Os autores gostariam de agradecer a senhora Meike Schaffrinski para ela sempre excelente assistência técnica durante os últimos anos. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa da Alemanha (DFG), dentro do grupo de investigação conjunto 942 (FOR942) e pelo Programa de Pesquisa da Faculdade de Medicina, Georg-August-Universidade de Göttingen.

1 Preparação de estéril AB Soro Humano <ol><li> Colete 4-5 sacos de plasma fresco congelado (PFC). Armazenar os sacos a -20 ° C até sacos suficientes foram recolhidos. </li><li> Descongelar sacos e incubar durante 30 min a 56 ° C em um banho de água para inactivar o complemento e remover fibrina. </li><li> Desinfectar completamente a parte externa dos sacos e transferir o plasma para tubos de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 3000 xg por 15 minutos à temperatura ambiente para se livrar de precipitados e plaquetas residuais. </li><li> Piscina durante todo o sobrenadante e descartar os pellets. </li><li> As amostras de soro da alíquota em tubos de 15 ml e armazenar a -20 ° C. NOTA: Como alternativa, disponível comercialmente de soro AB humano normal inactivado pelo calor pode ser usado. </li></ol> 2 Isolamento de monócitos Para facilitar o balanceamento da centrífuga, é recomendado para processar duas crostas inflamatórias em paralelo. No entanto, tome care a utilização de materiais diferentes para cada dador e para não misturar as células. No caso de cremes leucocitários não pode ser facilmente obtido, de 400 ml de sangue periférico heparinizado podem ser utilizados em vez disso. <ol><li> Desinfectar cuidadosamente os sacos de plástico contendo os casacos de Buffy e transferir o conteúdo de cada creme leucocitário para dois tubos de 50 ml. </li><li> Para cada buffy coat encher três tubos de 50 ml com 15 ml de solução de Ficoll (1,077 g / ml). O Ficoll deve estar à temperatura ambiente durante a preparação. </li><li> Camada de 30-35 ml de sangue de creme leucocitário no topo da solução de Ficoll para o primeiro gradiente de densidade. Tenha o cuidado de fazer isso devagar e com cuidado, a fim de evitar a mistura de ambas as camadas. </li><li> Centrifugar a 400 x g sem travão, durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Para cada gradiente de recolher o anel branco de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), que está localizado entre as duas fases, com uma pipeta de Pasteur de plástico e transferência para um tubo de 50 ml. </li><li> Encher cada tubo com PBS-EDTA (1 mM) até 40 ml no total. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 10 min sem travão, à temperatura ambiente. </li><li> Sobrenadante aspirado e lave o peletizado de novo com 40 ml de PBS-EDTA (1 mM). </li><li> Para cada conjunto de dadores, as pelotas em 20 ml de RPMI-1640 sem vermelho de fenol + 10% de FCS. </li><li> Preparar a solução de Percoll iso-osmótico do segundo gradiente de densidade: Para misturar dois doadores de 23,13 ml de solução de Percoll (densidade: 1,131 g / ml) num tubo de 50 ml com 1,87 ml de PBS 10 vezes. Em seguida, transferir 23 mL desta solução para um novo tubo de 50 ml e adicionar 27 ml de RPMI-1640 com vermelho de fenol + 10% de FCS para obter uma solução iso-osmótica de Percoll 46%. O Percoll deve estar à temperatura ambiente durante a preparação. </li><li> Para cada transferência de dador 25 ml de solução de Percoll preparada em um tubo de 50 ml e a camada de solução de PBMC preparado em 2.9) na parte superior da solução de Percoll. Tenha o cuidado de fazer isso muito lentamente umd cuidadosamente, ambas as camadas tendem a misture facilmente. Se isso for feito correctamente as duas fases podem distinguir-se, devido à sua diferença de cor. </li><li> Centrifuga-se a 550 x g sem travão, durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Para cada gradiente de recolher o anel branco de monócitos, que está localizado entre as duas fases, com uma pipeta de Pasteur de plástico e transferência para um tubo de 50 ml. </li><li> Encher cada tubo com PBS-EDTA (1 mM) até 50 ml no total. