Agradecemos Renjie Song (Wadsworth Centro Núcleo de Citometria de Fluxo) para assistência na análise de células e Johnson Helen (Wadsworth centro animal Histopatologia Core) para a preparação de parafina. Agradecemos ao Dr. Richard A. Cole (Wadsworth Centro Núcleo de Microscopia de luz) para a assistência com microscopia confocal e coleção de imagens. Nós gostaríamos de agradecer Andy Bentley (Wadsworth Center Foto e Ilustração) para assistência com animações. MDJ é apoiado pela Fundação de Pesquisa de Ciências da Vida, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA é suportado por um Centro de Pesquisa em Saúde-Wadsworth Inc. comunhão intramural de pós-doutorado. Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH HD061916 e GM082978.

Os animais foram alojados em convencionais, livres de patógenos específicos condições e foram tratados em total conformidade com cuidado o Wadsworth Center Animal da Comissão Institucional e de Uso (IACUC) diretrizes. 1. Gavagem oral <ol><li> (Opcional) estirpe de ratinho Gavage de escolha com antigénio ou micróbios de interesse utilizando uma G 22 x1.5-in. blunt-ponta da agulha alimentação (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Volumes de entrega não deve exceder 400 ul por rato. </li></ol> 2. Isolamento de Células PP para Citometria de Fluxo <ol><li> Euthanize ratos por asfixia CO 2, de acordo com o cuidado de animais e de uso institucional do comitê (IACUC) diretrizes. </li><li> Purificar o abdómen com etanol a 70% ou betadine antes da cirurgia. Realizar uma laparotomia padrão que envolve uma incisão (1 cm) único usando tesouras cirúrgicas grau ao longo do inicio da linha média de cerca de 1,5 cm da base da caixa torácica. Exponha o porcavidade itoneal e identificar o ceco. Cortar o intestino pequeno terminal na junção íleo-cecal e remova o intestino na sua totalidade. Tomar cuidado para não hiperextensão o tecido intestinal, uma vez que está a ser removida a partir da cavidade peritoneal. </li><li> Coloque o intestino delgado em uma cama de toalhas de papel úmidas ou Kimwipes. Molhar o intestino delgado suavemente com solução salina para evitar a desidratação dos tecidos. Identificar visualmente PPs individuais localizados no lado anti-mesentérico do intestino (Figura 1). Tipicamente, um único rato tem 5-10 PPs visíveis que são uniformemente distribuídos a partir do duodeno (proximal) ao íleo (distal). Em média, quatro ratos renderá 23 PPs. </li><li> Utilizando uma tesoura cirúrgica, curvadas suavemente consumo PPs individuais e colocá-los em solução fria salina balanceada de Hank (HBSS). Nota, a tesoura curva deve ser colocada voltada para cima logo acima do PP e então suavemente aplicada ao tecido. Excise apenas a PP (não surrounding de tecido) e de transferência de HBSS frio. Nota: Todas as incubações e os passos de centrifugação a partir deste ponto para a frente na secção 2, deve ser feita a 4 ° C para preservar a viabilidade celular. </li><li> Transferir PPs em 5 ml de Meio Baço dissociação e incubar durante 15-20 min a 37 ° C, enquanto se agita vigorosamente a 250 rpm. Tempo de incubação vai afetar negativamente a viabilidade celular. </li><li> Para gerar uma suspensão de célula única, PPs lugar numa estéril 70 um (autoclavado) nylon peneira malha de célula e à força moer o tecido dentro da malha utilizando a base de um êmbolo de uma seringa de 1 cc. Como alternativa, o PPS sanduíche entre duas lâminas de vidro fosco estéreis microscópio (autoclavado em envelopes) e gentilmente moer tecidos com um movimento de ida e volta. Usar uma pipeta estéril para transferir a suspensão de células para um tubo Falcon de 5 ml. </li><li> Adicionar EDTA para uma concentração final de 1 mM para a suspensão de células. Incubar em uma cadeira de balanço para5 min à temperatura ambiente. </li><li> Suspensão de células através de um segundo decantar célula 70 um