Somos gratos ao Dr. Xiaolian Gao, da Universidade de Houston, para prestação de consultoria para a plataforma de microarray LC Ciências miRNA, a Dr. Karin Edvardsson, Instituto Karolinska, na Suécia, e Dr. Eylem Aydogdu, da Universidade de Houston, por compartilhar seus conhecimentos miRNA . A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número R01CA172437. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health. Este trabalho também foi apoiado por subsídios do Fundo Emerging Technology Texas, no âmbito do Acordo não. 300-9-1958.

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Trans. 40 (4), 752-758 (2012).</li><li>Kao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+breast+cancer+cell+lines+defines+relevant+tumor+models+and+provides+a+resource+for+cancer+gene+discovery.">Molecular profiling of breast cancer cell lines defines relevant tumor models and provides a resource for cancer gene discovery.</a> PLoS One. 4 (7), e6146 (2009).</li><li>Lacroix, M., Leclercq, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+breast+cancer+cell+lines+as+models+for+breast+tumours:+an+update.">Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update.</a> Breast Cancer Res. Treat. 83 (3), 249-289 (2004).</li><li>Ross, D. T., Perou, C. 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Os autores não têm nada a revelar.

Determinar o mecanismo de regulação hormonal de miRNA em células de câncer de mama pode fornecer uma plataforma para a compreensão desta doença e pode fornecer potencial tratamento para o cancro da mama. A cultura destas células para proporcionar a condição óptima para a acção da hormona é muito importante. Aqui, um protocolo que assegura que a hormona de interesse (estrogénio) foi excluída antes do tratamento e que uma dose óptima de E2 foi utilizado durante um tempo apropriado, durante o tratamento foi descrito. Outros efeitos do factor de crescimento hormonais e foram mantidas a um mínimo através da redução gradual dos níveis séricos e usando DCC-FBS, o qual é de FBS que foram arrancados da maior parte da sua hormona, citoquinas, e factores de crescimento. Fenol mídia livre de vermelho foi ainda utilizado para minimizar outros efeitos não-hormonais, dado que o fenol vermelho foi reportado como tendo actividade estrogénica e afectar certas funções em linhas celulares de 20,21. O tempo de exposição das células à hormona é de grande importância. Para regulação associados com estrogénio de genes, tem sido mostrado previamente que 24 hrexposure produzir uma resposta significativa de genes alvos directos nas células do cancro da mama 1,18. Desde miRNAs são transcritos pela RNA polimerase II, como mRNAs, é concebível que este é um ponto de tempo adequado para detectar regulação direta também de miRNAs. É ainda a ser determinado, se e como estes miRNAs afetar a expressão dessas metas ER conhecidos em células de câncer de mama. miARN perfil de expressão pode ser um desafio devido ao pequeno tamanho relativo da miARN, o facto de a sequência madura miARN pode ser encontrado também na pri-miARN e o pré-miARN, e por causa da heterogeneidade no seu teor de GC 22. Várias técnicas de perfilamento e químicas têm sido empregadas para superar esta dificuldade. Entre estes são diferentes abordagens de microarray e análise de qPCR (figura 2). Apesar de microarray é amplamente aceito por todo genoma analysis, pode proporcionar falsos negativos e existem diferenças entre as plataformas disponíveis, que variam a partir da química para a tecnologia de impressão 23. Além disso, o processo de normalização apresenta um desafio ao analisar os relativamente poucos genes miRNA, que são contados em milhares comparação com as dezenas de milhares de cópias de RNAm. qPCR, por outro lado, é mais sensível, e é melhor aplicada quando menos genes devem ser considerados. No entanto, quando realizado em grandes placas de 384 poços, com apenas uma réplica técnica por placa, várias placas necessitam de ser analisados ​​para cada amostra o que torna a análise dispendiosa. Além disso, em nossas mãos, muitos resultados mais negativos falsos foram obtidos por meio da análise DLP-LDA em comparação com o microarray. Dado que a sequência de miARN madura está presente no pri-miARN e as sequências pré-miRNA, é de interesse para diferenciar entre estas transcrições que utilizam técnicas de PCR de 24. Sondas de DLP estão disponíveis também para pré-miRNAs, e spprimers ecific também pode ser projetado para excluir diferente maduro ou precursor variantes usando corante Cyanine tecnologia qPCR. qPCR é um padrão de ouro para a validação da expressão diferencial de perfil resultados. A eficácia da qPCR, no entanto, depende de vários parâmetros, incluindo a extracção de ARN, a integridade do RNA (qualidade), a síntese de cDNA, o desenho de primers, método de detecção (química), e o gene de referência para a normalização dos dados 1,22,25. As opções para o desenho de primers para análise de miRNA é muito limitado, uma vez que o comprimento da seqüência de curto miRNA não dá muito espaço para desenho de primers alternativa, e apenas uma cartilha pode ser abrigado neste curto espaço de seqüência. Por isso, a necessidade de manipulações alternativos, como ilustrado na Figura 2. Repetições técnicas são importantes para validar a robustez do método de amplificação e do processo empregado. Réplicas biológicas são necessárias para uma representação do variatio biológica geraln, incluindo a resposta variável ao ligando de tratamento, e para mostrar que os efeitos observados em uma célula são reprodutíveis. Com base em nossa experiência, as variações na expressão de miRNA entre culturas celulares podem ocorrer. Normalmente, estas diferenças são menores do que cerca de 1,3 vezes, e a média de valores e correspondente SD identifica a variação natural e tecnológico. Esta variação pode resultar de vários factores, incluindo, a densidade celular e o facto de as funções celulares podem mudar de passagem para passagem. Para identificar estatisticamente significativas expressões resultantes do tratamento ligante, um significado amplamente aceito é quando o valor de p for menor que 0,05. Aqui, o teste t de um estudante nas repetições biológicas e técnicas que utilizam a distribuição de duas caudas e de duas amostragens parâmetros de variância desiguais têm sido utilizados. Existem outros parâmetros t-teste, ea escolha depende da configuração experimental 26. Um protocolo detalhado para avaliar regulamentos hormonais de maduro miRNA em células de câncer de mama foi fornecido. Tecnologias importantes e química em perfis e validar essas expressões miRNA foram claramente explicados. A tecnologia escolhida para estudos de miRNA em células de câncer de mama em última análise, depende do que exatamente está sendo investigado.

