Os autores agradecem a Bofan Wu e Christian Raithel de assistência técnica e Rieger Michael para a sua introdução para live-célula de imagem. Apoiado pelo NCI, RO1CA112176 NIH (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), Departamento de Defesa W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU programa (World Class University), através da Fundação de Pesquisa Nacional da Coreia, financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (R31-10069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Roedor Equipamentos Facilidade Barreira), e NIH NCI 5P30CA051008 (Microscopia e Imagem e Animal Recursos Compartilhados).

<html> 1. Esquema geral <ol><li> Gerar culturas primárias de células epiteliais mamarias pré-neoplásicas de glândulas mamárias de engenharia genética e de controlar a ratinhos de tipo selvagem. </li><li> Capturar imagens ao vivo de células a cada 15 minutos utilizando Volocity software de aquisição de imagem (versão 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) para um máximo de 5 dias. </li><li> Ver lapso de tempo imagens diretamente para avaliar tempo e mecanismo de formação das células epiteliais colônia, a incidência de apoptose, e faseamento de alterações morfológicas. </li><li> Converta pilhas Volocity gerado. TIFF. Arquivos JPG usando MetaMorph Automação Microscopia e Software Image Analysis (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) e renomear arquivos de imagem digital (Rename 2.1.6, <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get / / Sistema de gerenciamento de arquivos / A-Rename.shtml</a> ) para permitir a compatibilidade com software Timm ferramenta de rastreamento (TTT,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html). </li><li> Usando TTT, gerar mapas de células destino para determinação do tempo entre as divisões celulares (tempo de vida das células) e os padrões de divisão celular (simétrica em relação assimétrica). </li><li> Analisar os dados quantitativos das etapas 3 e 5 para determinar se existem diferenças estatisticamente significativas entre os diferentes modelos de ratos geneticamente modificados e / ou tipo selvagem controles. </li></ol> 2. Geração de primárias culturas de células epiteliais mamárias <ol><li> Preparar meio completo para o isolamento de células epiteliais mamarias individuais após uma variação de instruções do fabricante (EpiCult-B Rato Médio Kit, Stemcell Technologies, Vancouver, BC). Combinar 450 mL de meio Epi-Cult-B, 50 ml Epi-B Cult suplemento proliferação, 5% de soro fetal bovino (FBS), 50 ug / ml de Penicilina / Estreptomicina (PenStrep) e 10 ng / ml de factor de crescimento epidérmico (EGF). </li><li> Prepare Dissociação dos meios por combinação de 1 parte de uma mistura de colagenase / hialuronidase 10x com 9 partes de meio completo a partir de 2.1. </li><li> Euthanize mouse e imediatamente proceder a autópsia. Lugar do mouse em suas costas em uma plataforma de necropsia isopor e proteger todos os quatro membros para pele ventral é tenso. Saturar a pele ventral e do cabelo, incluindo a que recobre as extremidades, com etanol a 70%. Expor # 2/3 (torácica) e # 4/5 (inguinal) glândulas mamárias, fazendo uma incisão na linha média através da pele (não inserir o peritoneu), que é estendido para um Y-incisão através da pele medial de cada membro dianteiro e uma cabeça para baixo incisão através da pele Y medial de cada membro posterior. </li><li> Usando dissecção romba, separar a pele do underlyingperitoneum, puxe ambos os lados da pele até que é tenso, e fixá-lo para a plataforma de necropsia isopor usando pinos. A partir do lado exterior, utilize dissecção romba com o uso judicioso de Dissection tesoura para isolar o inguinal intacta e / ou torácica glândulas mamárias de tecido conjuntivo subjacente e muscular. Coloque no máximo duas glândulas mamárias em uma placa de Petri 10 centímetros estéril e passar para a capa de cultura de tecidos. </li><li> Na capa de cultura de tecido, examinar as glândulas mamárias para os gânglios linfáticos que são identificadas como de pequeno porte, bem circunscritos nódulos com uma cor amarelada. Remover os linfonodos da glândula circundante usando bisturi e pinças esterilizadas. Picar tecido mamário em ~ 1 mm 3 cubos usando dois bisturis estéreis, uma em cada mão. </li><li> Lugar picada tecido mamário em 5 ml de dissociação Media, misturar suavemente pipetando para cima e para baixo 2-3 vezes utilizando uma pipeta de 10 ml, e incuba-se durante a noite (até ~ 16 horas) numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 numa 50 tubo ml com tampa solta. </li><li> Na manhã seguinte, preparar uma mistura fria de solução de 1 parte de Hanks Balanced Salt (HBSS) contendo 2% de FBS e 4 partes de solução de cloreto de amónio tamponado para promover vermelho blood lise celular (HFAmCl), bem como HBSS frio suplementado com FBS 2% (IC). Pré-aquecido Tripsina-EDTA (0,25%), 5 mg / ml em solução Dispase Salina Equilibrada de Hank Modificado, 1 mg / ml de DNase I, e meio completo. </li><li> Remover o tubo de centrifugação cónico com o tecido mamário da incubadora e suavemente pulsar vortex 2-3 segundos duas vezes. Centrifuga-se o tubo a 450 x g durante 5 min (temperatura ambiente ou a 4 ° C), e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em um mínimo de 10 HFAmCl ml e centrifugar a 450 xg durante 5 min (temperatura ambiente ou a 4 ° C) e eliminar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 3 ml de tripsina-EDTA para o pelete e misturar em primeiro lugar com uma pipeta de 5 ml e, em seguida, com uma micropipeta P1000 até fibroso (min 1-3). Adicionam-se 