The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.

NOTA: Todos os procedimentos com animais foram aprovados e realizados em conformidade com as normas de Tel Aviv University Sackler School of Medicine Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). 1. Preparação de meio condicionado <ol><li> Semente de 2 x 10 6 U-87 células MG em uma placa de cultura de 10 centímetros em um volume de 8 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro a 10% de bovino fetal (FBS) e solução de penicilina / estreptomicina / nistatina 1%. </li><li> Incubar as células a 37 ° C; 5% de CO 2 até alcançar a confluência completa em 48 horas. </li><li> Usando uma seringa de 10 ml, retirar todo o meio da placa e filtrar através de um filtro de 0,45 um para um tubo de 15 ml. </li><li> Sem lavagem da placa de células, adicionar 1 ml de solução de tripsina (0,25%) e incuba-se. </li><li> Quando todas as células são separadas, inactivar a tripsina usando pelo menos 5 ml de DMEM suplementado com FBS a 10% e uma contagem de células pré-molde. </li><li<html> &gt; Contar o número de células utilizando um hemocitómetro ou outro dispositivo de contagem de células e calcular o número de células de acordo com o método de contagem utilizado. NOTA: Ele vai ser usado mais tarde, a fim de normalizar a concentração CM. </li><li> Transferir o CM a um balão de fundo redondo de vidro e concentra-se sob alto vácuo evaporador rotativo. A fim de acelerar o processo, aumentar a temperatura do banho para 37 ° C, se desejado. Continue até que o CM atinge uma textura pastosa. </li><li> Ressuspender o CM a partir de cada placa de cultura de 400 ul de solução salina. Ao usar mais de uma placa, use volume equivalente. Por exemplo, para duas placas de cultura, 800 ul usar. Usar cada placa para quatro ratinhos. </li><li> A fim de comparar as linhas celulares diferentes tratamentos ou, ajustar o volume de acordo com a proporção de células recebidas no passo 1.6. Por exemplo, se uma placa de células contém mais 1,5x, adicionar 200 ul de solução salina aos 400 ul de pré-existentes. Este será o CM ajustado </li></ol>title &quot;&gt; 2. ECM-mímica Gel plug inoculação em camundongo <ol><li> Antes de inocular o gel ECM-mímica em ratos, preparar os seguintes materiais: <ol><li> -Factores de crescimento reduzida de gel de ECM-mímica livre de fenol (descongelar durante a noite, um dia antes da experiência, a 4 ° C em gelo). </li><li> Barbeador elétrico. </li><li> A cetamina e xilazina em ordem para anestesiar os ratos. </li><li> Ice-frio 1.000 dicas ul estéreis. </li><li> Ice-frio seringa de 1 ml e 27 agulhas G. </li></ol></li><li> Prepare-se para cada rato de um tubo de 1,5 ml Eppendorf contendo 80 ul ajustados CM e manter em gelo. </li><li> Para cada tubo, adicionar 600 ul de crescimento-factores geladas reduzida gel de ECM-mímica livre de fenol que foi descongelada durante a noite a 4 ° C, em gelo. O gel de ECM-mímica é líquido em 4 ° C e solidifica a temperatura corporal; a fim de evitar que o gel de ECM-mímica de solidificação, usar 1000 dicas ul geladas. Misture cuidadosamente tubos sem formar bolhas e manter em gelo. </li><li> Anestesiar 6 semanas de idade BRatinhos ALB / c usando cetamina (100 mg / kg) e xilazina (12 mg / kg). Confirme anestesia adequada de acordo com o atendimento institucional animais e comissão uso, ou seja, antes do início do experimento. Os animais têm atingido o seu bom plano de anestesia quando eles não respondem mais a uma pitada dedo do pé firme. </li><li> Raspar a área abdominal dos ratos e desinfetar usando uma paramentação / álcool. </li><li> Usar uma solução fria de 1 ml e uma agulha de seringa de 27 G para injectar o conteúdo do tubo Eppendorf subcutaneamente. Realizar a injecção muito lentamente para evitar a formação de bolhas. Uma vez que todo o volume é administrado, não ejetar a agulha durante vários minutos, até que a solidificação ocorre. </li></ol> 3. Avaliação da ECM-mímica Gel plug vascularização com ultra-som NOTA: Esta parte do protocolo exige conhecimento prévio do funcionamento de um sistema de imagens de ultra-som, ou a assistência de um técnico autorizado. <ol><li> Antes de começar, tem a fmateriais e instrumentos imediata epois: <ol><li> Barbeador elétrico. </li><li> Creme depilatório. </li><li> A cetamina e xilazina em ordem para anestesiar os ratos. </li><li> Microbolhas não-alvo. </li><li> Dispositivo de ativação. </li><li> Sistema de imagem dos EUA, incluindo um 55 MHz 708 sonda e uma micromanipulator aquisição 3D. </li></ol></li><li> Medir vascularização dentro das velas de três semanas após a inoculação: NOTA: No modelo animal U-87 à base de MG, três semanas foi encontrado para representar o ponto de tempo ideal para a imagem latente. Sob diferentes configurações, calibre cinética vascularização a partir de alguns dias após a inoculação de plugs. <ol><li> Anestesiar ratos usando cetamina (100 mg / kg) e xilazina (12 mg / kg). Confirme anestesia adequada de acordo com o atendimento institucional animais e comissão uso, ou seja, antes do início do experimento. Os animais têm atingido o seu bom plano de anestesia quando eles não respondem mais a uma pitada dedo do pé firme. </li><li> Raspar aárea abdominal dos ratos e tratar com creme depilatório. </li><li> Fixar os ratinhos passivamente na fase do micro-manipulador. </li><li> Usando uma agulha de 30 a G 1 ml seringa contendo soro fisiológico e, colocar a agulha no interior da veia da cauda, ​​fixar firmemente a agulha e solte a seringa. </li><li> Configurar para a sessão de contraste modo 3D de aquisição de imagem: <ol><li> Pressione &quot;3D&quot; para iniciar a fase do motor 3D e posicionar o transdutor no meio da zona de varrimento desejada. </li><li> Pressione o botão &quot;3D&quot; e insira a distância e passo tamanho da digitalização, clique no botão &quot;Scan&quot;. </li><li> Certifique-se de que toda a ficha foi feita a varredura nos dados de imagem em 3D exibidos. Se não, ajuste o transdutor de modo que toda a ficha é visível na digitalização e repita o passo 3.5.2. </li><li> Pressione &quot;Contraste&quot; e empurre a compensação de ganho de tempo (TGC) controles para a esquerda para escurecer a imagem. </li></ol></li><li> Ative as microbolhas usando um mixer frasco que é designated para a activação de microbolhas durante 45 seg. </li><li> Misturar em uma seringa de 1 mL 50 uL de microbolhas com 50 ul de solução salina. </li><li> Substituir a seringa afrouxada contendo solução salina com uma seringa contendo microbolhas activados. Injectar as microbolhas diluído na veia da cauda dos camundongos, aguarde alguns segundos para que as bolhas de atingir um estado de equilíbrio, e, em seguida, adquirir laço cine 3D com contraste do plugue, usando o motor de aquisição em 3D: <ol><li> Pressione o botão &quot;3D&quot; e selecione &quot;Scan&quot; para adquirir imagens de realce 3D e, em seguida, pressione &quot;Cine Store&quot; para salvar os dados de imagem. </li><li> Pressione o botão &quot;3D&quot; e clique em &quot;Destruir 3D&quot; para destruir as microbolhas. </li><li> Pressione o botão &quot;3D&quot; novamente e selecione &quot;Scan&quot; para adquirir um loop de cine pós-destruição, em seguida, pressione &quot;Cine Store&quot;. </li></ol></li><li> Gerar a sobreposição de quadros de imagem pré e pós-destruição das microbolhas: <ol><li> No &amp;# 8220; Configurações de referência &quot;no lado esquerdo da tela, clique em&quot; Criar de Referência &quot;. </li><li> Pressione &quot;Gestão de Estudo&quot; para abrir o ciclo cine pré-destruição adquirido. </li><li> Clique em &quot;Cine Processo&quot; para gerar a sobreposição contraste verde, em seguida, clique em &quot;carregar em 3D&quot;. </li></ol></li><li> Use o software de imagem dos EUA, a fim de quantificar a imagem 3D, resultando em volume de sangue dentro dos plugues: <ol><li> Pressione &quot;Scan / Freeze&quot; e pressione &quot;Configurações de modo&quot;. </li><li> Clique em &quot;Volume&quot; e selecione &quot;paralelo&quot;. </li><li> Criar um volume 3D do tecido alvo através da segmentação de uma série de contornos. </li><li> Clique em &quot;Finish&quot; para concluir a segmentação. NOTA: O volume do agente de contraste será exibido no lado inferior esquerdo da tela. </li></ol></li><li> No final do procedimento, coloque camundongos em um ambiente acolhedor, limpo, seco e tranquila, longe deoutros animais. Fornecer o calor usando uma almofada