O estrogênio é um hormônio que é importante durante o desenvolvimento da glândula mamária. O estrogênio também desempenha um papel importante no desenvolvimento, manutenção, risco e tratamento do câncer de mama 1. O estrogênio exerce sua função através da ligação a ERs, que são fatores de transcrição e regulam genes-alvo específicos. Das duas variantes do receptor, ERa é essencial para a proliferação dependente de estrogénio das células do cancro da mama. A maioria dos cânceres de mama são ERa positivo e depende de estrogênio para o crescimento. Isso fez com que a sinalização estrogênio e ERa um alvo para o tratamento in-receptor de hormônio de câncer de mama positivo. Compreender o mecanismo subjacente de ERa é importante para melhorar os resultados do tratamento, superar a resistência ao tratamento, e entender como o câncer de mama se desenvolve. miRNAs desempenham papéis críticos em funções celulares devido ao seu grande impacto na regulação gênica pós-transcricional. miRNAs são 19-24 nucleotídeos curto, de cadeia única, Não codificante RNAs que são primeiro transcritos pela RNA polimerase II em transcrições primárias miRNA (pri-miRNA). Eles são processados ​​no núcleo por Drosha em precursoras-miRNAs curtas de gancho (pré-miRNA) e em seguida processada por Dicer e separadas em cadeias individuais para formar miRNAs maduras no citoplasma. O single-stranded miRNAs maduros são transferidos para as proteínas Argonaute para formar complexo RISC. Em seguida, os miRNAs pode hibridar com as regiões 3 &#39;não traduzidas (3&#39;-UTR) de um ARNm alvo, levando a regulação pós-transcricional, bloqueando a tradução ou a degradação do mRNA-alvo 2. Devido ao importante papel que estrogênio e miRNAs desempenham na progressão do tumor, identificando miRNAs associados sinalização normal ou interrompido o estrogênio é importante para melhorar a nossa compreensão do desenvolvimento e melhorar o tratamento do câncer de mama. Embora haja uma boa compreensão de como ERa regula genes codificadores de proteínas, a extensãoe detalhes de não-codificante regulamentos RNA continua a ser minuciosamente investigadas. Os estudos iniciais com o objetivo de elucidar ERa regulação do miRNA em linhas de células de câncer de mama tiveram resultados conflitantes, mesmo quando a mesma linhagem de células foi analisado 3-6. Isto pode ser um resultado de tratamentos diferentes, variações biológicas, a utilização de técnicas diferentes, e ao facto de o pequeno tamanho destes pequenos RNAs torná-los difíceis de analisar. Aqui, um protocolo que controla as variações do método e artefactos é descrito. Para identificar quais miRNAs são regulados pelo estrogênio, o perfil de um modelo de câncer de mama bem definida de atividade ERa é um primeiro passo. Várias linhas de células foram geradas a partir de tumores da mama humanos ERa-positiva, que são dependentes de estrogénio parecido com a maioria dos cancros da mama clínicos. As propriedades moleculares de duas destas linhas de células, T47D e MCF7, incluindo a expressão de ERa e seu alvo a jusante,o receptor da hormona progesterona (PR), a falta de expressão do receptor da membrana de HER2, juntamente com a expressão de genes de diferenciação de resposta ao estrogénio e luminais-epitelial, torná-los adequados como modelos para o subtipo luminal dos tumores mamários 7-10. 17β-estradiol (E2) é a forma predominante de estrogénio, e as concentrações e os pontos de tempo para a activação da transcrição óptima de ERa foram caracterizados em vários estudos. Neste protocolo 10 nM tratamento E2 por 24 horas é usado e T47D e MCF7 como modelos para a atividade ERa em células de câncer de mama 1. Além disso, os regulamentos miRNA tempo-dependentes podem ser especificamente analisados ​​em um intervalo de tempo de por exemplo 1-72 horas. Em segundo lugar, analisando miRNA tem desafios diferentes, em parte devido aos seus tamanhos curtos. miRNAs não são bem retidos na preparação de ARN total, quando guanidina thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol precipitações RNA regulares são realizados, ou quando rpurificações coluna Andard são utilizados. Precauções especiais devem ser tomadas para manter ou enriquecer para a menor fração de RNAs. Aumentando o volume de isopropanol, baixando a temperatura antes da centrifugação (-80 ° C), e omitindo a lavagem com etanol a 70%, a retenção destes pequenos RNAs pode ser aumentada durante a precipitação. Ou, as colunas e os tampões específicos para uma preparação de ARN total contendo miARN de alta qualidade e robusto pode ser utilizado. Também para a própria análise, seus tamanhos curtos criar desafios. Para a seleção de miRNA de todo o genoma, há três miRNA comuns técnicas para escolher de perfil: microarrays, qPCR, e sequenciamento de última geração. Cada técnica pode ser realizada utilizando várias plataformas diferentes, e são necessárias diferentes preparações de amostra, cada uma com diferentes riscos da introdução de artefactos. Em miRNA microarray, um slide é manchado ou sintetizado com milhares de oligonucleotídeos. Estes oligonucleótidos são usados ​​como sondas, e cada um de a sondas é desenhado para hibridar com uma sequência de miARN particular. A preparação de amostras para microarrays, como realizado neste estudo, o primeiro enriquece para miRNAs e depois introduz Cy5 e Cy3 rotulagem para os miRNAs. Microarray dá a oportunidade para observar os níveis de expressão relativa de um grande número de genes em simultâneo, é rápido e adequado para o rastreio de grande número de amostras, mas só pode analisar as sequências presentes no micro-arranjo e por exemplo não detectar alterações na desconhecido ou mutado miRNAs. Análise Microarray como realizado neste protocolo também requer quantidades relativamente grandes, cerca de 5 mg, de RNA total por amostra para análise. Baixa densidade qPCR miARN perfis requer menos material (700 ng / amostra e replicar), e permite a detecção e quantificação de miRNAs. Níveis de transcrição podem ser determinados, e a quantidade pode ser um valor absoluto ou um valor relativo. análise qPCR primeiro requer a conversão de miRNA em cDNA, aqui usando um loopprimer para cada miRNA específicas que garantam a análise de apenas amadurecer miRNA. Isto gera um modelo já que pode ser amplificado utilizando um iniciador de sentido directo específicos de miARN e um iniciador inverso universal complementar para a sequência loop, e podem abrigar a inserção de uma sonda dupla etiquetado para especificidade. qPCR pode ser utilizado num formato de baixa densidade em que centenas de miRNAs pode ser detectado em paralelo utilizando uma ou várias placas de 384 poços com os pares de iniciadores individuais em cada poço 11. Sequenciação da próxima geração, por outro lado, é a única destas técnicas que permite para a descoberta de novos, miRNAs mutadas ou modificadas, como todos os ARN de uma amostra pode ser sequenciado 11. Esta