JB é apoiada por bolseiros das Ciências Naturais e Engenharia do Conselho (NSERC). Apoio para este projeto foi fornecido pela Canadian Institutes of Health Research, Grant MOP-67066.

Este protocolo foi adaptado de Lutz et al 1. Colheita e processamento de medula óssea <ol><li> Isolamento da tíbia e fêmur: Euthanize o mouse doador e pulverizar as pernas com etanol 70%. Segure o tornozelo primeiro firmemente com uma pinça sem corte e começar a cortar a pele e musculatura subjacente para expor a tíbia. Para evitar danos ao osso, cortados de forma lenta e paralelamente à tíbia, deixando intacta a articulação do joelho. Para limpar o fêmur, imobilizar a articulação do joelho, segurando com uma pinça sem corte. Limpe a musculatura com um par de tesouras e pinças curvas. Continue para cima até que a articulação do quadril é exposto e tesoura pode ser colocado entre a cabeça do fêmur e do quadril. Retire os ossos, cortando entre o fêmur ea articulação do quadril e coloque em tampão fosfato salino (PBS) no gelo. </li><li> Remoção de medula óssea: Limpe musculatura restantes dos ossos usando tesouras e pinças curvas. Cortar as epífises de cada osso e localizar a cavidade central. Usando uma seringa de 10 ml carregado com PBS e uma 25G0.5 agulha &quot;, lave a medula óssea em uma placa de Petri não-tecido revestido. </li><li> Processamento de medula óssea: Use a ponta de borracha do êmbolo de uma seringa de 1ml para dissociar a medula óssea em uma suspensão de uma única célula (use um para cima e para baixo, não raspagem de movimento). Colete de medula óssea em um tubo falcon cônica, e enxágüe da medula óssea residual com PBS. </li></ol> Cultura de células dendríticas <ol><li> Ressuspender as células em DC mídia e precursores contar DC em um hemocitômetro (Figura 1). Você vai ver as células de tamanhos variados; os precursores DC são as maiores e mais brilhantes. Diferencialmente contar apenas essas células. A partir de dois fêmures e duas tíbias de um tipo selvagem C57BL / 6 mouse (6-8 semanas de idade), você deve esperar entre 25-40 x 10 6 precursores DC total. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_3/article769_figure_1.jpg" alt="" width="218" height="217" /> Figura 1 </li><li> Células de cultura a uma densidade de 2 x 10 5 precursores DC / DC mL em meio suplementado com 40 ng / mL recombinante murino GM-CSF. Células em placa não-tecido revestido placas de Petri de poliestireno. </li></ol> Adicionar mídia (dia 3) Para atualizar os meios de comunicação, adicione metade do volume total de mídia fresco suplementado com 40 ng / mL GM-CSF. Substituir um terço dos meios de comunicação (dia 6) e maturação Para atualizar os meios de comunicação, remova cuidadosamente um terço do volume total dos meios de comunicação e substituir esse volume com a mídia fresco DC suplementado com 40 ng / mL GM-CSF no dia 6 de cultura. Se desejar, células dendríticas podem ser estimuladas para a maturação usando citocinas ou ligantes toll-like receptor. No vídeo, DCs foram maturados por estimulação durante a noite com 5 ng / mL CpG. Colheita de células dendríticas Cultura DC está completo (Figura 2). Células serão tanto em suspensão e frouxamente aderido à placa. Células aderidas pode ser removido raspando o prato com um raspador de cultura de tecidos e lavagem com PBS. O número total de células aumenta 5-8 vezes durante a semana de cultura e período de diferenciação, portanto, esperar para colher 1-1,6 x 10 6 células / mL. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_5/article769_figure_2.jpg" alt="Figura 2" width="407" height="358" /> Figura 2 Reagentes <ol><li> DC media <ol><li> RPMI-1640 mídia, suplementado com: </li><li> 10% de soro fetal bovino </li><li> 100 UI / mL de penicilina </li><li> Estreptomicina 100 mg / mL </li><li> 1% L-glutamina </li><li> 0,1% 2-mercaptoetanol </li><li> 1X não-aminoácidos essenciais </li><li> 1X piruvato de sódio </li></ol></li><li> Recombinante murino GM-CSF <ol><li> rmGM-CSF (Peprotech inc, New Jersey, nenhum catálogo. 315-03) </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).</li><li>Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC-based+cancer+vaccines.">DC-based cancer vaccines.</a> J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).</li></ol>

DCs são úteis para estudos de interações inata e adaptativa imune, e pode ser utilizado como um vetor de vacina. Neste vídeo, demonstramos os passos para isolar medula óssea e mielóide diferenciar células dendríticas in vitro. Após o período de cultura, essas células podem ser visualizados ao microscópio ambas as células como aderentes, que muitas vezes possuem dendrites, e células não-aderentes rodada. Os DCs pode ser ainda mais manipulados para apresentação de antígenos por pulsando com antígeno ou estimulados para a p...

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<td>recombinant murine GM-CSF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Peptrotech</td>
<td>315-03</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Mielóide células dendríticas (DCs) são frequentemente usados ​​para estudar as interações entre inata e adaptativa mecanismos imunológicos e da resposta inicial à infecção. Porque estes são os antígenos mais potentes células apresentadoras, as DCs são cada vez mais usado como um vetor de vacina para estudar a indução do antígeno específico respostas imunes. Neste vídeo, demonstramos o procedimento para a colheita tíbias e fêmures de um camundongo doador, o processamento da medula óssea e diferenciando DCs in vitro. As propriedades de mudança DCs após a estimulação: células dendríticas imaturas são fagócitos potente, enquanto DCs maduras são capazes de apresentação de antígenos e interação com CD4 + e CD8 + T. Essa mudança na atividade funcional corresponde à regulação alta de marcadores de superfície celular e produção de citocinas. Muitos agentes podem ser usados ​​para DCs maduras, incluindo citocinas e ligantes toll-like receptor. Neste vídeo, demonstramos comparações de citometria de fluxo da expressão de duas moléculas co-estimulatórias, CD86 e CD40, e citocinas, IL-12, após a estimulação durante a noite com o tratamento CpG ou mock. Depois de diferenciação, DCs pode ser ainda mais manipulado para uso como um vetor de vacina ou para gerar antígeno-específicos respostas imunológicas in vitro por pulsos utilizando peptídeos ou proteínas, ou transduzidas utilizando vetores virais recombinantes.

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Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

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22.4K visualizações.  McMaster University. Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.