10 ml de HF, de centrifugação a 450 x g durante 5 min (temperatura ambiente ou a 4 ° C) e descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 2 ml da solução 5 mg / ml e Dispase 200 ul de 1 mg / ml de DNase I do pellet e misture com uma micropipeta P1000 durante 1 min. Amostra deve ser cloUdy mas não pegajoso. Se pegajoso, adicionar 100 ul de DNase I e misturar novamente. </li><li> Adicionam-se 10 ml de HF a frio, a tensão através de um filtro de células 40 um e centrifugar a 450 xg durante 5 min (temperatura ambiente ou a 4 ° C) e eliminar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento final em mídia completo. Quantificar o número total de células (utilizando um hemocitómetro ou Coulter Counter). Duas glândulas mamárias produzir cerca de 1 x 10 6 a 1 x 10 7 células. Placa primárias de células epiteliais de um plano de fundo da placa de 6 poços a uma densidade de 1,5 x 10 5 células por poço. </li></ol> 3. Live-célula de imagem <ol><li> Imediatamente após o plaqueamento das células, colocar a placa de 6 poços com segurança sobre uma platina do microscópio dentro de um 5% de CO 2 / saturado humidity/37 ° C câmara de incubação de temperatura. Ajustar o condensador por Kohler iluminação e do centro dos anéis de fase. Para as experiências apresentadas aqui, uma invertida Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Spinning Disc Confocalsistema de microscópio de campo amplo modo de contraste de fase com uma lente objectiva de 10x foi usado. </li><li> Software de aquisição de imagem aberta, criar e nomear uma biblioteca para as imagens de lapso de tempo, e salvar em um local com espaço suficiente para arquivos grandes. As experiências apresentadas aqui utilizado Volocity software de aquisição de imagem (versão 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA). </li><li> Permitir que a placa se equilibrar no microscópio incubadora durante um mínimo de 15 min. Abaixe as lentes para evitar fase lente-interferência. Sob o &quot;Palco&quot; título, selecione &quot;Calibrar Estágio&quot;. Readquirir o plano focal conjunto, Z = zero nos pontos x, y, z guia e marca de imagem, selecionando &quot;Adicionar ponto&quot; sob o &quot;Stage&quot; de título. Pontos lugar no meio de cada poço da placa de 6 poços para imagens de contraste de fase como de imagem pode ser distorcida, perto da periferia de poços de plástico. Organizar pontos em uma praça em 4 x 4 campos (650 um x 700 campos mm), cada um com uma pequena sobreposição (cerca de 5%). Guardar os pontos selecionados em &quot;Stage. &quot; </li><li> Em &quot;Palco&quot; selecione &quot;Make mapa foco&quot; e siga as instruções para definir o foco de cada ponto. Definir tempo de aquisição de imagem para capturar imagens 4 por hora (a cada 15 minutos). Isto pode ser ajustado de acordo com os requisitos da experiência específica. Salvar o mapa foco em &quot;Palco&quot;. </li><li> Botão direito do mouse no lado direito da ferramenta bar &quot;Aquisição de Imagem&quot; e salvar as configurações de imagem. Pressione o botão de gravação para iniciar a imagem. Depois de 1 hora, verifique o foco das imagens para ver se algum ajuste é necessário. </li><li> Monitorar e continuar imagem ao vivo, durante 5 dias, que termina quando as células se tornam confluentes. </li></ol> 4. A visualização direta dos lapso de tempo imagens para avaliar Timing e mecanismo de formação da colônia de células epiteliais inicial, a incidência de apoptose, e retirada de alterações morfológicas <ol><li> A visualização direta dos lapso de tempo imagens podem ser realizando utilizando qualquer software de visualização de vídeo compatível (por exemplo, <a href="http://www.real.com/" target="_blank">http:</a>/ / Www.real.com/ realplayer ou software freeware ou disponíveis comercialmente outro). As imagens podem ser vistas em. Formato TIFF nesta etapa ou após a conversão para. Arquivos JPG (ver Passo 5). </li><li> Para determinar mecanismo de formação da colônia inicial, começar com uma única pilha-imagem representando um site de imagens sobre a placa. Em quadros inicial, as células irão ser flutuante. Siga imagens seriais para determinar quando a primeira célula epitelial adere à placa. Neste passo, as células epiteliais podem ser identificada e diferenciada de fibroblastos por sua morfologia cubóide mais. Siga esta única célula epitelial através de imagens em série e seguir seu destino sobre o 24 hora subseqüente. Gravar se torna-se rodeada por outras células epiteliais ou submetido a divisão celular ou a apoptose. Se rodeada por células epiteliais, o mecanismo de formação de colónias pode ser determinada directamente através da visualização se as células vizinhas são derivadas de células flutuantes, que, em seguida, dos agregados com a célula inicial aderente (s) oua partir da divisão da célula inicial aderente. Anote o número de colônias formadas por agregação de células versus divisão celular durante a primeira hora 24. </li><li> Para determinar o número de células inicialmente aderentes que sofrem apoptose, durante um período de tempo específico, siga imagens seriais para o aparecimento de características clássicas de desenvolvimento da apoptose numa célula que tenha sido aderente ( <a href="http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html" target="_blank">http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html</a> ), e o número de células apoptóticas identificados durante a totalidade da duração da imagiologia ou dentro de períodos de tempo específicos registados. </li><li> Ao longo do tempo, as células epiteliais em cultura de alterar a sua morfologia de