técnica, contudo, requer várias etapas para enriquecer pequenos RNAs e produzem uma pequena biblioteca de ARN utilizando várias etapas de ligaduras ligantes e purificações com riscos subsequentes melhoradas de modular os níveis de expressão relativa entre amostras. Também requer bioinformati significativasanálise cs. Dadas as diversas técnicas de miARN perfis, a técnica mais apropriada depende das aplicações. Microarrays são mais adequados quando o material é relativamente abundante e os juros é definir expressão diferencial de miRNAs já conhecidos. Baixa densidade matrizes qPCR são os mais adequados quando uma quantidade limitada de amostra está disponível e uma maior sensibilidade destes pequenos RNAs de baixa expressa é necessário. A sequenciação é mais apropriado quando é necessária a análise de miRNAs desconhecidas, mutantes ou isoformas diferentes de um miARN. No estudo dos miRNAs regulados por estrogénios em câncer de mama, duas células de linhas de modelo são usadas, T47D e MCF7, onde grandes quantidades de RNA estão prontamente disponíveis. Cada linha celular foi analisada em culturas de células replicadas, utilizando diferentes passagens, cada uma em repetições técnicas de tratamento. Isto permite a detecção robusta de reprodutível, miRNAs ERa regulamentados. Relativos níveis de expressão de miRNA foram comparados usando tanto microarray miRNA eSondas marcadas duplas - matrizes de baixa densidade (DLP-LDA) e validou os resultados com qPCR específico usando tanto corante Cyanine e químicas de DLP. regulamentos miRNA foram, então, analisados ​​em séries temporais para definir sua regulamentação exata ao longo do tempo, o que pode ajudar a diferenciar variações aleatórias ou circadianos dos regulamentos induzida pelo estrógeno, e indicar efeitos primários de efeitos secundários. Comparações Bioinformatical com estudos de ligação da cromatina de ERa pode auxiliar ainda mais na diferenciação do ensino primário contra efeitos secundários. O ensaio resultou em uma avaliação fiável dos regulamentos miRNA onde poderia ser estabelecido que, após tratamento E2 24 hr transcrições codificadores de proteínas foram prontamente regulada mas miRNAs maduros não foram afetadas 1. No entanto, é possível que os miRNAs são regulados pelo posteriores pontos temporais, como demonstrado na análise de séries temporais de miRNAs selecionados 1. Os detalhes precisam ser mais explorados eo protocolo apresentado aqui fornece uma Robust maneira de estudar regulação hormonal de miRNAs maduros em linhas celulares de cancro da mama.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1277">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">DMEM</td>
			<td style="width:364px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:399px;">11885092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phenol red-free DMEM&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11054020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrapure Water</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Specific equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DCC-FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6765-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS tablet</td>
			<td>Medicago, Accurate chemicals</td>
			<td>Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">17&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2758</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ICI 182,780&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4409</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-600ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T47D or MCF7 cells lines</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flask&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>BD353136 (vented cap)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300062</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serological pipet</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>53300. For 5mL (53300-421)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Cell Counting chamber</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10228</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10227</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm plates&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>25382-166</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596026</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber cell scraper&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>82050-470</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase-Free DNase I&#160; kit (DNA degradation)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free water (Nuclease-free water)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>SH30538.02</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 1000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>ND-1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent RNA 6000 Nano Assay kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1512</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938C and for software (G2946)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">All primers (except TaqMan primers)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Specific per order for each gene/miRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18080085</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroAmp Fast 96-Well reaction plate&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4346906</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Optical Adhesive Covers</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4311971</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4385612</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7500 Fast Real-Time PCR System and software</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4351106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#956;Paraflo Microfluidic Biochip Technology&#160;</td>
			<td>LCSciences</td>
			<td>MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4400928</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneAmp PCR System 9700 thermocycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4310899</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4324018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4329001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS and RQ manager softwares</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4444202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MIRC-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X DPL (TaqMan) RT primers</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Specific for each miRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20X DPL (TaqMan) real-time assay primer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Specific for each miRNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling of estrogen-regulated micrornas in breast cancer cells

