li> Após a segunda lavagem no passo 2.14, a contagem das células de medula óssea. Agregar as células por centrifugação, tal como descrito no passo 2.13 e ressuspender em tampão FACS para alcançar uma concentração final de 4 x 10 7 células por 30 ul de tampão de FACS. </li><li> Para preparar as células para FACS, as células de linhagem negativa são primeiro enriquecidas por uma técnica de selecção negativa que remove as células de linhagem positiva a partir da mistura de medula óssea utilizando cromatografia em coluna de esférulas magnéticas. Para o processo de selecção negativa, adicionar 1 ug de cada um dos seguintes anticorpos anti-ratinho de rato comercial (ABS) que reconhecem marcadores de linhagem hematopoiética: CD3, CD19, CD11c, CD11b, e Ter-119 Abs. Os Abs deve ser adicionado num volume de 2 mL / Ab à suspensão de células 30 mL de tampão de FACS. </li><li> Incubar a suspensão de células a 4 ° C durante 30min. Após a incubação, lavar as células duas vezes com 10 ml de tampão de FACS, tal como descrito no passo 2.13. </li><li> Ressuspender as células para conseguir uma concentração final de 4 x 10 7 cells/40 ul de tampão de FACS. Adicionar 20 ul de cabra anti-rato IgG microesferas magnéticas por cada 40 uL de suspensão de células. Misturar suavemente e incuba-se a 4 ° C durante 30 min. Lavar as células com 10 ml de tampão de FACS, tal como descrito no passo 2.13. </li><li> Ressuspender até 10 células de medula óssea de 8 em 500 mL de tampão de FACS. </li><li> Carregar uma coluna MACS LD para um separador de células MidiMACS acordo com as instruções do fabricante e prerinse a coluna com tampão de SCAF 2 ml. </li><li> Aplicar a suspensão de células da medula óssea para a coluna, carregando-se com 5 x 10 8 células em 2,5 ml de tampão de FACS. Certifique-se de um tubo de recolha (15 ml tubo cónico) é colocado na coluna. Lavar a coluna 3 vezes com 2 ml de tampão de FACS / lavagem, e recolher as células que passam através da coluna, que será enriquecida paracélulas da linhagem-negativos. Contar as células do material fluido (wash-through) da coluna. </li><li> Para efectuar a selecção positiva de subconjuntos progenitoras hematopoiéticas por FACS, as células são coradas com os seguintes Abs conjugado fluorescente: IL-7R (Pacific Blue), FLT3 (PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs, além de uma mistura de linhagem Abs marcador contra CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 e Ter119 (todos rotulados com PerCP Cy5.5). Use 0,5-1 ul de cada Ab num volume total de 100 ul. Incubar a suspensão de células a 4 ° C durante 20-30 min. </li><li> Lavar as células, tal como indicado no passo 2.13 e ressuspender em tampão FACS a uma concentração de 2-3 x 10 7 células / ml. Filtrar as células através de um tubo de 35 uM tampão filtro celular para remover aglomerados de células. Este último passo é crucial para evitar o entupimento da máquina FACS. </li><li> Coloque a suspensão de células em um tubo de FACS no palco FACS e classificar CDPs (LIN - c-kit lo CD115 + Flt3 +) nobase do perfil de marcador indicado. Recolher as células purificadas num tubo de 15 ml contendo 5 ml de meio RPMI completo. </li><li> Gravar o número absoluto de células classificadas no final da execução de FACS. Agregar as células por centrifugação, tal como indicado no passo 2.13 e ressuspender em PBS estéril para as experiências de transferência adoptivos. </li></ol> 4. A transferência adoptiva de CDPs Este passo é tipicamente realizado na instalação para animais, onde os ratinhos receptores são alojados. Dependendo da localização da máquina de FACS, pode envolver o transporte das populações