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min sem travão, à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender as pelotas em 20 ml de RPMI-1640 com vermelho de fenol + 10% de FCS. </li></ol> 3. Diferenciação de monócitos para macrófagos <ol><li> Determinar o número de monócitos isolados em uma diluição de 1:10 em azul tripano. Só contam os grandes células, de forma irregular, muitas vezes, que são os monócitos. Não conte as células menores, de formato circular, que são linfócitos. NOTA: números de monócitos não tem que ser determinado com precisão muito porque eles só dão uma dica sobre quantos e quais FEP teflon sacos (pequenos ou grandes) devem ser utilizados para a diferenciação das células. </li><li> Para 1,0-1,5 x 10 8 monócitos de um doador, semear as células em um grande saco de cultura de células FEP teflon. Para cada saco de preparar o meio de cultura consistindo de 174 mL de meio RPMI-1640, 2% de soro AB humano (preparado como na Secção 1), 1% de penicilina / estreptomicina, e 2,5 ng / ml de FEC-M (volume total: 180 ml). <ol><li> Para 3,0-5,0 x 10 7 monócitos de um doador, semear as células em um pequeno saco de cultura de células revestidas de Teflon. Para cada saco de preparar o meio de cultura consistindo de 28,5 mL de meio RPMI-1640, 2% de soro AB humano (preparado como na Secção 1), 1% de penicilina / estreptomicina, e 2,5 ng / ml de FEC-M (volume total: 30 ml). NOTA: Se, por exemplo, 8,0 x 10 7 monócitos são obtidos, recomendamos para semeá-los em twO menor volume de sacos com 4,0 x 10 7 células cada. Em vez de M-CSF, monócitos, alternativamente, podem ser diferenciados com o factor estimulador de colónias de granulócitos macrófagos (GM-CSF) com a mesma concentração (2,5 ng / ml). </li></ol></li><li> Adicionar a suspensão de células (20 ml) para a forma preparada e misturar cuidadosamente. Se dois sacos são preparados a partir de um dador, adicionar 20 mL de meio RPMI-1640 à suspensão de células e em seguida, adicionar metade da suspensão para cada preparação de meio. </li><li> Opcional: Para determinar se a preparação dos monócitos se manteve estéril, rasgar uma gota da suspensão de células numa placa de agar de sangue e incubar durante a noite a 37 ° C. </li><li> Aperte a bainha de um 50 ml PERFUSOR seringa no plugue do saco de cultura de células FEP teflon e preenchê-lo com a suspensão de células preparado. </li><li> Desligue a seringa e empurrar o ar restante para fora do saco. Feche o saco com um cone de fecho. </li><li> Incubar as bolsas durante 6-7 dias a 3776; C com 5% de CO 2. </li></ol> 4. macrófagos Colheita <ol><li> Coloque as Teflon FEP-revestidos sacos de cultura de células com os macrófagos diferenciados em gelo durante pelo menos 1 hora para facilitar a separação das células (uma incubação de até 3 horas é possível). Assegure-se que toda a superfície do saco é coberto com gelo. </li><li> Puxe o saco com pressão mínima de 10x sobre a borda de uma mesa / tabuleiro. </li><li> Desinfectar cuidadosamente a parte exterior do saco e remover o cone de fecho. </li><li> Apertar uma seringa de 50 ml com o tampão do saco, remover a suspensão de células, e transferi-lo para tubos de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente para girar as células. </li><li> Aspirar o sobrenadante e reunir os peletes a partir de um saco, em 10 ml de RPMI-1640 + FCS a 10% no total. </li><li> Determinar o número de células num hemocitómetro (1: 4-1: 10 diluição em azul tripano). Só contam os grandes células redondas. Nota: Após a diferenciação dos macrófagos nos sacos de Teflon FEP-revestidas, pode haver células residuais, por exemplo, linfócitos, dependendo do dador e sobre a qualidade do isolamento de monócitos. </li><li> Para reutilizar os sacos de Teflon FEP-revestidos, lave-se duas vezes com etanol a 70% para remover células residuais. Encha-os com etanol 50 ml 70% e incubar durante a noite. Lavam-se as bolsas 3x com PBS estéril, embrulhá-los em papel de esterilização, e esterilizar em autoclave, utilizando procedimentos padrão. NOTA: Os sacos de cultura de células pode ser reutilizado várias vezes sem perda de rendimentos de macrófagos. No entanto, decidimos descartar os sacos após 10 usa antes de começar a vazar. </li><li> Para subseqüentes macrófagos experimentos de cultura em RPMI-1640 + 10% FCS. Se forem necessárias concentrações mais baixas de soro, a cultura em meio RPMI-1640 com 1% de FCS, também é possível. Semente e células incubar por 3-4 horas. Após este período, notar que os macrófagos aderem à superfície do prato de cultura de células, enquantoquaisquer células contaminantes (isto é, eritrócitos, linfócitos e células dendríticas) ficar em suspensão. Lavar as células, pelo menos, duas vezes com PBS para remover as células não aderentes. </li><li> Para retirar macrófagos cultivados a partir da placa de cultura de células para novas experiências, raspe-os cuidadosamente para fora da superfície. Alternativamente, incubar os pratos durante 20 minutos em gelo, aspirar o meio de cultura, e adicionar tampão de dissociação de células livres de enzima de 1 ml. Após 5 minutos de incubação a 37 ° C, adicionar 4 ml de PBS, e separar as células por pipetagem para cima e para baixo por, pelo menos, 3 minutos. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar, como não existe qualquer conflito de interesses.