filtro para remover quaisquer agregados remanescentes celulares ou restos de tecido. Recolher as células num tubo de 15 ml ou 50 cónica. </li><li> Células sujeitas a centrifugação suave (5 min a 500 xg). Decantar sobrenadante e ressuspender as células em tampão de fluxo, que é salino tamponado com fosfato (PBS) contendo 1% de soro fetal de vitelo (FCS). </li><li> Para determinar o número de células e viabilidade, diluir as células em azul de tripano 01:10 e inspeccionar visualmente células utilizando um microscópio de luz e um hemocitómetro. Alternativamente, um contador de células Countess (Invitrogen) ou instrumento similar pode ser usado para enumerar automaticamente o número de células e viabilidade. Começando com 20-25 PP, este protocolo deve render&gt; 2,5 x 10 6 células totais. Isso equivale a ~ 0,8-1,2 x 10 6 células por mouse. </li></ol> Labeling anticorpo de células por citometria de fluxo &lt;início ol = &quot;11&quot;&gt; <li> Pipetar as células (10 5 por cavidade) em cavidades de uma placa de 96 poços de fundo redondo. </li><li> Placa sujeita a centrifugação suave (5 min a 1000 xg), e decantar o sobrenadante invertendo suavemente a placa. </li><li> Ressuspender as células em tampão de bloqueio Fc e incubar em gelo durante 15 min. Embora haja um certo número de tampões de bloco comercialmente disponíveis Fc (por exemplo, de rato anti-ratinho CD16/CD32, BD Biosciences), simplesmente usar meio gasto a partir de uma célula de hibridoma de rato B (ATCC 2.4.G2) que segrega um IgG monoclonal murino contra um Fcy receptores para este passo. </li><li> Placa sujeita a centrifugação suave (5 min a 1000 xg), como acima, e decantar o sobrenadante invertendo suavemente a placa. </li><li> Adicionar fluoróforo anticorpos conjugados directamente para as suspensões de células a diluição desejada, e incubar em gelo durante 30 min com agitação contínua. </li><li> Placa sujeita a centrifugação suave (5 min a 1000 xg), e decantarsobrenadante, invertendo com cuidado a placa. </li><li> Lavar as células com 100 uL de tampão de fluxo. </li><li> Centrifugar a placa 1000 xg durante 5 minutos, decanta-se o sobrenadante e invertendo suavemente a placa. </li><li> Ressuspender as células 400 tampão de fixação ul, que consiste em 300 ul de tampão de fluxo e 100 uL de paraformaldeído a 1% em tampão PHEM (60 mM de PIPES, HEPES 25 mM, EGTA 10 mM, MgCl2 4 mM, pH 6). </li><li> As células sujeitas a citometria de fluxo utilizando um FACSCalibur ou equivalente. Analisar os resultados utilizando células da Quest versão do software Pro 5.2. </li></ol> 3. Preparação de PP criocortes <ol><li> Antes da coleta de tecido, adicione Optimal Cutting Temperatura composto (OCT) para 7x7x5 milímetros moldes base de plástico. Também preparar um conjunto de azoto líquido (&gt; 750 mL) num balde de gelo ou dewar. </li><li> Euthanize rato e executar uma laparotamy, como descrito acima. Remover intestino e coloque em toalhas de papel molhado. </li><li> Paraisolar PPs para cyrosectioning, cortar segmentos de 0,5 centímetros transversais do intestino delgado, contendo uma única e tecido PP transferência para uma placa de Petri contendo PBS. Lave o lúmen desses segmentos com PBS para remover os restos não desejados fecal. </li><li> Colocar os segmentos de tecido intestinal verticalmente dentro de moldes de bases contendo outubro Mergulhar os moldes em azoto líquido e permitir que o tecido para congelar completamente (1-2 min). A cor da OCT irá mudar de transparente para branco quando o tecido é completamente congelada. . Para um arrefecimento mais gradual (por exemplo, para reduzir a fractura do OCT), molde imerso em um banho de isopentano resfriado com nitrogênio líquido vapores Nota: Usar óculos de segurança adequadas quando se trabalha com nitrogênio líquido. </li><li> Remover os moldes de bases congelados do azoto líquido utilizando fórceps e permitir que