O estrogênio desempenha um papel vital no desenvolvimento da glândula mamária e progressão do câncer de mama. Ele medeia a sua função pela ligação e ativação dos receptores de estrogênio (ERS), ERa e RpE. ERa é freqüentemente regulada no câncer de mama e impulsiona a proliferação de células de câncer de mama. Os ERs funcionar como fatores de transcrição e regulam a expressão do gene. Considerando que o Regulamento do ERa de genes codificadores de proteínas está bem estabelecida, sua regulamentação não codificante de microRNA (miRNA) é menos explorado. miRNAs desempenham um papel importante na regulação pós-transcricional de genes, inibindo a sua tradução ou a degradação de ARNm sua. miRNAs pode funcionar como oncogenes ou supressores de tumor e também são promissores biomarcadores. Entre os ensaios miRNA disponíveis, microarray e em tempo real PCR quantitativo (qPCR) têm sido amplamente utilizados para detectar e quantificar os níveis de miRNA. Para identificar os miRNAs regulamentados pela sinalização estrogênio no câncer de mama, thexpressão eir em linhagens de células de câncer de mama ERa-positivas foram comparados antes e depois de estrogênio-ativação usando tanto os microarrays μParaflo-microfluídicos e Dual-sondas marcadas baixas matrizes densidade. Os resultados foram validados usando ensaios qPCR específicas, aplicando-se tanto Cyanine corante à base e Dual rotulada química baseada em Sondas. Além disso, um ensaio de ponto de tempo foi usado para identificar os regulamentos ao longo do tempo. Vantagens da abordagem ensaio miRNA utilizado neste estudo é que ele permite uma triagem rápida de regulamentos maduro miRNA em inúmeras amostras, mesmo com quantidades de amostras limitadas. O layout, incluindo as condições específicas para a cultura de células e tratamento com estrógeno, repetições biológicos e técnicos, e de triagem em larga escala seguido de confirmações em profundidade usando técnicas distintas, garante uma detecção robusta de regulamentos miRNA e elimina falsos positivos e outros artefatos. No entanto, os miRNAs mutantes ou desconhecidos, ou regulamentos no leve transcrito primário e precursorl, não irá ser detectado. O método aqui apresentado representa uma investigação aprofundada da regulamentação miRNA mediada por estrogênio.

