Supported by grants from the Department of Defense (W81XWH-09-1-0127), the NIH (2-R01-CA089569), the Elsa U. Pardee Foundation, a Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research Pilot Study Award, and generous philanthropic support from Section of Urology and Section of Research in the Department of Surgery, University of Chicago.

Todos os ratos foram alojados, mantidos e sacrificados de acordo com a Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) orientações e sob a supervisão da Universidade de Chicago animal Resource Center. 1. Os animais que preparam para estudos experimentais <ol><li> Permitir que os animais se adapte à nova habitação e meio ambiente, para se recuperar de potenciais efeitos fisiológicos de transporte e manuseio. Nota: A técnica seguinte é aplicável a todas as estirpes de ratinhos disponíveis comercialmente. O número de animais a serem utilizados para um experimento é dependente do desenho do estudo e deve ser feito com consulta a partir de um estatístico. </li></ol> 2. identificação e isolamento de peritoneais gordos depósitos. <ol><li> Eutanásia animais por sobredosagem de CO 2 e um método físico para confirmar a morte secundária. </li><li> Como depósitos de gordura peritoneal colheita constitui remoção de órgãos internos (método secundário), make uma incisão na linha média próximo da papila inguinal através da parede peritoneal para expor os órgãos internos (Figura 1A). </li><li> Para a gordura omental (OM), exponha o complexo omental / pâncreas através do alargamento do baço a partir da cavidade peritoneal com uma pinça (Figura 1C). Solte omento do pâncreas e baço aparando de perto todas as conexões de tecido. Assegure-se que qualquer tecido pancreático remanescente é excisado 4. </li><li> Para o Fat gonadal (GF), utilize uma pinça para levantar a gordura gonadal que envolve os ovários e impostos especiais de consumo, cortando conexões de tecido (Figura 1A superior righ t) 4. </li><li> Para o Fat uterina (UF), utilize uma pinça para levantar a gordura uterina que envolve os cornos uterinos e impostos especiais de consumo, cortando conexões de tecido (Figura 1A inferior direito) 4. </li><li> Por gordura mesentérica (MF), corte da junção entre o intestino delgado e o piloro. Utilize uma pinça para segurar com firmeza a extremidade livre doo intestino delgado, e lentamente &quot;casca&quot; que distância a partir da gordura mesentérica. Solte a gordura mesentérica a partir da raiz mesentérica usando tesouras de dissecção (Figura 1A inferior esquerdo) 4. </li><li> Para a gordura Splenoportal (SF), levantar a extremidade distal do baço utilizando um fórceps para expor a banda de tecido gordo fina que liga o hilo do baço para o pâncreas. Excisar o splenoportal gordura por primeiro libertando-o do pâncreas, e, em seguida, cuidadosamente dissecando a partir do baço (Figura 1B) 4. </li></ol> 3. Láctea Identificação Ponto Usando Coloração Giemsa <ol><li> Excise omentos (Passo 2.3) a partir de ratinhos C57BL / 6 e fixar em 5% de formalina tamponada neutra a 4 ° C durante 16 horas (S / N). </li><li> Para inclusão em parafina do tecido fixado, escolher um molde que é adequado para o tamanho do tecido. Pour parafina fundida a partir do reservatório de parafina para encher o molde. Abra a gaveta e utilizando quente paraceps, transferir o tecido para dentro do molde. <ol><li> Orientar cuidadosamente os tecidos durante a parafina para produzir cortes longitudinais. Coloque a cassete de tecido marcado através da moldagem e pressione com firmeza no lugar. Permitir que o molde para esfriar por pelo menos 30 min. </li></ol></li><li> Corte cortes seriados (4 mm de espessura) da parafina fixado em formalina incorporado (FFPE) bloco de tecido. Coloque um slide precleaned sob as seções como a fita de tecido sai do bloco de parafina. </li><li> Serially seção inteira do omento; coletar e manchar a cada terceira seção para Giemsa (vide 3.6). Permitir que a lâmina de vidro com as secções para ar seco, de um modo preferido O / N à temperatura ambiente. Lâminas secas estão prontos para fixação. Manchar a primeira seção de hematoxilina e eosina para comparações com lâminas Giemsa manchadas. </li><li> Desparafinar os slides por dois seqüenciais 5 min incubações em xilenos. Rehidratar lâminas por duas incubações sequenciais no seguinte: etanol a 100%, etanol a 95%, e finalmente toque water. <ol><li> Tomar as precauções adequadas para evitar os slides da secagem. Execute todas as etapas na RT. </li></ol></li><li> Imergir completamente as lâminas em um frasco Coplin contendo solução de Giemsa 5% (w / v preparada em água da torneira) e incubar durante 4 minutos à temperatura ambiente. Lavar as lâminas em água da torneira durante 60 segundos, o ar seco e montar com lamela usando a mídia de montagem. </li><li> Imagem lâminas coradas usando um scanner de slides inteira e processo de software com o fabricante. Quantificar o volume mancha leitosa nas seções omentais corados pelo Giemsa usando software ImageJ 4. </li></ol> 4. Propagação e Preparação de células do cancro do ovário para in vivo e ex vivo Estudos <ol><li> Pré-aquecer a 15 ml de meio de crescimento de células a 37 ° C num banho de calor. Preparar um frasco de cultura de tecidos de tamanho adequado (por exemplo, 75 centímetros área de superfície 2) por meio de rotulagem com o nome da linha celular, número de passagens, a data ea pessoa que elaborou o estoque congelado, ea dataea pessoa que está descongelando / plaqueamento das células. Nota: Em estudos de metástase tais informações detalhadas é crucial, como a data de congelamento para baixo e número passagem pode afetar o fenótipo metastático. </li><li> Usando o ambiente estéril do exaustor de segurança biológica, pipeta de 10 ml de meio em frasco de cultura T-75. Remover um frasco de células a partir do sistema de azoto líquido e verificar o rótulo para confirmar o tipo de célula. Descongele apenas um frasco de células em um momento de aquecimento no 37 ° C banho de calor. </li><li> Utilizando uma técnica estéril, pipeta 1x10 6 células descongeladas para o balão de cultura. Colocar o balão na incubadora para permitir que as células para anexar. Agite suavemente o frasco para trás e para formar uma suspensão de células uniforme. <ol><li> Colocar o balão de cultura de tecidos na incubadora e manter a 37 ° C em 5% de CO 2 ambiente. Permitir que as células aderem O / N. </li></ol></li><li> Aspirar media, e substituir por meio de crescimento pré-aquecido fresco. Colocar o balão na incubadora e tudoow células a crescer. Monitorizar o crescimento celular por dia por inspecção visual a cada 2-3 dias utilizando um microscópio invertido. Utilize as técnicas padrão de cultura de células para células de passagem, ao atingir 70-80% de confluência. Nota: Para os ensaios experimentais colher as células a 70% de confluência para assegurar que as células estão a proliferar activamente. </li><li> Aspirar o meio de cultura e lavar com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Aspirar PBS e adicionar 0,25% de tripsina / EDTA (2 a 3 ml de uma área 75 cm2 de superfície) e incubar 5 minutos a 37 ºC. Visualmente confirmar que as células foram destacadas e adicionar um volume igual de meio de crescimento, e suavemente para cima e para baixo pipetar células para se obter uma suspensão de célula única. Nota: É crítico que o meio de crescimento conter soro, uma vez que inactiva a tripsina. Preparar pelo menos 2 a 4 vezes mais células do que o número exigido para uma dada experiência para compensar a perda de células durante as etapas subsequentes </li><li> Determinar a percentagem de células viáveis ​​nasuspensão através de ensaio de exclusão de azul de tripano utilizando um hemocitómetro ou um contador de células automatizado. Nota: aqui, utilizar apenas preparações de células em que ≥ 96% das células são viáveis. </li><li> Transferir a suspensão de células a partir do frasco para um tubo cónico de 50 ml. Células de pelotas por centrifugação 5 min a 1100 xg, a 4 o C. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em PBS até uma concentração de 2x10 6 células por ml. </li></ol> 5. injeção intraperitoneal de Células Nota: Em nossos experimentos, os ratos são tratados de fluxo de ar laminar ou gabinete de biossegurança dentro de nossa unidade de barreira, a fim de limitar o risco de exposição a patógenos, Para demonstrar essa técnica de forma clara, os procedimentos no vídeo que acompanha foram realizados em um laboratório aprovado para o trabalho animal. Esta técnica não exige especial os animais estar sob anestesia. Sob protocolos aprovados, executar esta technique em animais vivos. Use estirpes adequadas de camundongos para o estudo. Por exemplo: usar imunocomprometidos, ratos pelados atímicos para o estudo de células de cancro do ovário humano (SKOV3ip.1, e HeyA8) colonização; usar imunocompetentes camundongos C57BL / 6 para o estudo de rato células de cancro do ovário (ID8) colonização. <ol><li> Carga de 500 ul da suspensão de células individuais dentro da seringa e colocar na agulha estéril tapado 25 G. Isto reduz o cisalhamento de células antes da injecção. </li><li> Escolha o mouse para cima pela nuca do pescoço e segurar o rabo usando a palma eo dedo indicador e fixar a perna esquerda entre o anel eo dedo mínimo (quando o mouse é contido com a mão esquerda). Nota: Para evitar órgãos abdominais traumatizantes, restringir o mouse bem para que ele não pode se mover durante a injecção. </li><li> Imagine uma linha que atravessa abdômen logo acima dos joelhos, e localizar um ponto no lado direito do animal e perto da linha média. O ponto de entrada é craniana e ligeiramente medialdo último bocal. Nota: Inserir a agulha no lado direito do rato evita o ceco e reduz o risco de perfurar o intestino 11. </li><li> Insira a agulha na região lateral inferior do abdómen dos ratos a uma profundidade de aproximadamente 0,5 cm. Puxar para trás o êmbolo para confirmar que a agulha não penetrou num vaso sanguíneo ou outros órgãos peritoneais. <ol><li> Se o fluido é aspirado para descartar a seringa (e amostra) 11. Um aspirado marrom-esverdeada ou amarela indica a penetração da agulha para o intestino ou bexiga, respectivamente. </li></ol></li><li> Injectar a amostra usando, pressão lenta e constante. Retire a agulha e retornar o mouse para sua gaiola. Não reaproveite seringa antes da eliminação em recipiente apropriado. </li><li> Camundongos sacrifício via asfixia com CO2 e remoção de órgãos vitais em momentos específicos após a injecção. </li></ol> 6. Láctea colonização local In vivo <ol><li> Quantitàção de localização de células de cancro de manchas leitosas utilizando citometria de fluxo <ol><li> Isolar depósitos de gordura peritoneais a partir de ratinhos (como descrito no passo 2.3 - 2.7) injectados com células cancerosas com a etiqueta fluorescente e tecidos lugar imediatas em PBS gelado. <ol><li> Para esta técnica particular, peso-match