This work has been funded by the Israel Science Foundation Grant (ISF # 393/12), Israel Centers of Research Excellence Grant (I-CORE 1796/12), German-Israel Foundation Grant (GIF # 2299-2291.1/2011) and the Marie Curie Career Integration Grant (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). Initial steps in the project were funded by an AXA postdoctoral fellowship to AC. We acknowledge the generous startup funds provided by the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences.
Critical reading by members of the Citri lab is greatly appreciated.

NOTA: O protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais da Universidade Hebraica de Jerusalém. 1 Preparação da solução de ACSF <ol><li> Preparar solução ACSF como descrito na Tabela 1. Adicione 1 L de ddH2O (&gt; 18 mohms pureza), para trazer a osmolaridade ~ 300 mOsm / L, com adição apropriada de água ou de NaCl. </li></ol> 2. Equipamentos e sala preparada O equipamento para o monitoramento do comportamento locomotor induzido pela cocaína é composto por câmaras de comportamento (50 x 45 cm) com fio com uma fonte de luz interior, ventilador e uma câmera (ou sensores de infravermelho), e está equipado com uma caixa de perspex interior (30 x 30 cm) em que os ratos estão autorizados a circular livremente enquanto sua locomoção é monitorada. O teste comportamental deve ser realizado entre 1 hora após as luzes acesas para 1 hora antes de as luzes apagadas, em um ciclo claro / escuro regular. Os animais devem ser treinados de forma consistente, ao mesmo tempo cada dia. <ol><li&gt; Conectar câmera ou sistema de infravermelho para um sistema adequado para monitorar e gravar o comportamento locomotor de ratos. </li><li> Limpar as câmaras depois de cada ensaio com desinfectante fornecida pela instalação de rato e / ou remoção de odores de reagentes, a fim de evitar a polarização de sinalização olfactivo e para assegurar a desinfecção adequada. </li></ol> IMPORTANTE: Ao manusear os ratos ficar quieto, calmo e cuidadoso. Preparação 3 Animais <ol><li> Casa 5 C57BL6 camundongos machos (6-12 semanas de idade; ~ 25-35 g de peso) por gaiola, em uma sala com um ciclo claro / escuro de 12 horas e livre acesso a alimentos e água, de acordo com as normas e requisitos de Experimentação Animal Cuidados orientação e protocolos Comitê. Antes de iniciar o experimento, os ratos pesar e registrar os dados. A cocaína é administrada mais tarde de acordo com o peso dos ratos. </li><li> Transferir todas as gaiolas contendo ratos na sala comportamental 30 min antes de começar o primeiro julgamento. </li><li> Habituar todo ocamundongos utilizados no experimento de manipulação do experimentador, injeções e acompanhamento na configuração do comportamento. Isto é conseguido através de injecções intraperitoneais 3 consecutivas diárias de 250 ul de solução salina, como descrito abaixo. </li><li> Administrar uma injeção intraperitoneal de 250 mL de solução salina. Imediatamente após a injeção, coloque o mouse em uma câmara de comportamento para monitorar a atividade locomotora por 15 min. Repita esta ação durante 3 dias consecutivos, na mesma hora todos os dias. </li><li> No quarto dia, dividem os ratos em dois grupos. Prepara-se uma solução estoque de cocaína a 2 mg / ml em solução salina. Administrar uma única injecção de uma solução de cocaína (finais de 20 mg / kg) para o grupo experimental de acordo com o peso do rato (por exemplo, para um rato de 25 g - injectar 250 ul, ao passo que um rato de 30 g irá receber 300 ul). Administrar solução salina ao grupo de controlo. Imediatamente após a injeção, coloque o mouse por 20 minutos em uma câmara de comportamento para o monitoramento da atividade locomotora (Latossoloaliado, os primeiros 15 min são monitorados). </li><li> Após a injecção de cocaína, sacrificar os ratinhos em diferentes pontos de tempo (0, 1, 2, 4, 8 e 24 h após a injecção). Importante, certifique-se que os ratos de referência (0 ponto de tempo) não receberá qualquer injecção neste dia. Devido