Os macrófagos são células efetoras importantes do sistema imune inato e exibir funções importantes na imunomodulação, apresentação de antígenos e homeostase do tecido. Devido à sua notável plasticidade, eles são capazes de responder a estímulos de diferentes com que as alterações de fenótipo. No entanto, até agora um monte de dados sobre macrófagos polarização são obtidas no sistema murino, embora existam relatos que mostram que apenas cerca de 50% dos marcadores de macrófagos de polarização pode ser diretamente traduzido do mouse para humano 16. Por conseguinte, apresenta-se aqui um método para se obter os macrófagos humanos primários, em número e pureza suficiente sem a necessidade de materiais dispendiosos, como por exemplo, contas magnéticas MACS e um dispositivo de elutriação por centrifugação contrafluxo. O nosso método baseia-se no isolamento de monócitos a partir de PBMC e sua subsequente diferenciação em macrófagos em FEP Teflon sacos de cultura de células na presença de baixo concentrations de M-CSF 11-13. Enquanto monócitos representam menos de 5 a 10% dos leucócitos do sangue periférico em seres humanos, com a estimulação são recrutados para locais periféricos onde se diferenciam em macrófagos teciduais residentes ou células dendríticas 17. A citocina de M-CSF é importante para a sobrevivência dos monócitos e dirige a sua diferenciação para macrófagos 18,19. Até agora, as concentrações de FEC-M, que foram escolhidos para a diferenciação de monócitos variaram até 100 ng / ml, contudo, no nosso protocolo que é capaz de obter um número suficiente de macrófagos maduros com uma concentração de M-CSF de apenas 2,5 ng / ml 12 , 20. Além disso, as células são cultivadas em Teflon FEP-revestidos sacos de cultura de células que facilitam o desprendimento dos macrófagos e a sua sementeira subsequente em números de células definidas. Uma vez que os sacos podem ser reutilizados várias vezes, o que diminui ainda mais os custos para o processo de isolamento. Os macrófagos obtidos por este procedimentosão altamente positivo para CD45, CD14, CD11b, CD11c e mostrar a expressão do CD206 receptor de manose que defende uma população de puros, macrófagos maduros 21,22. Especialmente alta expressão de CD14 é típico para macrófagos diferenciados na presença de M-CSF 23. Após sementeira das células, eles exibem uma adesão rápida a superfícies de plástico, com algumas células mostrando uma morfologia fusiforme típico, enquanto que outros apresentam um fenótipo de ovo frito. Isto está de acordo com as observações de outros autores 18,22,24. Foi relatado que a diferenciação de monócitos na presença de M-CSF conduz a macrófagos M2-polarizados 16,25. No entanto, os macrófagos isolados pelo nosso protocolo ainda são capazes de responder a uma grande variedade de estímulos, incluindo a exposição de microvesículas derivadas de células tumorais e de co-cultura com células tumorais 26,27 ou exposição ao LPS aos quais eles reagem com a indução de pró genes inflamatórios tais como IL-1 &amp;# 946 ;, TNFa, Wnt5a, ou várias metaloproteinases da matriz, que são consideradas típicas de macrófagos M1-polarizados 3,5,28. Em conclusão, o isolamento de monócitos por centrifugação em gradiente de densidade dupla e subsequente diferenciação em direcção macrófagos em Teflon FEP-revestidas de cultura de células resulta em sacos de um elevado número de macrófagos, sem a necessidade de procedimentos tecnicamente difíceis ou caros. Os macrófagos obtidos podem ser utilizados para posterior análise que vão desde a ativação clássica através de LPS para a co-cultura com células tumorais.