o molde se aquecer à temperatura ambiente, apenas o tempo suficiente (~ 10-15 segundos) para permitir que as bordas do bloco OCT para amolecer. Para, em seguida, remover o bloco congelado de outubro deo molde, inverter o molde e pressione suavemente sobre a volta para ejetar o bloco para um 4 x 4 cm limpo pedaço de papel alumínio. Imediatamente enrolar o tecido na película e colocar num saco de amostra marcado armazenados em azoto líquido ou em gelo seco. Alternativamente, a transferência de tecido em um congelador (&lt;-20 ° C). Usar o tecido dentro de uma semana, de outro modo os blocos vão tornar-se frágil com a idade. </li></ol> Cryosectioning <ol start="6"><li> Criocorte o tecido utilizando uma Leica CM3050S cryomicrotome ou equivalente. A temperatura da câmara do criostato deve ser ajustado para -21 ° C. </li><li> Esforce-se para as secções que são 12-14 um de espessura. </li><li> Colete secções em Fisher SuperFrost Plus (ou equivalente) lâminas de microscópio de vidro e inspecionar visualmente utilizando um microscópio de luz padrão de baixa potência. Se várias seções estão sendo coletados em um slide, garantir que eles estão agrupados em cluster para aplicações de coloração jusante. </li><li> Loja tele desliza para a temperatura ambiente dentro de uma caixa corrediça e, de preferência, usa-los dentro de poucos dias. </li></ol> Labeling anticorpo de criocortes e Análise Microscopia Confocal <ol start="10"><li> Imergir as lâminas em acetona (ou metanol) em frasco de tecido de coloração ou prateleiras durante 2 min. Incubação prolongado pode causar tecidos para destacar do slide. </li><li> Transferir as lâminas para coloração novo frasco e lava-se 3 vezes com PBS-T (1X PBS com 0,05% de Tween-20) durante 3 minutos cada. </li><li> Cercar as seções com uma caneta hidrofóbica ImmEdge. Isto irá assegurar que os reagentes e anticorpos permanecerá confinado a essa área durante as incubações. </li><li> Incubar as lâminas em tampão de bloqueio (soro de cabra a 2% em PBS) durante 30 min a 37 ° C numa câmara humidificada, protegido da luz. </li><li> Incubar as lâminas com tampão de bloqueio Fc (ver acima) durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Dip slides em PBS-T, e em torno de secções de área seca usando Kimwipes ou tecido absorvente.Tome cuidado para não tocar nos cortes de tecido reais. </li><li> Sobreposição de secções de tecido com uma solução de anticorpo primário e incubar durante 30 min a 37 ° C numa câmara humidificada. O anticorpo primário é geralmente diluído em tampão de bloqueio para uma concentração final de 20 ug / ml. A utilização de anticorpos marcados directamente primários é desejável, porque até três anticorpos pode ser combinada directamente nesta etapa. Anticorpos marcados directamente também eliminar a necessidade de passos adicionais de incubação de anticorpos. </li><li> Lavar as lâminas três vezes (5 min cada) por imersão em PBS. </li><li> Se necessário, incubar com anticorpos secundários relevantes para 30 min a 37 ° C numa câmara de humidade. </li><li> Lavar as lâminas três vezes (5 min cada) por imersão em PBS. </li><li> Incubar as lâminas durante 4 min em paraformaldeído a 1% em tampão PHEM, como descrito acima. </li><li> Lavar as lâminas com PBS durante 1 min. </li><li> Área seca em torno de seções usando Kimwipes ou outros absorvertecido ent. Tome cuidado para não tocar nos cortes de tecido reais. Usando uma pipeta ou conta-gotas, coloque delicadamente uma gota de Prolongar meio de Ouro de montagem diretamente na seção. Aplicar uma lamela de vidro para o meio de montagem com cuidado para evitar bolhas. Use papel absorvente para absorver qualquer excesso de meio de montagem. </li><li> Lamínulas do selo para lâminas de microscópio com unha polonês comercial e deixar secar ao ar. </li><li> Ver slides com uma Leica TCS SP5 ou microscópio confocal equivalente. </li></ol>