Uma visão geral do método é apresentado na Figura 1 e uma comparação entre as várias preparações de amostras e modificações de ácidos nucleicos necessárias para cada técnica é visualizado na Figura 2. A condição eo ambiente das células antes do tratamento com hormônio é importante para determinar os efeitos reais do hormônio 16. Alguns meio e soro contêm factores de crescimento que possam afectar os resultados, então as células são privadas de soro para garantir que todos os efeitos hormonais foram reduzidas a um mínimo. Assim, aquando do tratamento com E2, existe mais certeza de que os efeitos observados são E2-associado. Um fator importante é a confluência das células, o que influencia contato e comportamentos, como sinalização e proliferação de células célula-célula. As células foram deixadas a 80% confluentes (Figura 3A) e bem ligada para permitir o crescimento e evitar a perda de células durante a subsequente lavagem e meios de change. As condições durante a extracção de ARN e de armazenamento são importantes para a qualidade do ARN e a análise subsequente. Sabe-se também que o número de células, o método de extracção, e o teor de GC da miARN pode afectar o rendimento e qualidade dos dois mRNAs e miRNAs 17. Assim, é necessário realizar a extracção de ARN em condições livres de RNase e para verificar a qualidade do ARN antes de continuar com as experiências. Após a extracção, a quantificação do ARN fornece informação sobre a concentração de RNA total (contendo ambos os ARNm e miRNAs), que permite a observação de rendimento. Ele também fornece uma representação gráfica dos resultados, como visto na Figura 3B, e isto permite a observação da pureza da amostra (normalmente indicado por um pico, painel superior). Pobre rendimento de RNA não produziria nenhum absorção específica a 260 nm (Figura 3B, painel inferior). Para determinar se o ARN é de alta qualidade, o ARNintegridade foi medido. Um número de integridade do RNA (NIR) de entre 9-10 garante que o ARN não é degradado e é de qualidade óptima. Além disso, a representação gráfica da ARN deve ser observada, e o 18S e 28S rRNA deve ter picos, como mostrado na Figura 4 (painel do meio). Comparação com a escada de mão (Figura 4, painel superior) identifica o tamanho dos picos. Um RNA degradado teria picos menos claras e de uma quantidade relativamente reduzida de 18S e 28S rRNA (Figura 4, painel inferior). A fração de pequenos RNAs pode ainda ser assegurada usando o Agilent RNA pequeno Kit. Recomenda-se para validar resposta de estrogénio após o tratamento, de acordo com as condições experimentais especificadas, antes de se proceder ao rastreio miARN. Um qPCR pode ser realizada em um gene alvo conhecido como ER pS2 SPINK4 ou 18, utilizando um molde de ADNc. Estes genes são normalmente regulados positivamente dentro de 1-24 horas após o tratamento com E2. Uma vez que a qualidade do RNA e a resposta de estrogéniofoi avaliada, outra experiência pode ser conduzida. Microarray ainda é uma técnica amplamente utilizada para o rastreio em larga escala para a expressão em células de miARN. Por exemplo, o microarray miRNA uma vez utilizada continha 894 miRNAs maduros e 50 controles sondas únicas no quadrigêmeos 1. As hibridações foram realizadas em duplicados com permuta de corantes procedimento. Os resultados de microarray miRNA são geralmente representados graficamente por mapas de calor. Figura 5A mostra um mapa de calor, que representa os dados a partir de uma comparação de microarray miARN entre o veículo e E2 amostras tratadas. O vermelho indica que a miARN é regulada na amostra tratada com E2 (expressão superior), enquanto o verde indica a regulação negativa da miARN (menor expressão). A selecção miARN geralmente depende da sua importância