todos os tecidos adiposo gordura para omento. Tecidos de transferência para separar tubos de 5 ml contendo 1,5 ml de DMEM isento de soro e 0,1% (w / v) de albumina de soro bovino. Piscina tecidos colhidos de três ratinhos independentes para assegurar um rendimento suficiente de células para citometria de fluxo. </li></ol></li><li> Tecidos tritura usando tesouras cirúrgicas e adicionar 1,5 ml de DMEM isento de soro contendo 0,4% (w / v) de colagenase I. Incubar a suspensão de tecido a 37 ° C durante 30 min com agitação rotativa. <ol><li> Como passo opcional, ainda dissociar o tecido por mastigação. Neste caso, a transferência da suspensão de tecido-colagenase para um saco microstomacher, mastigar durante 10 min em baixo, girando a orientaçãodos sacos após 5 min. </li></ol></li><li> Amostras filtrar através de um filtro de malha de nylon (60 de poro) para remover os detritos maiores. Recolher as células através de centrifugação a 250 xg durante 5 min a 4 ° C e desprezar a fracção de sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 100 ul de PBS combinado com 900 ul de tampão de lise ACK e incubar à temperatura ambiente durante 1 min. Centrifugar células a 250 xg por 5 min e elimine o sobrenadante. <ol><li> Ressuspender o sedimento celular em 250 ul de PBS gelado. Filtrar as amostras através de uma malha de nylon de 60 um de poro para assegurar suspensão de células individuais. Lavar o filtro com 250 ul de PBS gelado. </li></ol></li><li> Quantificar o número de células marcadas por fluorescência da população utilizando um citómetro de fluxo equipado com um laser de amarelo-verde 561 nm e um / 15 nm, filtro de banda 585 nm. Defina a porta para as células tdTomato-positivos com base na análise de células parentais e / ou controlos negativos adequados 4. </li></ol&gt; </li><li> A quantificação de metástases microscópico e macroscópico <ol><li> No ponto final experimental desejada (s), isolar, e colocar imediatamente tecidos nos meios de fixação apropriados. Fix amostras maiores, tais como gonadal intacta, uterino, e depósitos de gordura mesentéricos em 10% de formalina tamponada neutra para 48 h a 4 ° C. Fix amostras mais pequenas (e gordura omental splenoportal, bem como os equivalentes de tecido uterino e de gordura mesentérica) em 5% de formalina tamponada neutra a 4 ° C durante 2-16 h. <ol><li> Alternativamente, pressão congelar tecidos, colocando-os em um meio de congelamento, como outubro e cair em uma quantidade adequada de nitrogênio líquido. </li></ol></li><li> Transferência de tecidos para armazenamento de etanol e 70% fixado a 4 ° C até ser embutido em parafina. Incorporar e tecido processo como descrito em 3.2 e 3.3. <ol><li> Utilizar a secção corada com H &amp; E para avaliar os tecidos quanto à presença ou ausência de metástases microscópicos (isto é, conjuntos de 50 células). Confirme tele presença de metástases microscópicas por um método secundário, como uma mancha de IHC para cytokeratin 18/8 para detectar células de câncer de ovário. </li></ol></li></ol></li></ol> 7. Láctea Mancha Colonização Ex Vivo <ol><li> Estabelecimento de ex vivo de órgãos omental condições básicas de cultura <ol><li> Colocar cada omento numa única pastilha e placa de cultura lugar dentro de um poço de uma placa de cultura de tecido de doze poços contendo 500 uL de DME meio / F12 contendo 20% de FCS. Manter culturas de órgãos a 37 ° C em ambiente de CO2 a 5% durante 24 a 48 h e / ou pontos de tempo adicionais. Use três omentos independente (amostras em triplicado) para cada condição (por exemplo, tipo de mídia / ponto de tempo). </li><li> Para confirmar a integridade dos tecidos nas extremidades experimentais, corrigir e amostras do processo, tal como descrito no Passo 3. Contando saudável contra adipócitos necróticas nas secções H &amp; E podem avaliar a integridade do tecido. Um mínimo de ~ 120 células de5 amostras biológicas é necessário formular uma percentagem de tecido vivo 10 presente. </li><li> Para medir a função do tecido, o local omentos (n = 3) em poços separados de uma placa de 24 poços contendo 500 ul de meios DME / F12 com 20% de FCS. Permitir omentos para condicionar os meios de comunicação a 37 ° C em ambiente de CO2 a 5% durante 24 h, e depois remover 250 ul para uso num ensaio ELISA de IL-6 10. </li></ol></li><li> Ex vivo de co-cultura do omento rato com células SKOV3ip.1-GFP <ol><li> Crescer e preparar células fluorescente tag como descrito na seção 4 e ressuspender a uma concentração de 2 x 10 6 células por ml. </li><li> Aplicar ~ 6 ul de o adesivo de tecido para a membrana da lâmina de cultura e permitir que o ar seco. Lava-se a membrana duas vezes com água esterilizada para remover qualquer excesso de adesivo. Air secar as membranas sob uma capa laminar. </li><li> Extirpar cuidadosamente o omentos e anexá-lo ao memb revestida com adesivorane usando uma pinça estéril. Permitir que o tecido de aderir à membrana durante 1 min antes de se adicionar meios de comunicação. Adicionar 500 ul da suspensão de células no topo de cada omento em cada inserção de cultura. Preencher a área em torno da câmara de Transwell com 2,5 ml de meio DME / F-12 10. </li><li> Incubar omentos com suspensão de células durante 6 horas a 37 ° C em ambiente de CO2 a 5%. Cuidadosamente remover e lavar o omentos com ~ 10 ml de PBS. Visualize focos de células de câncer fluorescente usando um sistema de imagem fluorescente apropriado 10. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