uma forma cuboidal inicial para um aspecto mais alongado consistente com EMT. Siga imagens de série para determinar o dia / hora após o plaqueamento, quando isso ocorre. </li></ol> 5. Modificação do arquivo de imagem <ol><li&gt; Através do software Volocity, exportar os arquivos de imagem TIFF pilhas. Aqui Automação Microscopia MetaMorph &amp; Software Análise de Imagem (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) foi usado para abrir os arquivos TIFF pilha e eles foram salvos em MetaMorph como individuais. Imagens JPG. </li><li> Renomear as pastas e arquivos de imagem de acordo com os requisitos de software Timm ferramenta de rastreamento Use um programa de freeware como A Rename 2.1.6 ( <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml</a> ) para renomear arquivos em grupos. Criar uma pasta que contém todas as pastas e arquivos do experimento e nomear a pasta (por exemplo, </em&gt; EXPERIMENTNAME). </li><li> Criar uma subpasta para cada ponto / posição onde a cultura foi fotografada. Nomear as subpastas: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. O número da posição deve ter 3 dígitos. Exemplo: 072511RN_p001. Coloque todos os arquivos de imagem de que a posição individual na subpasta. </li><li> Adicionar o instante de tempo (usando 5 dígitos) e número de canal (uma vez que existe apenas um canal de campo claro, utilizar &quot;0&quot;), no final de cada nome de arquivo neste formato: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg </li><li> Gerar um arquivo de log para cada posição, primeiro fazer o download do programa TTTlogfileconverter gratuito no site da FPF. Inicie o programa TTTlogfileconverter e selecione a pasta experimento. Introduzir um intervalo de imagem (em segundos). Para uma foto tirada a cada 15 minutos, entre 900 seg. Em seguida, pressione o botão verde secreto log arquivos. </li></ol> 6. Geração de mapas de celulares destino das células único usando TTT <ol><li> Create uma pasta chamada TTTexport e uma subpasta chamada TTTfiles onde todos os dados de rastreamento de células serão armazenados seguindo as instruções de software TTT </li><li> Inicie o programa de TTT, selecione as iniciais do usuário, e clique em &quot;Continuar&quot;. </li><li> Pressione a tecla &quot;Set NAS&quot;, selecione o usuário criado &quot;TTTexport&quot; pasta e clique em OK. No navegador, selecione uma pasta experimento, selecione uma pasta de posição e pressione &quot;Load posição&quot; botão. </li><li> Definir fator ocular para &quot;10x&quot;. Carregar o número de imagens necessárias (carga de todas as imagens é recomendado pela primeira vez). </li><li> Na janela de edição de célula, selecione &quot;colônia Nova&quot; no menu Arquivo. Na janela de vídeo, prima a &quot;célula Track&quot; ou F2 para começar a acompanhar um celular. </li><li> Identificar uma célula na Movie janela e use o mouse para colocar o cursor sobre a célula. Um círculo com o número de célula deve aparecer após F2 foi clicado. Use a tecla &quot;0&quot; no teclado numérico do teclado para controlar o posicionamento da célula e avançar para a próxima imagem. Mover o cursor para seguir a posição de cada célula em cada frame. Para excluir uma faixa e retornar à imagem anterior pressione &quot;Del&quot; no teclado numérico. Para mover os quadros para a frente sem o acompanhamento da imprensa célula &quot;3&quot;, e para se mover para trás sem o acompanhamento pressione &quot;1&quot; no teclado numérico. </li><li> Para marcar uma divisão celular clique em &quot;Divisão&quot; botão na janela do filme. Para marcar a morte celular, clique no &quot;Cell morte&quot; botão na janela do filme. Uma vez que a divisão ocorreu, as células-filhas podem ser rastreadas no mesmo mapa célula destino com o botão direito sobre o símbolo círculo da célula-filha designado na janela do editor de célula para começar a controlar o modo automaticamente. </li><li> Pressione F10 para salvar a árvore. Cada árvore vai economizar, a saída de dobra designadoer (TTTExport). Para iniciar um mapa novo destino da célula, selecione &quot;nova colônia&quot; sob o &quot;Arquivo&quot; e depois menu &quot;Abrir&quot; na janela do editor Cell. </li><li> Tabular os dados da vida após a coleta de células a partir da guia &quot;Cell dados&quot; na janela do editor Cell. </li></ol> 7. Análises Estatísticas <ol><li> Utilize um teste t de Student (se comparar dois genótipos) ou ANOVA (se comparando&gt; dois genótipos) para determinar se diferenças nos dados paramétricos, tais como o número de colônias de células iniciais, vidas celulares ou horas até o aparecimento de EMT entre os diferentes genótipos são estatisticamente significativo. Frequência apoptótico pode ser comparado como o número / número total de células banhados usando t de Student ou ANOVA-teste ou com o teste de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis, quando calculado como uma percentagem de células aderentes. </li><li> Realizar testes de potência utilizando dados a partir de análises de experimentos iniciais para determinar quantas experimental replica precisa realizados e mapas gerados a partir de células de destino cada repetição para s adequadapoder tatistical usando freeware disponíveis (por exemplo <a href="http://statpages.org/" target="_blank">http://statpages.org/</a> ). Nos experimentos apresentados aqui, as culturas de células derivadas de três ratos por genótipo foram suficientes para determinar se houve diferenças estatisticamente significativas na formação de células colônia e vidas celulares quando específicos modificações genéticas foram feitas. </li></ol>