na expressão, e geralmente um valor de p menor que 0,05 é considerado significativo. Os miRNAs que são indicados para serem diferencialmente expressos devem ser mais validada wom qPCR, para distingui-los dos falsos positivos. A matriz DLP-LDA, por outro lado, utiliza um método baseado em qPCR para triagem de miRNAs regulamentados em um formato de 384 poços. Normalmente, duas placas de 384 poços (placas) são fornecidos, piscinas A e B. Grupo A contém normalmente mais bem caracterizada e mais altamente expresso miRNAs de piscina B. O nível relativo de cada miARN são determinados por qPCR, onde um miARN é analisada por bem (Figura 5B). A Ct-valor mais alto indica menor expressão de miRNA. Muito parecido com o microarray miRNA, os resultados alcançados a partir da DLP-LDA precisam ser mais validado para garantir a precisão. Validações pode ser realizada utilizando qPCR. Aqui, dois métodos de detecção de qPCR são descritos para evitar tendência do método e para permitir a confirmação e investigação de regulamentos miRNA completa. O Cyanine à base de corantes detecção química funciona diferente do que DLP que o profiling DLP-LDA é baseada em, e é apropriado para confirmarfins ation. Ele pode ser menos específico que detecta todos os ADN de cadeia dupla amplificados, mas a homogeneidade da amostra pode ser avaliado através da realização de uma análise de fusão curva Figura 6A. (Painel à esquerda) mostra a análise de fusão da curva de um miARN, e um pico uniforme claramente definida pode ser visto. Vários picos seria observado se o primer é quantidades não específicas ou significativas de cartilha-dímero é formado (Figura 6A, painel direito). Ensaios de DLP miRNA, por outro lado, é mais específica que a amplificação de apenas o alvo é detectado miARN. Parcelas de amplificação de cada um dos alvos miARN pode ser observada, como exemplificado na Figura 6B. A opção de controle para a ocorrência de vários produtos de amplificação utilizando a análise da curva de fusão é, no entanto, não está disponível com esta química e corante Cianina qPCR é menos dispendioso. Tintura Cyanine e DLP qPCR ensaios podem, por vezes, gerado resultados ligeiramente diferentes. Para ambos os ensaios de qPCR, a comparação para um refecia do gene são necessários para determinar a expressão relativa de genes entre duas amostras. O gene de referência, também referido como gene de manutenção, deveria ser um gene cuja expressão não é alterado e que é expressa em níveis semelhantes aos do gene de interesse. Um exemplo de um gene de referência apropriado nestas linhas celulares de cancro da mama é ARHGDIA, um PIB de Rho-dissociação Inibidor que funciona reacções das proteínas Rho taxas de GDP / GTP. Como pode ser observado na Figura 6C (parte superior), o nível de ARNm de ARHGDIA não é alterada entre o veículo e as amostras tratadas com ligando. O ARNr 18S também pode ser usado, embora a sua expressão requer uma alta diluição 1:500 em separado da unidade de cDNA e, portanto, é menos adequada. Para a análise de miRNA, ainda há um debate sobre um gene de referência bem definida. Até agora, o U6 snRNA é um gene de referência que é amplamente aceito para análise de miRNA. U6 snRNA é o, não codificante RNA nuclear pequeno ~ 110 nucleotídeos de comprimento que funciona no nuclear spl pré-mRNAgelo 19. Como pode ser observado na Figura 6C (baixo), os níveis de expressão U6 são praticamente os mesmos em todas as amostras apresentadas, permitindo cálculos dos níveis variáveis ​​de miRNA. Uma representação gráfica de um resultado miARN qPCR para uma comparação entre o veículo e as células tratadas com E2, que foram normalizadas para o U6 referência pode ser observado na Figura 6D. Isto ilustra um miARN que foram detectados como não reguladas após o tratamento 24 horas E2, mas que abriga os sítios de ligação da cromatina de ER perto da sua localização genómica, e análise de séries identificou a regulação significativa 72 horas após o tratamento. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1.jpg" /> Figura 1. Uma visão geral da abordagem empregada para a detecção de regulação hormonal de miRNA em células de câncer de mama. </strong&gt; processo começa com a cultura de células e de tratamento, seguido de larga escala para identificar perfis de miARN miRNAs possivelmente expressos diferencialmente, e termina com validações de qRT-PCR de resultados de matriz. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2.jpg" /> Figura 2. A comparação das várias preparações de amostras e manipulação de ácidos nucleicos para cada técnica de detecção de miARN. (A) microarray miARN usando o método de tecnologia μParaflo inclui enriquecimento, poli-A de rejeito e rotulagem ligadura. (B) a preparação da amostra a tecnologia DLP e método de detecção inclui um cDNA de síntese iniciador anelada que se estende após o passo de desnaturação e proporciona um fragmento mais longo que alberga o preparação de amostras primer e sonda seqüência reversa. (C) a tecnologia dye Cyaninee método de detecção inclui um poli-cauda, ​​e síntese de cDNA com uma iniciadores oligo-dT, incluindo uma sequência 5 &#39;universal. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3.jpg" /> Figura 3. Cultura celular e extração de RNA. (A) Células cultivadas para ilustrar 80% de confluência antes do tratamento necessário com ligando. (B) representação gráfica da concentração de RNA e pureza após a extracção. Cada pico representa um exemplo de um processo de extracção e bem sucedida origina ARN puro (painel superior). A RNA extraído mal não mostra pico de absorção clara a 260 nm (painel inferior). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4.jpg" /> Figura 4. &amp; #160; RNA controle de qualidade Os resultados da análise de integridade de RNA mostrando a representação gráfica para a escada (em cima), um RNA de boa qualidade (meio) e uma amostra de RNA degradado (baixo).. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5.jpg" /> Figura 5. Uma ilustração de miRNA resultados de perfil. (A) A representação mapa de calor de miRNA resultados de microarranjos para miRNAs diferencialmente expressos. miR-A, B, C são regulados positivamente no tratado com amostra de E2, tal como indicado no vermelho, enquanto que o miR-D, E, F, G são reprimidos na amostra tratada com E2, tal como indicado no verde. (B) Amplificação de parcelas para cada miRNA a partir dos resultados DLP-LDA. miARN detectados são amplificadas tal como indicado pelo aumento do valor Rn. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6. análise qPCR de regulamentos miRNA. (A) análise de fusão curva para um miRNA analisados ​​usando detecção corante Cyanine, mostrando homogeneidade de todas as amostras testadas (esquerda) e amplificação de vários fragmentos (direita). (B) parcelas de amplificação para cada amostra para um miRNA. Esta pode ser tanto de corante Cianina DLP ou métodos de detecção. (C) representação em gráfico de barras de genes de referência adequados para análise de ARNm ARHGDIA (topo) e para a análise de miARN ARNnp de U6 (inferior), não apresentando expressão diferencial significativa entre as amostras (D). resultados miRNA qPCR para ilustrar a comparação dos níveis de expressão relativa de miR-135 ao longo de um curso de tempo. Figura 6D é reproduzido a partir Katchy et al. 1 com permissão de Elsevier. Os valores são geralmente a média de exper separadoiments (duplicatas biológicos) ± SD. Teste t de Student, é utilizado para demonstrar significado: * p &lt;0,05.