à sua importância, é imperativo incluir repetições do grupo de referência. </li></ol> 4. Dissecção de núcleo accumbens <ol><li> Anestesiar os ratos com isoflurano, no momento apropriado após a injecção de cocaína / soro fisiológico. O isoflurano deve ser ventilado directamente para fora da sala. Portanto, o procedimento deve ser realizada numa hote química. </li><li> Monitorização da profundidade da anestesia, testando o reflexo do pé traseiro. Aperte a pata para provocar uma resposta de retirada pelo animal. Um animal que mostra um reflexo não está em um nível cirúrgico de anestesia e não em um estado de eutanásia. </li><li> A extracção do cérebro: <ol><li> Eutanásia o mouse por decapitação. </li> &lt;li&gt; Retirar a pele acima do centro do crânio e cortar o crânio com uma tesoura afiada. </li><li> Inserir as tesouras no ponto onde a medula espinal entra no cérebro (forame) e fazer dois cortes laterais. </li><li> A partir do mesmo ponto, fazer um corte sagital longa ao longo da sutura sagital. Ao chegar ao bulbo olfatório, clipe para a esquerda e para a direita. </li><li> Com uma pinça, retire o crânio com cuidado, segurando cada metade do crânio firmemente e puxando para o lado, tomando cuidado para não pressionar sobre ou danificar o cérebro. </li><li> Remover o cérebro enquanto cortando os nervos cranianos, utilizando uma colher de micro invertida espátula. </li></ol></li><li> Inserir o cérebro em solução ACSF gelado durante 1-2 min para refrigerar e endurecer. </li><li> Retirar do cérebro ACSF, pavio excesso de fluido com uma toalha de papel, criar um corte coronal entre o cerebelo e o resto do cérebro e cola no cérebro, com a porção rostral voltado para cima, sobre o palco vibratome. </li><li> Cortar o NAc: <ol&gt; <li> Manter soluções aCSF a temperaturas geladas na câmara de corte do vibratome. Seção em 200 mM até o núcleo accumbens (NAC) é claramente identificado de acordo com o Paxinos e Franklin Rato Atlas Cerebral (aproximadamente 1,8 mm anterior ao bregma; prestar atenção à forma do corpo caloso, a localização ea forma da comissura anterior e os ventrículos, bem como a morfologia global da secção de cérebro). Neste ponto, criar duas secções de 400 um, a partir da qual o NAc serão dissecados. </li><li> De acordo com um estereoscópio, use uma lâmina fina para dissecar a área de NAc fora das fatias. A definição da CNS é de acordo com o atlas do cérebro do rato Paxinos e Franklin, e pode convenientemente ser dissecado em seções apropriadas por quatro passes rápidos da lâmina sobre o tecido. (Figura 2). </li><li> Coloque seções Nac imediatamente em 900 mL de Trizol reagente de lise em um tubo de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C até RNA extração. </li></ol></li></ol> Transcrição 5 Extração de RNA e cDNA Reversa <ol><li> Descongelar os tubos contendo o núcleo accumbens secções em reagente Trizol lise à temperatura ambiente e homogeneizar o lisado com uma seringa de 1 ml ligada a 25 G até a agulha o tecido é completamente homogeneizada (pelo menos 15-20 vezes). As primeiras voltas são difíceis, e requerem que empurra o tecido contra a parede do tubo, de modo a dividi-la em pedaços pequenos que podem entrar na ponta da agulha. </li><li> Para assegurar a homogeneização, pipetar o lisado para uma mini-coluna de spin QIAshredder e centrifugar a 12000 xg durante 1 min. </li><li> Pipete o lisado para um novo tubo de microcentrifugação e extrair o ARN de acordo com as instruções do fabricante. Armazenar o ARN a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Medir a concentração de RNA, analisar a integridade e qualidade usando uma Bioanalyzer ou equipamento equivalente. Use 100-500 ng RNA para cada rodada de preparação cDNA com rAndom primers hexaméricos. </li></ol> 6. Primer Projeto e Testes Primer <ol><li> Escolhendo bons primers: Para um par de primers ideal para qPCR de transcritos de mRNA, siga estes requisitos (Figura 3): <ol><li> Primers projeto já não contendo de 17-28 bases. Evite repetições de nucleotídeos como