A infecção pelo HIV causa disfunção imunológica mesmo em indivíduos submetidos à terapia antirretroviral sem vírus detectável. Este método permite o estudo da função monócito que são os principais reguladores da resposta imune. Otimizamos essa técnica para o isolamento, cultura e transfecção de monócitos primários humanos.
Usamos este método para entender os mecanismos moleculares de disfunção imunológica em indivíduos infectados pelo HIV, mas pode ser aplicado a quaisquer outros estudos imunológicos envolvendo monócitos. Se esta é a primeira vez que trabalha com sangue humano, lembre-se de seguir os protocolos adequados de biossegurança e tratar todas as amostras como material possivelmente infeccioso. Depois de coletar 40 mililitros de sangue inteiro humano fresco em quatro tubos de vácuo EDTA mililitros, use técnica estéril para transferir todo o sangue para um único tubo de propileno cônico de 50 mililitros em um armário de biossegurança.
Seguindo as instruções do fabricante a partir de um kit de isolamento de monócitos humanos selecionados, adicione dois mililitros de coquetel de isolamento de monócitos do kit ao tubo de sangue e vórtice as contas magnéticas do kit por 30 segundos. Adicione dois mililitros de contas ao sangue e use uma pipeta sorológica de 25 mililitros para misturar cuidadosamente as contas com o sangue. Após cinco minutos em temperatura ambiente, divida o sangue igualmente entre quatro tubos de 50 mililitros e adicione 30 mililitros de PBS estéreis complementados com um EDTA milimillar em cada tubo.
Misture novamente com uma pipeta sorológica de 25 mililitros de plástico e coloque os tubos em suportes magnéticos. Após 10 minutos, use uma pipeta para elaborar o conteúdo do centro de cada tubo, tomando cuidado para não aspirar mais de um mililitro de glóbulos vermelhos e dispensar o conteúdo do tubo em um dos quatro novos tubos de 50 mililitros. Adicione 500 microliters adicionais das contas magnéticas vórtices a cada tubo e misture suavemente a solução celular.
Coloque os tubos de volta nos suportes magnéticos por cinco minutos antes de transferir cuidadosamente o conteúdo do centro de cada tubo para um dos quatro novos tubos de 50 mililitros. Quando todas as suspensões celulares tiverem sido transferidas, coloque cada novo tubo de 50 mililitros nos suportes de ímã por cinco minutos antes de transferir cuidadosamente o conteúdo do tubo para um terceiro conjunto de quatro novos tubos de 50 mililitros. Em seguida, colete as células por centrifugação e resuspenque todas as quatro pelotas de células em um total de 10 mililitros de PBS estéreis para contar.
Após a contagem, resuspenque os monócitos isolados em uma única vez 10 a sexta células por mililitro de 37 graus Celsius sem soro RPMI 1640 médio suplementado com antibióticos e placa um mililitro de células resuspended em placas de 35 milímetros em um armário de biossegurança. Em seguida, coloque as placas na incubadora de cultura celular por 30 a 60 minutos para permitir que as células aderam às partes inferiores do poço. Para preparar macrófagos com um fenótipo semelhante a M1, adicione 100 microliters de soro bovino fetal contendo 25 nanogramas por mililitro de GM-CSF em cada placa.
Para preparar macrófagos com um fenótipo semelhante a M2, adicione 100 microliters de bovino fetal contendo 50 nanogramas por mililitro de M-CSF em cada placa. Para transfecção monócito com imitações de microRNA, inibidores ou um pequeno RNA interferindo, seguindo o protocolo do fabricante para o kit de transfecção, diluir as RNAs selecionadas no buffer para uma concentração final de 1,83 micromolar em 10 microlitres de mímica diluída ou inibidor por transfecção de uma vez 10 para o volume de quintas células. Para preparar o reagente de transfecção, adicione um microliter do polímero fornecido a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e adicione imediatamente 90 microliters do tampão fornecido pelo kit para obter um total de 91 microliters de reagente por transfecção.
Vórtice o regente por três a cinco segundos e pipeta 90 microliters da solução de transfecção no tubo contendo 10 microliters de RNA diluído. Após uma mistura suave, incubar a solução por 15 minutos à temperatura ambiente antes de adicionar 100 microliters de complexo de transfecção a um poço de células. Após quatro horas a 37 graus Celsius, substitua o meio por três mililitros de meio completo contendo o fator de crescimento adequado.
No sexto dia de cultura, substitua os supernacantes culturais das culturas M1 por três mililitros de médio suplementados com soro bovino fetal, antibióticos, lipopolysacarídeos e gamma interferon e substitua os supernaciantes das culturas M2 por meio suplementado com soro bovino fetal, antibióticos, M-CSF e interleucina-4. Após 24 horas de cultura, lave cada placa de macrófagos ativados duas vezes com PBS fresco por lavagem. Para análises de RNA e proteínas, lise as células anexadas diretamente nas placas para permitir a coleta do conteúdo celular liberado para sua análise.
Para análise citométrica de fluxo, desprende as células com dois milimolalares EDTA em PBS por 10 minutos a 37 graus Celsius antes de raspar suavemente as células das partes inferiores da placa para permitir sua coleta em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro para sua análise. Aqui representamos histogramas de células de controle ativadas por M1 e células derivadas do paciente com níveis aumentados de células ativadas de CD80 e CD83 e M2 com níveis aumentados de CD163 e CD209 em comparação com células T0 não ativadas são mostrados. Curiosamente, CD80 e CD83 pareciam ser mais altamente expressos em células derivadas de controle em comparação com células derivadas do HIV.
A transfecção de monócitos recém-coletados com um microRNA mexido quase infravermelho resulta em uma eficiência superior a 90% de transfecção determinada por citometria de fluxo e microscopia confocal. Além disso, a transfecção não reduz significativamente a viabilidade das células derivadas ou de controle do paciente, independentemente do estágio de maturação celular ou das condições de transfecção. A transfecção resulta em uma efetiva baixa do gene alvo após a transfecção com o pequeno RNA de interferência específica tanto no primeiro dia quanto no quarto dia pós-isolamento.
Além disso, as células transfeccionadas com microRNA imitam um aumento de 48 a 72 vezes na expressão de microRNA sobre células não transtravadas, enquanto todos os controles de transfecção não mostram alterações apreciáveis. O número de células banhadas é fundamental para a sobrevivência. Recomendamos um milhão de células por prato de 35 milímetros.
O revestimento em meio livre de soro também melhorará muito o acessório celular. As células obtidas com este método podem ser tratadas com citocinas ou fatores de crescimento para estudar respostas diferenciais em pacientes de interesse e controles saudáveis.