disponível comercialmente cirúrgico aquecimento ou uma lâmpada incandescente (50-75 watt), colocado 12-14 centímetros de distância do roedor. Monitorar ratos continuamente até manter a postura ereta e andando normalmente. </li></ol></li></ol> 4. Avaliação de ECM-mímica Gel plug Vasculature Morfologia Usando Fibered confocal Endomicroscopy NOTA: esta parte do protocolo é realizada imediatamente após imaging US e que exige conhecimento prévio de operar o sistema de imagem endomicroscopy confocal desfibrado, ou a assistência de um técnico autorizado. <ol><li> Antes de começar, tem os seguintes materiais e instrumentos prontos: <ol><li> Equipamentos para a cirurgia, como pinças, tesouras e linhas de costura absorvíveis. </li><li> Dextrano FITC-conjugada (70 KDa). </li><li> Soluções de calibração (três tubos, cada um contendo peróxido de hidrogênio, água ou solução fluorescente). </li><li> O sistema de imagem e umasonda adequada para geração de imagens de vasos sanguíneos acordo com o fabricante. </li></ol></li><li> Anestesiar ratos usando cetamina (100 mg / kg) e xilazina (12 mg / kg). </li><li> Administrar iv, através da veia da cauda, ​​a 200 ul de 10 mg / mL de dextrano marcado com FITC. </li><li> Desinfectar a área abdominal usando uma paramentação / álcool e aplique uma pequena incisão de aproximadamente 1 cm da ficha. </li><li> Coloque a sonda endomicroscopy no topo do tampão suavemente, mantendo o bujão intacta. </li><li> Aquisição: <ol><li> Uma vez que a sonda está definido na ficha, pressione &quot;Iniciar a laser&quot;, usando o pedal. A fluorescência deve ser mostrado na tela. </li><li> Adquirir filmes curtos (até 30 segundos) pressionando &#39;Record&#39; no ecrã ou &#39;Select&#39; usando o pedal. </li><li> Entre os filmes, lavar a sonda colocando a ponta em um tubo contendo água. </li><li> Quando terminar, retire a sonda e limpe a ponta com uma ponta de algodão. </li></ol></li><li> Para analisar média vediâmetro SSEL: <ol><li> Clique no ícone &quot;Detectar microvasos&quot; no painel superior para abrir a janela do módulo de detecção de navios. </li><li> Clique em &quot;Preferências&quot; e marcar &quot;o diâmetro dos vasos Mean&quot; na &quot;estatística de interesse&quot; e &quot;Mostrar barras do histograma&quot; no &quot;Modo de exibição&quot;. </li><li> Clique em &quot;Detectar&quot; para exibir as medições selecionadas. </li></ol></li><li> Para analisar a intensidade do sinal fluorescente em áreas adjacentes aos vasos sanguíneos: <ol><li> Clique em &quot;Criar círculo ROI&quot; no painel esquerdo e criar um círculo na área de interesse. </li><li> Clique em &quot;histograma Compute dentro ROI&quot; para calcular os valores relativos a esta região. </li></ol></li></ol> 5. O tratamento pós-procedimento de Ratos <ol><li> No final de cada procedimento de imagem, coloque camundongos em um ambiente acolhedor, limpo, seco e tranquila, longe de outros animais. Fornecer o calor usando um comercialmente-available almofada de aquecimento cirúrgica ou uma lâmpada incandescente (50-75 W), colocado em 12-14 longe de roedor. Monitorar ratos continuamente até manter a postura ereta e andando normalmente. </li><li> Para uma análise mais aprofundada da vascularização &quot;plugs em pontos de tempo adicional, aplicam-se as seguintes condições de recuperação: <ol><li> Suturar a incisão pequena com fios absorvíveis. </li><li> Proporcionar analgesia ratos, tais como buprenorfina (1 mg / kg), por via subcutânea, e de regresso para gaiolas individuais. </li><li> Respeite todos os animais para determinar se a continuação do tratamento analgésico é necessário e re-avaliar diariamente para monitorar e avaliar para a aflição. </li></ol></li><li> No ponto final da experiência, os ratinhos eutanásia por primeiro aplicar isoflurano, seguido por deslocação cervical. </li><li> Se imagens adicionais serão realizadas nas semanas seguintes os passos iniciais de imagem, todos os procedimentos devem ser mantidos tão estéril quanto possível. A paramentação pele deve ser realizada, wa estériltro e algodão estéril pontas devem ser utilizados para limpar a sonda endomicroscopy, e a sonda deve ser desinfectado entre cada animal utilizando água estéril. </li></ol>