de células progenitoras purificadas para a instalação dos animais antes da transferência adoptiva. As suspensões de células progenitoras devem ser mantidos estéreis e transportadas em gelo. <ol><li> Preparar suspensões de células por injecção, diluindo 10 5 LDC purificados, num volume total de 100 ul de PBS estéril. Colocar a suspensão de células em uma seringa ligada a uma agulha G 27. </li><li> Expor o receptor IFNAR - / - </sup&gt; ratinhos (CD45.2 +) a uma lâmpada de aquecimento durante 5-10 minutos para atingir a injecção eficiente através da veia da cauda. </li><li> Posicione o mouse em um dispositivo limitador e desinfectar a sua cauda com etanol 70%. </li><li> Injectar 10 5 FACS purificado LDC em 100 ul de PBS na veia da cauda usando uma agulha G 27. </li><li> Monitorar os ratos para 15-30 min para garantir que não haja efeitos deletérios da injeção veia da cauda. Retornar ratos para instalação de alojamento. </li></ol> 5. Isolamento de PP e Mensuração de pDC Valores <ol><li> No 7-10 dias após a transferência adotiva, eutanásia os ratos receptores. Abra cuidadosamente o mouse por dissecção e expor o intestino. </li><li> Remova todo o intestino e colocá-lo em papel toalha PBS-encharcado. Colete todos os PPs visíveis ao longo da parede do intestino delgado usando uma pinça fina e tesoura. C57BL6 e IFNAR - / - murganhos têm tipicamente 5-10 PP / rato, que são diferentes dos folículos linfóides isoladas encontradosao longo do intestino delgado 18. Note-se que as PPs são frequentemente estruturalmente distintas, mesmo dentro de um único rato, tão cuidadosamente garantir que todos os PPs são identificados e dissecados. </li><li> Coloque PPs em uma placa de Petri contendo PBS, e utilizar uma pinça para remover fezes. Repita este procedimento duas vezes para limpar PPs. </li><li> Digest PPs com 1 mg / ml de colagenase IV em 10 ml de solução salina equilibrada de 1x Hank (HBSS) em um frasco de 50 ml com agitação vigorosa durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Coloque o PP digerido no topo do compartimento de um 40 um filtro de células e células de força através de peneira com um êmbolo da seringa estéril. Recolha a suspensão de células PP num tubo cónico de 15 ml. </li><li> Granulado de células PP tensas por centrifugação a 500 xg durante 5 min e ressuspender em 6 ml de solução de Percoll a 37% (37% de Percoll no meio RPMI). Colocar suavemente 6 ml de uma solução de Percoll a 70% (70% de Percoll no meio RPMI) por baixo da suspensão de células, para formar um passo de gradiente de Percoll. </li><li> Células centrifugadas por 20 min at 800 xg, com a centrífuga romper. As células mononucleares irão migrar para a interface 37/70%. Após centrifugação, a população de células mononucleares deve ser recolhida por pipetagem cuidadosa na região da interface. Pellet células recolhidas por centrifugação e lava-se duas vezes em 50 ml de meio RPMI completo / lavagem. Uma grande volume é usado para assegurar a remoção completa de Percoll. </li><li> Mancha as células PP coletados com os seguintes anticorpos para detectar pDCs murino que derivam dos progenitores adotivamente transferidos (CD45.1 +) ou ratos destinatário (CD45.2 +): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (azul do Pacífico), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) e PDCA-1 (ITCF) Abs. Realizar a análise de citometria de fluxo de células PP, tal como indicado nos passos 3.9 e 3.10. Identificar pDCs por sua CD11c + CD11b - B220 +-H + Siglec PDCA-1 + fenótipo. Números absolutos pDC pode ser determinada pela seguinte equação:% de pDCs xnúmero de células tal PP = PP pDCs. </li></ol>