As células da linhagem monocítica e seus terminalmente diferenciadas derivativos - macrófagos - exibem uma plasticidade impressionante no que diz respeito à sua função biológica, levando ao seu envolvimento em diversos processos tais como desenvolvimento, reparação tecidual e imunidade 1. O último é devido à sua capacidade fagocítica e apresentadora de antígeno que coloca macrófagos no cruzamento entre a resposta imune inata e adaptativa 2. No entanto, a sua capacidade para secretar citocinas, quimiocinas, factores de crescimento, e outras moléculas de sinalização 1, não só aumenta a sua função de imunomoduladores, mas também serve como uma base para as suas funções adicionais. As tentativas para espelhar essas etapas de ativação diversas no contexto de condições mediadas não-microbianos resultaram nas categorias M1 e M2 3. Embora esta classificação não é completo, permite um conhecimento básico da biologia dos macrófagos. Devido a estas capacidades multifacetadas ele vem como nenhuma surpresa que os macrófagos são associados a muitas condições que de alguma forma envolvem remodelação do tecido ou inflamação. Ao lado de seu papel fundamental no reconhecimento e liberação de patógenos invasores 4-6, os macrófagos têm cada vez mais entram em foco na aterosclerose, fibrose, obesidade e câncer de 7-10. Um método reprodutível para a geração de macrófagos humanos é, portanto, crucial para a compreensão dessas patologias. Aqui é apresentado um método com base no isolamento de monócitos humanos a partir de sangue periférico de dadores saudáveis, por uma técnica de dupla centrifugação de gradiente de densidade, tal como descrito previamente 11. De forma a facilitar a diferenciação no sentido macrófagos, as células monocíticas isolados são incubados na presença de baixas concentrações de FEC-M e soro humano normal a 12. Para facilitar ainda mais o manuseamento e a colheita de células, a diferenciação é realizada no gás de FEP permeávelSacos de cultura de células revestidas com teflon com uma superfície hidrofóbica 12-15. Os macrófagos que descansam resultantes podem ser submetidas a uma vasta gama de ensaios uma vez que ainda são capazes de responder a qualquer uma forma M1 ou M2-like. Métodos alternativos de isolamento de monócitos e subsequente diferenciação, tais como células ativadas magnética triagem (MACS) ou em contra-decantação centrífuga (CCE) tem algumas limitações em relação ao rendimento, custo e tempo necessário. O protocolo aqui descrito oferece a vantagem de que pode ser realizada com equipamento de laboratório padrão, sem a necessidade de reagentes especiais (por exemplo, contas magnéticas MACS) ou dispositivos (por exemplo, aparelhos CCE) e permite que o processamento de grandes quantidades de células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibodies for immunophenotyping</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BioLegends</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200M microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein-AM</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>89201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>combi-stopper closing cones</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4495101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td>for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084211000</td>
			<td>prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13151-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll (density 1.077g/ml)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse FITC</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from E.coli</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8274</td>
			<td>final conc: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density 1,131g/ml)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusor syringe 50ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Pasteur Pipettes</td>
			<td>LVL technologies</td>
			<td>2655181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh M-CSF</td>
			<td>ImmunoTools</td>
			<td>11343117</td>
			<td>Resuspend in 500&#181;l sterile H2O (c = 100 ng/&#181;l), aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilization paper</td>
			<td>VP group</td>
			<td>3KFKFS230116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain (0,4% w/v)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, small</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>72-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, large</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>197-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags

Macrófagos humanos estão envolvidos em uma infinidade de processos patológicos que vão desde doenças infecciosas ao câncer. Assim, eles representam uma ferramenta valiosa para compreender os mecanismos subjacentes a estas doenças. Por isso, apresentam um protocolo simples para o isolamento de monócitos humanos a partir de crostas inflamatórias, seguido por um processo de diferenciação, que resulta em rendimentos elevados de macrófagos. A técnica baseia-se principalmente em comumente disponíveis equipamentos de laboratório e, portanto, fornece uma alternativa de custo e tempo efetivo de obter grandes quantidades de macrófagos humanos. Resumidamente, crostas inflamatórias a partir de dadores de sangue saudáveis ​​são submetidas a uma centrifugação de gradiente de densidade dupla para a colheita a partir de monócitos do sangue periférico. Estes monócitos são então cultivadas em fluorados de etileno propileno (FEP) revestido com Teflon sacos de cultura de células na presença de factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF). Os macrófagos diferenciados podem ser facilmente colhidas e usadas para estudos posteriores e funcional quantodiz. Métodos importantes para o controle de qualidade e validação das etapas de isolamento e diferenciação será destacado dentro do protocolo. Em resumo, o protocolo aqui descrito permite aos cientistas rotina e de forma reprodutível isolar macrófagos humanos, sem a necessidade de ferramentas de custo intensivo. Além disso, os modelos de doença pode ser estudado num sistema humano singeneico contornar a utilização de macrófagos de murino.