<ol>
	<li>Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+SIKVAV+site+of+laminin+in+promotion+of+angiogenesis+and+tumor+growth:+an+in+vivo+Matrigel+model.">Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model.</a> J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).</li><li>Passaniti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+quantitative+method+for+assessing+angiogenesis+and+antiangiogenic+agents+using+reconstituted+basement+membrane,+heparin,+and+fibroblast+growth+factor.">A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor.</a> Lab Invest. 67, 519-528 (1992).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+assays:+a+critical+overview.">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clin Chem. 49, 32-40 (2003).</li><li>Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+estrogen+receptor+gene+prevents+17+beta+estradiol-induced+angiogenesis+in+transgenic+mice.">Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice.</a> Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).</li><li>Adini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+cytometry:+a+novel+method+for+quantifying+angiogenesis+in+vivo.">Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo.</a> J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).</li><li>Matsumura, Y., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+concept+for+macromolecular+therapeutics+in+cancer+chemotherapy:+mechanism+of+tumoritropic+accumulation+of+proteins+and+the+antitumor+agent+smancs.">A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs.</a> Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).</li><li>Lindner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubbles+in+medical+imaging:+current+applications+and+future+directions.">Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).</li><li>Kuliszewski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+endothelial+progenitor+cell+engraftment+using+contrast-enhanced+ultrasound+and+targeted+microbubbles.">Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles.</a> Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).</li><li>Stieger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+assessment+of+angiogenesis+in+a+matrigel+model+in+rats.">Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats.</a> Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).</li><li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent.">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent.</a> Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li><li>Segal, E., Satchi-Fainaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+development+of+polymer+conjugates+as+anti-angiogenic+agents.">Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents.</a> Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).</li><li>Satchi-Fainaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+glioblastoma+cells+generating+dormant+tumors.">Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors.</a> PLoS One. 7, 44395 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Combinando métodos de imagens complementares permite a obtenção de informações sobre os diferentes componentes da angiogênese &#39;microvasos densidade, funcionalidade e morfologia. Carregando CM em tampões de gel ECM-mímica gera um microambiente tumoral, que está separado de outras populações de células, como as células endoteliais, que são recrutados e extravasar para a ficha. Ao realizar, em paralelo, microbolhas de imagem dos EUA com contraste e fibered imaging endomicrosco...