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

A técnica de transferência adoptiva descrita aqui avaliada a contribuição de LDC a população PP pDC em ratinhos receptores que são deficientes em PP pDCs (por exemplo, elemento de IFNAR - / - ratinhos). Em experimentos futuros, será importante para avaliar o potencial de outros subconjuntos progenitoras na geração pDCs PP, em especial, se pDCs PP derivam FLT3 + CLPs. Esta questão é importante, uma vez que ainda não está claro por que pDCs PP são excepcionalmente sensíveis a...

Aqui, nós demonstramos um protocolo para avaliar se progenitores de células dendríticas comuns (CDPs) são capazes de dar origem a células dendríticas plasmocitóide população (PDC) em placa de Peyer (PP). O objetivo geral deste método foi avaliar a regulação do desenvolvimento de pDCs na placa de Peyer (PP pDCs). A razão pela qual isto é importante é que pDCs PP diferem de pDCs encontrado em outros tecidos, incluindo a medula óssea, do sangue e do baço, e, por conseguinte, não está claro se pDCs PP e outras populações pDC são termos de desenvolvimento e / ou funcionalmente relacionados. Especificamente, pDCs são amplamente conhecido por ser o principal tipo I interferon (IFN) produtores dentro do sistema hematopoiético, respondendo ao receptor Toll-like 7 e 9 (TLR7 / 9) estimulação por IFN rápida secreção 1-3. No entanto, pDCs PP são deficientes na produção de IFN tipo I em resposta a estimulação agonista TLR 4,5. Além disso, PP pDCs também diferem de pDCs encontradas na medula óssea e no baço, emrequerendo sinais provenientes do receptor do interferão do tipo I (IFN) (IFNAR1) ou sinalização de IFN STAT1 molécula para o seu desenvolvimento e / ou a acumulação 5. Estes dados sugerem a possibilidade de que os mecanismos reguladores distintos controlar pDCs PP contra pDCs noutros órgãos (por exemplo, medula óssea, baço) 5. A lógica que levou ao desenvolvimento deste método foi baseada em avanços recentes na compreensão da biologia das células dendríticas (DC). A maioria, se não todos, os subconjuntos de DC derivar de progenitores hematopoiéticos que expressam a tirosina-quinase 3 de receptor tipo fms (FLT3), 6-10, no entanto, o desenvolvimento DC não se restringe ao mielóide clássico e vias linfóides. Por exemplo, FLT3 + progenitores mielóides comuns (CMPs, lin - IL-7R - Sca-1 - c-kit + CD34 + FcγR lo / -) dão origem a CDPs (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +), which diferenciar ainda mais em pDCs e DCs convencionais (CDCs) 9,10. Por outro lado, Flt3 + progenitores linfóides comuns (CLPs, Lin - IL-7R + Sca-1 lo c-kit lo) se desenvolvem principalmente em pDCs 11. Portanto, estudos anteriores indicam pDCs surgem pelo menos duas populações progenitoras hematopoiéticas distintas ao abrigo do regulamento de Flt3L, embora a análise típica tem sido restrita para a medula óssea, baço e / ou subconjuntos pDC sangue. Assim, a população de (s) progenitor que gera PP pDCs necessária investigação. Compreender as origens do PP pDCs vai lançar luz sobre se eles compartilham as vias de desenvolvimento comuns a outras populações PDC ou utilizar mecanismos distintos durante a sua geração no PP. A única vantagem da abordagem aqui descrita é a utilização de ratos que apresentam uma deficiência grave em PP pDCs como receptores para a transferência adoptiva de células progenitoras hematopoiéticas. Ratos com genesupressão tique no gene que codifica a IFNAR1 (IFNAR - / - murganhos) ou STAT1 (Stat1 - / -) revelou uma depleção marcante em PP pDCs 5. Portanto, estas linhagens proporcionar um ambiente no qual os pDCs PP são reduzidos, permitindo estudos de transferência adoptivos ser realizada na ausência de potentes regimes de ablação celular, tais como a irradiação letal. Teor adicional método apresentado é utilização de transferência gene hidrodinâmico (HGT) estimular montantes elevadas circulantes Flt3L. Isso fornece uma abordagem de custo eficaz para induzir Flt3L in vivo, contra injeção de proteína recombinante. Inúmeros estudos, incluindo aqueles em nosso laboratório, empregaram HGT para induzir quantidades de citocinas em uma variedade de condições experimentais 5,12,13. A divisão do trabalho e funções imunológicas precisas para DCs é de grande interesse na área de imunologia. Em particular, pDCs são mediadores importantes de tolerância oral e sistémica anti-viralrespostas, ainda que também parecem contribuir para o desenvolvimento e persistência de auto-imunidade e cancro 14-17. O protocolo aqui descrito vai permitir que os mecanismos que regulam o desenvolvimento PP pDCs ser mais plenamente exploradas. Além disso, esta abordagem pode permitir estudos para avaliar a função PP PDC e pode ser prorrogado para o entendimento da regulação e função de outras populações imunológicas dentro PPs.

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	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">C57BL/6J</td>
			<td style="width:201px;">JAX</td>
			<td style="width:177px;">664</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">B6.SJL</td>
			<td style="width:201px;">JAX</td>
			<td style="width:177px;">2014</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RPMI</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:177px;">11875-093</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352095</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352070</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile surgical tweezers</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile small pair scissors</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile large pair scissors</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">40 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352340</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">35 &#956;m cell strainer cap tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352235</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RBC lysing buffer</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">R7757</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:260px;">FACS buffer</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;">PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Percoll</td>
			<td style="width:201px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:177px;">17089102</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">10XHBSS</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">H4641</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:201px;">Worthington</td>
			<td style="width:177px;">LS004188</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Goat ant-rat IgG microbeads</td>
			<td style="width:201px;">Milteyni Biotec</td>
			<td style="width:177px;">130-048-501</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">LD column</td>
			<td style="width:201px;">Milteyni Biotec</td>
			<td style="width:177px;">130-042-901</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-D3</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">555273</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD19</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553783</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD11b</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553308</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD11c</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553799</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-Ter119</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553671</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD3 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0031</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD19 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0193</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11b (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0112</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11c (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0114</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-F4/80 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-4801</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Ter119 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-5921</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Sca-1 (PE.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">25-5981</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD115 (APC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">17-1152</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-c-kit (APC.Cy7)&#160;</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">47-1171</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-IL-7R (Pacific Blue)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">48-1271</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Flt3 (PE)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">12-1351</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD45.1 (APC.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">560579</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD45.2 (PE.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">Biolegend</td>
			<td style="width:177px;">109830</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11c (Pacific Blue)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">48-0114</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-B220 (APC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">25-0452</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Siglec-H (PE)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">12-0333</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-PDCA-1 (FITC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">Nov-72</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;">e.g. BD Fortessa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Heat lamp</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:177px;">309602</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">27&#189; G needles (sterile)</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:177px;">305109</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the development of murine plasmacytoid dendritic cells in peyer's patches using adoptive transfer of hematopoietic progenitors