<ol>
	<li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA's+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut.">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li><li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Rescigno, M., Sabatino, A. 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L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer's+patch.">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer's+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer's+patches+in+adult+mice.">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste artigo, nós fornecemos protocolos paralelos para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e funcional e criosseções para a imunocoloração. Ambos os métodos são altamente reprodutível e facilmente acessível, na condição de um citómetro de fluxo e criostato estão disponíveis. Para os investigadores primeira vez deve-se sublinhar que, quando comparado com o baço, o rendimento total de células de PPs são relativamente escassas. No entanto, o protocolo des...

Placas de Peyer (PP) são agregados macroscópicos de organizados folículos linfóides presentes em todo o intestino delgado dos humanos e ratos (Figura 1) e que constituem os sítios primários em que mucosas respostas imunes são iniciadas contra antígenos alimentares, bactérias comensais, agentes patogénicos microbianos e vacinas orais 1-4. Ao contrário de outros tecidos linfóides periféricos, como os linfonodos mesentéricos, PPs não têm vasos linfáticos aferentes. Como tal, as respostas imunes adaptativas em PPs são accionados em resposta a antigénios derivados a partir do lúmen intestinal. A amostragem de antigénios luminais é realizado pelo epitélio do folículo-associado (FAE), que consiste em dois enterócitos e antigénio-amostragem células conhecidas como células M. Abaixo da FAE, na cúpula sub-epitelial (SED) região, encontra-se uma rede de células dendríticas (CDs) misturavam-se com macrófagos, células B e células T CD4 + 5-9. No centro de cada follicl PP linfóidee são células dendríticas foliculares (FDC) e uma de células B rico centro centro germinal, ladeada por zonas de célula T ricos interfoliculares. Amostragem de antigénio por PPs resulta no desenvolvimento de IgA + plasmablasts de células B e as células CD4 + efectoras e de memória que a semente da lâmina envolvente e proporcionar imunidade a uma grande variedade de invasores mucosas. Dissecando os eventos imunológicos complexos associados à amostragem antígeno, tratamento e apresentação em PPC é uma tarefa difícil, considerando-se que as células PP constituem apenas uma pequena fração do total de células linfóides na mucosa intestinal. Para ajudar na caracterização in vitro de células neste meio, é proporcionado um protocolo para a preparação de células totais de PP de rato para a análise de citometria de fluxo e funcionais, bem como um protocolo para a preparação de PP criocortes para microscopia de imunofluorescência, e imunohistologia. O protocolo para o isolamento, caracterização e imunocoloração de mouscélulas E PP não é novidade, por si só, como evidenciado pelo fato de que há inúmeras referências datam mais de 25 anos que citam estas técnicas 5,6,9-11. Em vez disso, nosso protocolo fornece um método (e visual) simplificado para investigadores coleta PPs pela primeira vez. As técnicas aqui descritos são facilmente dominado e prontamente produzir grandes números de células com&gt; 90% de viabilidade celular. O protocolo cryosectioning rende altamente reprodutíveis de secções seriadas idealmente adequadas para a coloração de imunofluorescência e de imagem confocal. Além disso, o nosso protocolo complementa dois outros artigos de Jove recentes. O primeiro, por Fukuda e colaboradores, descreve a utilização de ensaios de ligadura de laço ileal para avaliar a absorção de bactérias patogénicas em células PP M 12. O outro, pelo GEEM e colaboradores, descreve o isolamento e caracterização de DCs e macrófagos da mucosa intestinal do rato, mas exclui explicitamente PPs da sua análise 13.