O desenvolvimento de terapias para direccionar células disseminadas requer uma compreensão mecanicista da colonização metastático, o primeiro passo crítico no desenvolvimento da doença peritonial. Para tratar dessas questões que relatamos abordagens que podem ser usadas para discernir como composição do tecido exclusivo do omento e arquitetura promover o cancro do ovário colonização metastática. Características distintivas da nossa abordagem são: 1) o foco em eventos precoces no processo de colo...

Ao contrário da maioria de tumores sólidos, as metástases de cancro do ovário seroso de alto grau (HGSC) estão limitados a cavidade peritoneal 1. Assim, as terapias eficazes peritoneal poderia controlar ou erradicar HGSC. Atualmente, uma abordagem terapêutica padrão é citorredução cirúrgica combinada com quimioterapia 1-3. Infelizmente, a grande maioria dos pacientes experimentam e sucumbir a complicações de recorrência da doença. Estas estatísticas sombrias mostram a necessidade de uma melhor compreensão da colonização metastática, o processo pelo qual as células cancerosas para localizar, utilizar e proliferar dentro de tecidos do hospedeiro para formar metástases 2. O omento é um site de início preferido de HGSC metástase 4-7. Ao contrário de outros peritoneal adiposo, o tecido adiposo omental contém estruturas invulgares imunes conhecidas como manchas leitosas, que contêm B, T, e células NK e macrófagos, os quais desempenham papéis fundamentais na homeos peritoneaistasis 8,9. Além de suas funções fisiológicas, descobrimos que manchas esbranquiçadas desempenhar um papel ativo no câncer de ovário colonização metastática 4. Em ensaios de metástases experimentais, SKOV3ip.1, CaOV3, e HeyA8 (humano) e ID8 (murino; C57BL / 6) células de câncer de ovário rapidamente de casa para manchas esbranquiçadas, sugerindo que as células estão se movendo em direção a um factor quimiotáctico segregado. Curiosamente, as células cancerosas não colonizar adiposo peritoneal sem manchas esbranquiçadas (ou seja, gonadal e gordura uterino) 4. A fim de identificar os mecanismos que regulam a colonização mancha leitosa, que têm modelos de xenoenxerto optimizado que permitem a interrogação de eventos celulares e moleculares ao longo do curso tempo da colonização metastático 4. Uma vantagem específica das abordagens aqui descritas é sua ênfase na arquitetura e função do tecido, o que permite aos usuários para testar hipóteses em totalmente integrado in vivo e ex vivo modelos de m4,10 colonização etastatic. Ao comparar a localização de células de câncer e crescimento em depósitos de gordura peritoneal que quer contenham ou não possuem manchas esbranquiçadas, os pesquisadores podem testar a contribuição relativa (s) de adipócitos e células dentro de manchas esbranquiçadas à apresentação e progressivo crescimento de células de câncer de ovário em tecidos fisiologicamente relevantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection Tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geimsa</td>
			<td>Fluka/Sigma Aldrich</td>
			<td>48900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Without calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stomacher</td>
			<td>Seward Labsystems</td>
			<td>Stomacher 80 Biomaster</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microstomacher bag</td>
			<td>Stomacher Lab Systems</td>
			<td>BA6040/Micro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture plate insert</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer metastatic colonization of milky spot structures in peritoneal adipose