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Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Molecular sinalização através de estrogênio e microRNAs são fundamentais no desenvolvimento do câncer de mama e de crescimento. O estrogênio ativa os receptores de estrogênio, que são fatores de transcrição. Muitos fatores de transcrição pode regular a expressão de microRNAs e microRNAs regulados por estrogénios podem ser perfilado utilizando diferentes técnicas de larga escala.

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

profiling-of-estrogen-regulated-micrornas-in-breast-cancer-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

20.0K visualizações.  University of Houston.  Molecular sinalização através de estrogênio e microRNAs são fundamentais no desenvolvimento do câncer de mama e de crescimento. O estrogênio ativa os receptores de estrogênio, que são fatores de transcrição. Muitos fatores de transcrição pode regular a expressão de microRNAs e microRNAs regulados por estrogénios podem ser perfilado utilizando diferentes técnicas de larga escala. 

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Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multi-modal de imagem de angiogênese em um modelo de rato nu de Câncer de mama utilizando a ressonância magnética, tomografia computadorizada volumétrica e ultra-som

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Medicina

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Três Culturas dimensionais: Uma ferramenta para o estudo normal Acináceo Arquitetura vs transformação maligna das células de mama

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantificação de cancro da mama invasiva das células usando um modelo (3D) tridimensional

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Profiling Molecular do microambiente do tumor invasivo em um modelo 3-Dimensional de células de câncer colorretal e<em&gt; Ex vivo</em&gt; Os fibroblastos

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In Vivo e Ex Vivo Abordagens para o Estudo do cancro do ovário metastático Colonização de Estruturas Láctea natural em Peritoneal adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

Utilização do ensaio de formação de colónia agar mole para identificar inibidores de tumorigenicidade em células de cancro da mama

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.