O ensaio de angiogénese bujão matrigel foi descrita pela primeira vez por Kibbey et al., Em 1992, em que foi utilizado para avaliar a estimulação de angiogénese pelo SIKVAV péptido (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) 1. Em contraste com outros ensaios in vivo da angiogénese, como o rato da angiogénese da córnea ou de bico ensaios corioalantóicas de membrana, este ensaio é relativamente fácil de realizar 2. O gel de ECM-mímica injectada pode conter células, pró-angiogénico ou um compostos e / ou factores anti-angiogénicos. Ao avaliar a actividade de um composto anti-angiogénico, o plug normalmente contém uma mistura de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e factor de crescimento de fibroblastos (FGF), e a substância anti-angiogénica pode ser administrada directamente na ficha ou sistemicamente 3, 4. O gel ECM-mímica é injetado por via subcutânea, onde ela se solidifica em poucos minutos. Avaliação do recrutamento dos vasos sanguíneos no tampão resultante é typically realizada por medição dos níveis de hemoglobina dentro do bujão, através da medição do sinal de fluorescência após a injecção de isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com dextrano, por imunocoloração dos cortes histológicos para marcadores específicos de endoteliais ou por células activadas por fluorescência (FACS) 2,5, 6. No entanto, essa avaliação só permite a análise de ponto final e não tem informações sobre a funcionalidade e morfologia dos vasos sanguíneos. Além disso, as medições de volume de plasma, ou por níveis de hemoglobina ou utilizando dextrano-FITC como um indicador, uma vez que pode ser enganadora teor de sangue é afectada pelo tamanho dos vasos sanguíneos e a extensão de poças de sangue. Isto é especialmente importante quando a vasculatura recrutados é caracterizada pela permeabilidade aumentada e retenção (EPR) efeito 7. Nós aqui propor um novo, mais preciso, método de visualização dos vasos sanguíneos recrutados pela combinação de duas modalidades de imagem complementares. Higmicrobolhas h resolução com contraste ultra-som (US), combinados com intravital fibred-confocal endomicroscopy podem fornecer informações não só sobre a densidade dos vasos sanguíneos, mas também na sua morfologia e funcionalidade. Além disso, esta análise pode ser realizada em vários pontos de tempo, permitindo assim a monitorização da cinética da angiogénese. EU é uma modalidade de imagiologia largamente usada, que possui uma elevada resolução espacial para imagiologia de vasos sanguíneos, após administração intravenosa (iv) de injecção de microbolhas que permanecem exclusivamente no compartimento vascular 8-11. As microbolhas são microbolhas cheias de gás que produzem um sinal ecogénico forte quando excitado com um impulso dos Estados Unidos e, portanto, servir como um bom agente de contraste. Imagens 3D do plugue são adquiridos usando o software sistema de imagem dos EUA após a destruição microbolhas. As imagens resultantes são compostos a partir de quadros de imagem de pré e pós-destruição das microbolhas e reflecte a diferença em intensidade da cor no vídeo. Estes overlayedas imagens são exibidas automaticamente pelo software. Por conseguinte, a percentagem de vasos funcionais dentro do bujão pode ser quantificada. Alta resolução fibered endomicroscopy confocal serve como uma modalidade de imagem complementares através de relatórios sobre a morfologia dos vasos sanguíneos. Neste método minimamente invasivo, as imagens são adquiridas após a administração iv de dextrano conjugado com FITC 12. O polímero corantes fluorescentes na corrente sanguínea e, portanto, serve como um &quot;agente de contraste&quot; para os vasos sanguíneos morfologia e fluxo sanguíneo. Além disso, uma vez que o polímero é injectado a uma dimensão de 70 kDa, que pode somente cruzar vasos gotejantes como encontrado na vasculatura tumoral. Isto irá resultar em fundo elevado do dextrano marcado com FITC fora dos vasos sanguíneos. Consequentemente, endomicroscopy confocal fibered pode ser usado para visualizar características típicas do efeito EPR em tumor neovasculature- ampliados, de evacuação, os navios altamente emaranhados, com extremidades cegas. Este modelo de sistema foi descricama na comparação do potencial angiogénico de U-87 MG de glioblastoma humano e o seu clone 13 dormente. Vascularização dentro dos tampões foram avaliados três semanas após a inoculação de gel de ECM-mímica. Foi mostrado que a vascularização dentro tampões contendo CM a partir de U-87 MG de crescimento rápido de células geradoras de tumores foi significativamente aumentada em termos de número, densidade e funcionalidade, quando comparada com a vascularização no interior tampões contendo CM a partir das células geradoras de tumores latentes. Assim, os autores foram capazes de concluir que CM isolado a partir de U-87 MG rápido crescimento células geradoras de tumor contém níveis mais elevados de fatores pró-angiogênicos, em comparação com o CM a partir de células geradoras tumorais inativas. Estes factores de estimular a formação de vasos sanguíneos funcionais que afectam positivamente por todos os passos da cascata angiogénica (ou seja, proliferação, brotamento, migração e finalmente, formação de estruturas tubulares de células endoteliais).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Company</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Catalog number</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Rotary Vacuum Evaporator</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Growth-factors reduced phenol-free Matrigel</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">BD Bioscience</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">FAL356231</td>
			<td style="width:251px;">Thaw overnight, at 40C on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Depilatory cream&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Vevo2100 US imaging system</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">55 MHz 708 probe</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Vevo2100 imaging software</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">VialMix&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DEFINITY Imaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VMIX</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">DEFINITY microbubbles</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DEFINITY Imaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DE4</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Activate for 45 seconds using Vialmix before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">ProFlex MiniO/30 probe</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">70 kD FITC-labeled Dextran</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">46945</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">ImageCell software</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Calibration Kit</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td align="left" height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td align="left">Gibco Life Tecchnologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td align="left" height="37" style="height:37px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td align="left">Biological Industries&#160;</td>
			<td align="left">04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td align="left" height="39" style="height:39px;">Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td align="left">Biological Industries&#160;</td>
			<td align="left">03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring functionality and morphology of vasculature recruited by factors secreted by fast-growing tumor-generating cells