Este protocolo detalha um método para analisar a capacidade dos progenitores hematopoiéticos purificadas para gerar células dendríticas plasmocitóides (PDC) em placa de Peyer intestinal (PP). Progenitores de células dendríticas comuns (CDPs, lin - de c-kit eis CD115 + + FLT3) foram purificadas a partir da medula óssea de ratinhos C57BL6 por FACS e transferido para murganhos receptores que não possuem uma população significativa pDC em PP, neste caso, o IFNAR - / - ratinhos foram utilizados como os receptores de transferência. Em alguns camundongos, a superexpressão do fator de crescimento de células dendríticas Flt3 ligante (Flt3L) foi aplicada antes adotivos transferência de CDPs, utilizando transferência de genes hidrodinâmico (HGT) de Flt3L-plasmídeo. Flt3L a superexpressão expande as populações DC provenientes transferidos (ou endógenos) células progenitoras hematopoéticas. No 7-10 dias após a transferência progenitor, pDCs que surgem a partir dos progenitores adotivamente transferidos foram distinguidas das células receptoras nobase de CD45 expressão do marcador, com pDCs de CDPs transferidos sendo CD45.1 + e destinatários sendo CD45.2 +. A capacidade de LDC transferidos para contribuir para a população pDC em PP e para responder a Flt3L foi avaliada por citometria de fluxo de PP suspensões de células individuais a partir de ratinhos receptores. Este método pode ser utilizado para testar se a outras populações progenitoras são capazes de gerar PP pDCs. Além disso, esta abordagem pode ser usada para examinar o papel de factores que estão previstos para afectar o desenvolvimento do pDC em PP, transferindo subconjuntos progenitoras com um knockdown apropriado, eliminar ou sobre-expressão do factor de putativa de desenvolvimento e / ou através da manipulação de citocinas circulantes através HGT . Este método também pode permitir a análise de como pDCs PP afetar a freqüência ou função de outros subconjuntos imunes em PPs. Uma característica única deste método é o uso de IFNAR - / - ratos, que mostram dizimadas PP pDCs em relação ao tipo selvagem animais, assim allowing reconstituição do PP pDCs na ausência de efeitos de confusão de irradiação letal.

Os nossos resultados mostram a estratégia de propagação para o isolamento de LDC a partir de células de medula óssea de ratinho (Figura 1), tal como descrito em Protocolos 2 e 3. LDC compreendem cerca de 0,1% do total de células de medula óssea, e de cerca de 4-6 x 10 4 CDP pode ser isolado a partir de um rato. Após a transferência adotiva, CDPs diferenciar em pDCs e CDCs 10. <img alt="Figura 1" fo:content-w...

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Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Este protocolo descreve os procedimentos experimentais para avaliar a diferenciação de células dendríticas plasmacytoid em placas de Peyer de progenitores de células dendriticas comuns, utilizando técnicas que envolvem o isolamento de FACS mediada por células, a transferência de genes hidrodinâmico, e análise de fluxo de subconjuntos imunes em placas de Peyer.

Avaliando o Desenvolvimento da murino células dendríticas plasmocitóides em placas de Peyer Usando transferência adoptiva de Progenitores hematopoiéticos

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

assessing-development-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-peyer-s

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

11.1K visualizações.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center.  Este protocolo descreve os procedimentos experimentais para avaliar a diferenciação de células dendríticas plasmacytoid em placas de Peyer de progenitores de células dendriticas comuns, utilizando técnicas que envolvem o isolamento de FACS mediada por células, a transferência de genes hidrodinâmico, e análise de fluxo de subconjuntos imunes em placas de Peyer. 

Vídeo: Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Metástase experimental e CTL Adoptive Transferência Modelo rato Imunoterapia

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Imunologia e Infecção

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#039;s Patches

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Accelerated Diabetes Tipo 1 Indução em Ratos por transferência adotiva de diabetogênicos TCD4 +

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

In Vitro geração de células dendríticas plasmocitóides Murino de comum Linfóide Progenitores usando o sistema de alimentação AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Geração de um grande número de progenitores mieloides e células dendríticas precursores de murino medula óssea usando um celular romance classificação estratégia

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Desenvolvimento e validação de uma única molécula ultra-sensível de matriz Digital ensaio imunossorvente ligado à enzima para humana Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...