A primeira centrifugação de gradiente de densidade usando Ficoll produz uma interfase branca contendo as PBMC (Figura 1A), ou seja, os linfócitos e monócitos. Isso pode ser confirmado através de uma coloração May-Gruenwald (Figuras 1B e C) das células coletadas, que mostra tanto um elevado rácio núcleo / citoplasma (típico de linfócitos) e bean- ou núcleos em forma de anel (típica de monócitos). Quando estas células são, então, carregados num gradiente de Percoll utilizando segunda densidade, os monócitos pode ser ainda separado dos linfócitos e novamente aparece como uma interfase branca (Figuras 1E-F). Para cada buffy coat em gradiente de densidade dupla centrifugação descrito rotineiramente produz 150 ± 40 x 10 6 de monócitos, que podem ser diferenciados para 70 ± 30 x 10 6 de macrófagos (Figura 2) por buffy coat. O rendimento médio de macrófagos20 preparações independentes foi de 47 ± 14% do total de monócitos isolados. Após a centrifugação de gradiente de Percoll, ainda pode haver algumas células não monociticas residuais presentes na preparação, que é dependente do dador de sangue, assim como na precisão do processo de isolamento. No entanto, após a fase de diferenciação de 6-7 dias, a preparação é constituído principalmente por macrófagos maduros (Figura 3), que pode ser ainda mais enriquecido, devido à sua aderência a superfícies de plástico, uma característica que não é partilhada por as células contaminantes aleatórios (Figuras 4A e B). Uma vez banhado, a maioria dos macrófagos mostram uma morfologia clássica &quot;ovo frito&quot;, enquanto também existem células com uma esticada fenótipo fusiforme (Figuras 4C e D). Isto reflecte-se a sua distribuição F-actina dentro dos clusters de citoplasma e de adesão. As células diferenciadassão caracterizados pela expressão de CD45, CD14, CD16, CD206 (receptor de manose), CD11b e CD11c, que são marcadores para macrófagos maduros normais (Figura 5). A presença de CD11b argumenta contra uma diferenciação predominantemente dendrítica, que é suportada pelo facto de que as células são negativas para CD209 o marcador de células dendríticas (DC-SIGN). Após o processo de diferenciação, as células permanecem funcionalmente e metabolicamente activa de cerca de 5-7 dias (Figura 6), uma vez que podem ser visualizadas através de calceina AM de coloração e a sua capacidade para assumir vesículas extracelulares derramado a partir de células tumorais. Além disso, as células podem ainda ser activado, como mostrado, por exemplo, para a estimulação com lipopolissacarídeo (LPS), que resulta na expressão de vários genes pró-inflamatórios (Figura 7). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in"src = &quot;/ files / ftp_upload / 51554 / 51554fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1 Aparência e composição do PBMC- e monócitos-camada após a centrifugação de gradiente de densidade dupla. Fotografia que ilustra (A) a banda de PBMC após o gradiente de Ficoll e (D) a-fase de monócitos após a centrifugação de Percoll iso-osmótico. Colorações Maio-Gruenwald de preparações de citospina do (B, C) ​​e a fracção de PBMC remanescentes (E, F), os monócitos. Barra de escala = 200 um em B e E, = 50 um em C e F. <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> Figura 2 Rendimento de monócitos e macrófagos. Contagens celulares representativas dos monócitos e macrófagos isolados de 20 buffy coat preparations. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Micrografias e medições do tamanho das células de monócitos e macrófagos. Microscopia de contraste de fase de suspensão de células monocíticas, antes (A) e após (B) a diferenciação de macrófagos. Correspondendo histogramas do tamanho das células de monócitos (C) e os macrófagos (D). Barra de escala = 100 pm. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4 Morfologia e organização do citoesqueleto de macrófagos aderentes. Microscopia de contraste de fase de macrófagos aderentes antes (A) e após (B) A remoção de não-adherenAs células t. (C, D) faloidina-TRITC coloração de actina filamentosa em macrófagos aderentes, não-estimuladas. Barra de escala = 100 mm em AC, 20 um em D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 Imunofenótipo de macrófagos diferenciados. Análise de citometria de fluxo de macrófagos após 6 dias de diferenciação em Teflon FEP-revestidos sacos de cultura de células (indicado em vermelho). Os controles isotipo correspondentes são mostradas em cinza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 6 Captação de microvesículas de células de tumor por macrófagos. Micrografias de macrófagos aderentes após exposição à microvesículas derivadas de células (vermelho fluorescente) PKH26-tumorais marcadas. As imagens são sobrepostas para o correspondente (A) de campo claro ou (B) coloração citosólica com o corante de viabilidade calceína AM. Barras de escala = 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7 A sobre-regulação de IL-1 β, Wnt5a, TNFa, IL-6, MMP-2, MMP-7, e depois de MT1-MMP estimuladormento de macrófagos com LPS (100 ng / ml) durante 24 horas. expressão de genes foi medido por RT-PCR quantitativa a partir de amostras de ARN total (A) e normalizado em HPRT1 e GNB2L1 expressão. Os valores mostrados são as mudanças de dobragem em comparação com o controlo não tratado (média ± DP, n = 5, * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). TNFa e IL-6 de indução sob estimulação por LPS foram também confirmadas por meio de ELISA (B) (média ± DP, * p &lt;0,05).