Alto grau de câncer de ovário seroso (HGSC), a causa de metástases peritoniais generalizados, continua a ter um prognóstico extremamente pobre; menos do que 30% das mulheres estão vivos 5 anos após o diagnóstico. O omento é um local preferido de formação de metástases HGSC. Apesar da importância clínica desta microambiente, a contribuição de tecido adiposo omental a progressão do câncer de ovário foram pouco estudados. Adiposo omental é incomum, pois contém estruturas conhecidas como manchas esbranquiçadas, que são compostos de B, T e células NK, macrófagos e células progenitoras que cercam ninhos densas da vasculatura. Manchas leitosas desempenham um papel fundamental nas funções fisiológicas do omento, que são necessários para a homeostase peritoneal. Nós mostramos que manchas esbranquiçadas também promover o cancro do ovário de colonização metastática adiposo peritoneal, um passo fundamental para o desenvolvimento de metástases peritoniais. Aqui nós descrevemos as abordagens que desenvolvemos para avaliar e quantificar manchas esbranquiçadas em poritoneal adiposo e estudar a sua contribuição funcional para células de cancro do ovário metastático colonização de tecidos omental tanto in vivo como ex vivo. Estas abordagens são generalizáveis ​​a obter modelos de ratinho e linhas celulares, permitindo, assim, o estudo da formação de metástases do cancro do ovário de localização inicial de células de estruturas local leitoso para o desenvolvimento de metástases generalizadas peritoneais.