O ensaio de tampão de Matrigel subcutânea em ratinhos é um método de escolha para a avaliação in vivo dos factores de pro- e anti-angiogénicos. Neste método, os factores desejados são introduzidos em gel de ECM que imitam a frio de líquido que, após a injecção subcutânea, solidifica para formar um ambiente que imita o meio cancro. Esta matriz permite a penetração das células hospedeiras, tais como células endoteliais, e portanto, a formação de vasculatura. Aqui propomos um novo ensaio de tampão de Matrigel modificado, que pode ser explorada para ilustrar o potencial angiogénico de um conjunto de factores segregados pelas células cancerosas, por oposição a um factor específico (por exemplo, o bFGF e VEGF) ou agente. A ficha contendo gel ECM-mímica é utilizado para introduzir o host (ou seja, mouse) com um pool de fatores secretados para a CM de células de glioblastoma geradoras de tumor de crescimento rápido. Descrevemos previamente uma extensa comparação do potencial angiogénicoU-87 MG de glioblastoma humano e o seu clone de dormente-derivada, neste sistema modelo, que mostra a angiogénese induzida em células U-87 MG parentais. O CM é preparado pela filtragem media recolhidos a partir de placas de cultura de tecido confluente de qualquer linha celular seguintes 48 horas de incubação. Assim, ele contém apenas factores segregados pelas células, sem as próprias células. Aqui descrita é a combinação de duas modalidades de imagiologia, microbolhas de imagiologia de ultra-sons com contraste e intravital endomicroscopy desfibrado-confocal, para, um em tempo real caracterização precisa da extensão, a morfologia e funcionalidade dos vasos sanguíneos recentemente formados dentro das buchas.