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Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

isolation-human-monocytes-double-gradient-centrifugation-their

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

69.3K visualizações.  University Medical Center Göttingen.  Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores. 

Vídeo: Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

A transfecção altamente eficiente de THP-1 por macrófagos humanos Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Imunologia e Infecção

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro A desmontagem do vírus influenza A capsï¿½eos por centrifugação em gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila Outer Membrane vesículas: Isolamento e Análise do seu potencial pró-inflamatórios em macrófagos

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Imagens ao vivo de antifúngicos Atividade por neutrófilos humanos primários e monócitos em resposta à<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where immune cells reside and therefore contribute to mucosal immunity in the intestine. A complete understanding of how M cells differentiate in the intestine as well as the molecular mechanisms of antigen uptake by M cells is lacking. This is because M cells are a rare population of cells in the intestine and because in vitro models for M cells are not robust. The discovery of a self-renewing stem cell culture system of the intestine, termed enteroids, has provided new possibilities for culturing M cells. Enteroids are advantageous over standard cultured cell lines because they can be differentiated into several major cell types found in the intestine, including goblet cells, Paneth cells, enteroendocrine cells and enterocytes. The cytokine RANKL is essential in M cell development, and addition of RANKL and TNF-&#945; to culture media promotes a subset of cells from ileal enteroids to differentiate into M cells. The following protocol describes a method for the differentiation of M cells in a transwell epithelial polarized monolayer system of the intestine using human ileal enteroids. This method can be applied to the study of M cell development and function.

This protocol describes how to induce the differentiation of M cells in human stem cell-derived ileal monolayers and methods to assess their development.

Diferenciação induzida de pilhas de M cell-like em monolayers Enteroid ileal derivado da pilha de haste humana

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. While antiretroviral therapy efficiently lowers systemic viral load and restores normal CD4+ T cell counts, it does not reconstitute a completely functional immune system. A dysfunctional immune system in HIV-infected individuals undergoing cART may be characterized by immune activation, early aging of immune cells, or persistent inflammation. These conditions, along with comorbid factors associated with HIV infection, add complexity to the disease, which cannot be easily reproduced in cellular and animal models. To investigate the molecular events underlying immune dysfunction in these patients, a system to culture and manipulate human primary monocytes in vitro is presented here. Specifically, the protocol allows for the culture and transfection of primary CD14+ monocytes obtained from HIV-infected individuals undergoing cART as well as from HIV-negative controls. The method involves isolation, culture, and transfection of monocytes and monocyte-derived macrophages. While commercially available kits and reagents are employed, the protocol provides important tips and optimized conditions for successful adherence and transfection of monocytes with miRNA mimics and inhibitors as well as with siRNAs.

Presented here is an optimized protocol for isolating, culturing, transfecting, and differentiating human primary monocytes from HIV-infected individuals and healthy controls.

Isolamento, Transfecção e Cultura dos Monócitos Humanos Primários

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...