<ol>
	<li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer.">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li><li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers.">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li><li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+primary+mammary+epithelial+cells+and+transfection+by+viral+and+nonviral+methods.">Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells.">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li><li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium.">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li><li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level.">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li><li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice.">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines.">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Etapas críticas É importante assegurar que as glândulas mamárias são colhidas a partir de ratos da mesma idade para controlar a variabilidade relacionada com a idade no comportamento da célula epitelial mamaria. Quando plaqueamento das células, o mesmo número de células devem ser semeadas em cada poço de cada experimento. As células devem ser relativamente esparsa quando plaqueamento de modo a que as culturas não se tornam confluentes muito rapidamente tornando-se possível seguir v...

Modelos de ratos geneticamente modificados são ferramentas para estudar e entender como diferentes lesões genéticas contribuem para o risco de desenvolver câncer de mama. Por exemplo, ratos geneticamente modificados demonstraram que a combinação de três factores: a perda da mama de comprimento completo cancro 1, o início precoce (BRCA1) gene em células epiteliais mamarias, a proteína p53 do tumor (TP53) da linha germinal haploinsuficiência, e epitelial mamaria célula alvo-regulada alfa do receptor de estrogénio (ERa) resultados de expressão no desenvolvimento de cancro da mama em 100% de BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse vírus do tumor mamário (MMTV) -Cre/p53 -/tetracycline-operator + / ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetraciclina transativador (camundongos rtTA por 12 meses de idade, em comparação com as percentagens mais baixas relatadas em BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - ratos sem ERa sobre-expressão (~ 50 - 60%) e ratos BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre sem TP53 haploinsufência (&lt;5%) 1. Imagiologia de lapso de tempo dinâmico do comportamento de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias revela diferenças no comportamento de células que são menos facilmente apreciados em secções de tecido de estática. Alterações na proliferação e diferenciação são observados nos principais células mamárias de portadores da mutação BRCA1 humanos. 2 Criação de uma única célula suspensões de células epiteliais mamárias primárias do normal e ratos geneticamente modificados são gerados através de dissociação enzimática de ressecado tecido da glândula mamária. 3 Time-lapse as imagens são vistas mecanismo para avaliar e tempo de aparecimento de células colônia e incidência de alterações morfológicas em células incluindo transição epitelial-mesenquimal (EMT) e apoptose. Geração de mapas de destino celular, a quantificação da duração de tempo entre as divisões celulares (tempo de vida das células), e determinação de padrões de divisão celular são facilitadas pela utilização de uma única célula de controlo. TimmFerramenta de Acompanhamento &#39;s (TTT) é um software disponível publicamente usada para gerar mapas de uma única célula destino. A sua utilidade na elucidação dos mecanismos de destino celular foi estabelecida a 4,5 examinar o desenvolvimento normal das células-tronco hematopoiéticas 6-9 e a geração de neurônios 10.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> EpiCult B-Rato Meio Basal </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B Proliferação Rato Suplementos </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td> recombinante fator de crescimento epidérmico humano (rhEGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase / Hialuronidase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td> Scapels descartáveis </td><td> Pena </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Solução salina equilibrada de Hanks </td><td> StemCell Technologies </td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> ACloreto mmonium </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 filtro de células mM </td><td> StemCell Technologies </td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer

Lapso de tempo de imagem pode ser utilizada para comparar o comportamento de culturas primárias células epiteliais mamarias pré-neoplásicas derivadas de diferentes modelos de ratos geneticamente modificados de cancro da mama. Por exemplo, o tempo entre as divisões celulares (tempo de vida das células), os números de células apoptóticas, a evolução de alterações morfológicas, e mecanismo de formação de colónias pode ser quantificada e comparada em células portadoras de lesões genéticas específicas. Primários mamárias culturas de células epiteliais são gerados a partir de glândulas mamarias sem tumor palpável. Glândulas são cuidadosamente ressecada com clara separação de músculo adjacente, os nódulos linfáticos são removidas, e as suspensões de célula única de células epiteliais mamárias enriquecidos são gerados pelo tecido mamário trituração seguida por dissociação enzimática e filtração. Unicelulares suspensões são banhados e colocado diretamente sob um microscópio dentro de uma câmara incubadora para live-célula de imagem. Dezasseis 650 x 700 uM campos uM numa configuração 4x4 de cada well de uma placa de 6 poços são gravadas a cada 15 min, durante 5 dias. Lapso de tempo imagens são examinados diretamente para medir comportamentos celulares que podem incluir mecanismo ea freqüência de formação de colônias de células dentro da 24 hora antes de plaqueamento as células (agregação contra a proliferação de células), a incidência de apoptose, e faseamento de alterações morfológicas. De uma única célula de rastreamento é utilizada para gerar mapas de células destino para a medição de tempos de vida de células individuais e investigação de padrões de divisão celular. Os dados quantitativos foram analisados ​​estatisticamente para determinar as diferenças significativas no comportamento correlacionados com lesões genéticas.