<table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Companhia </td><td> Gato. # </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Composto outubro </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 milímetros Moldes de Base </td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge Pen </td><td> Vector Labs </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Além disso Superfrost Slides </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td> Borda Rito Lâmina </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD11c-PE </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD3-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD4 de rato-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rato CD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD19-PerCP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td> Solução salina equilibrada de Hank (HBSS) sem vermelho de fenol </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70 filtro de células mM </td><td> BD Falcon </td><td&gt; 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Médio baço dissociação </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td> Soro de cabra </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> Fc Bloco </td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td> SUPES obtido a partir de linha de células 2.4.G2 </td></tr><tr><td> Tesoura curva </td><td> FST </td><td> 14061-09 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Leica </td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACS Calibur </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Condessa contador de células </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hematoxilina </td&gt; <td> Richard Allan </td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina </td><td> Richard Allan </td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td> Formalina </td><td> Starplex Scientific </td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. Reagentes e equipamento utilizados neste estudo. </td></tr></tbody></table>

isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches

Placas de Peyer (PP) são componentes integrais dos tecidos linfóide associado ao intestino (GALT) e desempenham um papel central na imunovigilância intestinal e homeostase. Antigénios particulados e micróbios no lúmen intestinal estão continuamente sujeitos a amostragem por células PP M no epitélio folicular-associado (FAE) e transportado para uma rede de base de células dendríticas (DC), macrófagos, linfócitos e. Neste artigo, descreve protocolos em que PPs murinos são (i) dissocia-se em suspensões de células isoladas e sujeitas a citometria de fluxo, e (ii) preparado para cryosectioning e imunocoloração. Para a citometria de fluxo, PPs são dissociadas mecanicamente e em seguida filtrada através de membranas 70 uM para gerar suspensões de células individuais livres de células epiteliais e os detritos de grandes dimensões. Começando com 20-25 PPs (a partir de quatro ratinhos), esse método rápido e reproduzível origina uma população de&gt; 2,5 x 10 6 células, com&gt; 90% de viabilidade celular. Para cryosectioning, frescoPPs ly isoladas estão imersos em meio de corte ideal de temperatura (OCT), congelado em nitrogênio líquido, e seccionados usando um cryomicrotome. As secções de tecido (5-12 mm) são secas ao ar, fixadas com acetona ou metanol, e, em seguida, submetido a imunomarcação.

Citometria de fluxo e suspensões monodispersas de células totais PP revela uma clara distinção entre preparações de células boas e pobres. Em preparações de células com mais de 80 anos de boa viabilidade%, a grande maioria das células demonstram alta dispersão frontal (FSC), um indicador do volume da célula de alta e baixa dispersão lateral (SSC), um indicador de granularidade baixa de células (Figura 2A). Nesta experiência, também preparado intencionalmente a &quot;preparação de cél...

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Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#039;s Patches

Existe um interesse crescente na compreensão das funções imunológicas de subpopulações específicas de células em placas de Peyer (PP), os locais primários indutivos de tecidos linfóide associado ao intestino. Aqui destacamos protocolos paralelos para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e criosseções PP para imunocoloração.

Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

isolating-immunostaining-lymphocytes-dendritic-cells-from-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

32.4K visualizações.  New York State Department of Health. Existe um interesse crescente na compreensão das funções imunológicas de subpopulações específicas de células em placas de Peyer (PP), os locais primários indutivos de tecidos linfóide associado ao intestino. Aqui destacamos protocolos paralelos para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e criosseções PP para imunocoloração.

Vídeo: Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Geração e Rotulagem de murino derivadas da medula óssea Células Dendríticas com Nanocristais Qdot de Estudos de rastreamento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Avaliando o Desenvolvimento da murino células dendríticas plasmocitóides em placas de Peyer Usando transferência adoptiva de Progenitores hematopoiéticos

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

As células T Capturar Bactérias por Transinfection das dendríticas

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

In Vitro geração de células dendríticas plasmocitóides Murino de comum Linfóide Progenitores usando o sistema de alimentação AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...