Implantar plugs gel ECM-mímica com CM de rápido crescimento linha de células geradoras de tumor angiogênico U-87 MG, resulta em grande angiogênese. Este vasculatura pode ser amplamente explorado utilizando dois métodos de imagem complementares. Microbubbles imaging US contrastado revela grande recrutamento de vasos sanguíneos funcionais no plugue, ilustrando grande fluxo de sangue dentro de U-87 MG CM plugs carregados, em oposição ao fluxo de sangue indetectável dentro fichas conte...

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Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

Monitoramento Funcionalidade e Morfologia da vasculatura Recrutado por fatores secretados por geradores de Células Tumorais de crescimento rápido

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

monitoring-functionality-morphology-vasculature-recruited-factors

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K visualizações.  Tel Aviv University. We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.). 

Vídeo: Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Biologia

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate that acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network and its anti-correlated sensorimotor/paralimbic network at multiple levels of the brain and that the hemodynamic response is influenced by the psychophysical response.  Physiological monitoring may be performed to explore the peripheral response of the autonomic nerve function. This video describes the studies performed at LI4 (hegu), ST36 (zusanli) and LV3 (taichong), classical acupoints that are commonly used for modulatory and pain-reducing actions. Some issues that require attention in the applications of fMRI to acupuncture investigation are noted.

FMRI and physiological monitoring is used to study the effects of Acupuncture on the central and peripheral nervous systems. Acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network, with great overlap with the default mode network, to modulate neurological activity, possibly related to its autonomic effect in the peripheral nervous system.

Monitoramento Effects Acupuntura em Cérebro Humano por fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

Endocitose em Fígado vivo seguidos de purificação de células do fígado por perfusão de fígado

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

Monitoramento de mudanças na estrutura Equilibrium RNA por &quot;peroxidativo&quot; e &quot;oxidativo&quot; Footprinting Radical Hidroxila

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Atividades de monitoramento quinases e fosfatases através do ciclo celular por raciométrica FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Monitorando a replicação plasmídeo em células vivas de mamíferos longo de múltiplas gerações por microscopia de fluorescência

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

In vivo Reprogramação de células adultas somáticas a pluripotência por superexpressão de Fatores de Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a population always have accumulated mutations that are either detrimental or beneficial for the cell. If the fitness effect of a mutation provides the subpopulation with a strong selective growth advantage, the individuals of this subpopulation may rapidly outcompete and even completely eliminate their immediate fellows. Thus, small genetic changes and selection-driven accumulation of cells that have acquired beneficial mutations may lead to a complete shift of the genotype of a cell population. Here we present a procedure to monitor the rapid clonal expansion and elimination of beneficial and detrimental mutations, respectively, in a bacterial cell population over time by cocultivation of fluorescently labeled individuals of the Gram-positive model bacterium Bacillus subtilis. The method is easy to perform and very illustrative to display intraspecies competition among the individuals in a bacterial cell population.

Bacteria may accumulate either detrimental or beneficial mutations during their lifetime. In a population of cells individuals that have accumulated beneficial mutations may rapidly outcompete their fellows. Here we present a simple procedure to visualize intraspecies competition in a bacterial cell population over time using fluorescently labeled individuals.&#160;

Monitorando a competição de subespécies em uma população de células bacterianas por cocultivação de cepas fluorescentes rotuladas

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...