As células epiteliais e de fibroblastos podem ser distinguidos pela morfologia celular. As células epiteliais tem uma forma cuboidal (Figura 1A-B) e formam colónias de células (Figura 1A). Fibroblastos, um tipo de células do estroma, têm uma morfologia alongada (Figura 1C). As células foram reunidas e flutuando no início da imagiologia (Figura 2A-D). Após a ligação à placa plana e tornaram-se demonstrado um aspec...

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Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Lapso de tempo de imagem é utilizado para avaliar o comportamento dos principais pré-neoplásicas células epiteliais mamárias derivados de modelos de ratos geneticamente modificados de risco de câncer de mama para determinar se há correlação entre os parâmetros específicos de comportamento e distintas lesões genéticas.

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

time-lapse-imaging-primary-preneoplastic-mammary-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

11.7K visualizações.  Georgetown University. Lapso de tempo de imagem é utilizado para avaliar o comportamento dos principais pré-neoplásicas células epiteliais mamárias derivados de modelos de ratos geneticamente modificados de risco de câncer de mama para determinar se há correlação entre os parâmetros específicos de comportamento e distintas lesões genéticas.

Vídeo: Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Na imagem de bioluminescência vivo Tumor de mama Dynamics Hipóxia metástase do cancro cerebral em um modelo de rato

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Medicina

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Geração Experimental de Carcinoma Associado fibroblastos (FAC) de Fibroblastos Humanos mamária

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Início do Carcinoma de mama metastático por Segmentação do ductal Epithelium com Adenovírus-Cre: Um Modelo Novel de camundongo transgênico do Câncer de Mama

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Método para obtenção de células do cancro do ovário primárias de amostras sólidas

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Tracking the Mammary Architectural Features and Detecting Breast Cancer with Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of life and survival of breast cancer patients. In this paper a new approach for the detection of breast cancer is described, based on tracking the mammary architectural elements using diffusion tensor imaging (DTI). 
The paper focuses on the scanning protocols and image processing algorithms and software that were designed to fit the diffusion properties of the mammary fibroglandular tissue and its changes during malignant transformation. The final output yields pixel by pixel vector maps that track the architecture of the entire mammary ductal glandular trees and parametric maps of the diffusion tensor coefficients and anisotropy indices. 
The efficiency of the method to detect breast cancer was tested by scanning women volunteers including 68 patients with breast cancer confirmed by histopathology findings. Regions with cancer cells exhibited a marked reduction in the diffusion coefficients and in the maximal anisotropy index as compared to the normal breast tissue, providing an intrinsic contrast for delineating the boundaries of malignant growth. Overall, the sensitivity of the DTI parameters to detect breast cancer was found to be high, particularly in dense breasts, and comparable to the current standard breast MRI method that requires injection of a contrast agent. Thus, this method offers a completely non-invasive, safe and sensitive tool for breast cancer detection.

We describe how to obtain parametric and vector maps of the diffusion tensor of the breast using magnetic resonance imaging. The protocol and final output following imaging processing are tailored for tracking breast architectural features and detecting breast malignancy.

Acompanhando as mamárias elementos arquitectónicos e detecção do câncer de mama com Ressonância Magnética Tensor Difusão de imagens

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.