Identificação e histológica Exame de Peritoneal Fat Depots A dissecção anátomo bruta permite a identificação de quatro das cinco fontes primárias de gordura peritoneal (Figura 1A). Movendo no sentido horário a partir do topo centro são: o omento (OM; delineado) localizado sobre o estômago e baço, a gordura gonadal (GF) em torno do ovário esquerdo (ov), a gordura uterino (UF) ligado às cornos uterinos (uh) e o mesentério (MEU), fixada no intes...

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In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In Vivo e Ex Vivo Abordagens para o Estudo do cancro do ovário metastático Colonização de Estruturas Láctea natural em Peritoneal adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

in-vivo-ex-vivo-approaches-to-study-ovarian-cancer-metastatic

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In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

Cancer

SCIENTISTS IN ACTION

12.9K visualizações.  The University of Chicago. We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

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Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex Infecção Vivo de tecido vivo com Vírus Oncolíticos

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Medicina

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Um In Vitro Sistema para Estudo de dormência Tumor ea Mude para o crescimento metastático

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

A Human<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Placa aterosclerótica modelo para estudar Lesão Biologia

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Profiling Molecular do microambiente do tumor invasivo em um modelo 3-Dimensional de células de câncer colorretal e<em&gt; Ex vivo</em&gt; Os fibroblastos

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudar a ação do hormônio no peito humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Validação de nanocorpo e Antibody Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Experimentos Tumor Xenoenxerto NIRF-imagem em ratos usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Citometria de fluxo e microscopia

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

Dupuytren Humano do<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para o Estudo da Miofibroblastos e Matriz Extracelular Interações

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetria Intrauterine medir Rato contrátil Pressão<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...