eles promovem errï¿½ea. </li><li> Iniciadores de design com temperatura de fusão (Tm) entre 56-68 ° C (60-64 ° C de forma óptima). A T m de dentro do par de primers devem estar dentro de 1 ° C, de um ao outro. </li><li> Esteja ciente de que o tamanho do produto deve ser idealmente entre 80 e 150bp. </li><li> Certifique-se de que pelo menos um dos iniciadores inclui uma junção exão-exão, ou o fragmento amplificado contém um grande intrão (intrão-spanning), para evitar a amplificação de contaminantes de ADN genómico. </li><li> Use um software confiável com base em Primer3 (para exemplos, ver Tabela 2), a fim de melhorar o projeto de primer. </li></ol></li><li> Testando o prIMers: A fim de assegurar a especificidade e eficácia dos iniciadores, uma reacção de qPCR de controlo devem ser executadas: <ol><li> Use uma amostra positiva (contendo ADNc molde para todos os pares de iniciadores relevantes) e titula-se o ADNc (por exemplo, oito diluições de três vezes a partir de uma concentração inicial de ~ 10 ng), em reacções paralelas em duplicado. Incluir um controlo sem molde, o qual controla a contaminação dentro das soluções utilizadas para a reacção. </li><li> Calcular a eficiência do iniciador por meio da fórmula: (10 (- 1 / declive) -1) x 100, de tal forma que a curva da inclinação óptima é - 3,333 (isto é, 10 (- 1 / 3,333) = 2) (Figura 4). </li><li> Determinar a especificidade da amplificação. Amplificação específica é demonstrada por um único pico proeminente comum para todas as curvas de fusão dos produtos de amplificação, enquanto que fora da amplificação alvo, apresentado como um desvio óbvio from o único grande pico. </li></ol></li></ol> 7 Análise qPCR <ol><li> Pré-amplificação: <ol><li> Análise abrangente qPCR baseia-se na consulta paralelo de limitar as quantidades de ARN com um grande número de pares de iniciadores. Portanto, um passo de pré-amplificação é essencial. Neste passo, o ADNc é submetido a 14-18 ciclos de pré-amplificação com uma mistura de todos os iniciadores que irão ser utilizados para a consulta da amostra no futuro (até 800 pares de iniciadores). </li><li> Diluir todos os primers em TE (baixo EDTA) a 50 mm para Alvo amplificação específica (STA). </li><li> Piscina juntos alíquotas de 1 ul de tudo do iniciador 50 uM define a ser incluído na reacção STA, até 800 ensaios. </li><li> Preparar uma pré-mistura e as amostras para STA, tal como descrito na Tabela 3. Permitir erro através da preparação de mistura de 110% do número de amostras a serem amplificadas. </li><li> Aliquota de 3,75 mL de STA de pré-mistura para cada amostra. Adicionar 1,25 mLde cDNA para cada. </li><li> Vortex para misturar as reações e centrifugar por 10 seg. </li><li> Coloque as reacções STA em um termociclador e ciclo como indicado na tabela 4. </li></ol></li><li> Exonuclease I (ExoI) tratamento: <ol><li> Dilui-se a Exo I, como indicado na Tabela 5. </li><li> Adicionar 2 mL de ExoI diluído (4 U / mL) para cada reação STA 5 jul, vortex, girar para baixo (&gt; 6.000 xg) e coloque em um termociclador a 37 ° C durante 30 minutos e depois a 80 ° C durante 15 min. </li><li> Dilui-se os produtos finais a uma concentração apropriada para o ensaio. Use TE Buffer (adicionar 43 mL de tampão TE para a amostra TSA 7 mL). </li><li> Guarde os produtos STA diluído a -20 ° C ou o uso imediatamente. </li></ol></li><li> Primer e configuração de exemplo para qPCR: <ol><li> Preparar as amostras como se mostra na Tabela 6. Preparar a mistura de acordo com o chip escolhida para a experiência, e adicionar as amostras conforme apropriado. </li><li> Agilitar as soluções de amostra da mistura por um período mínimo de 20 segundos, e centrifugar (&gt; 6000 xg) durante pelo menos 30 seg. Reacções preparadas podem ser armazenadas durante períodos de tempo curtos, a 4 ° C até que o chip é pronto para carga. </li><li> Preparar os ensaios tal como descrito na Tabela 7. </li><li> Agitar a mistura de ensaio durante um mínimo de 20 seg e centrifuga-se (&gt; 6000 xg) durante pelo menos 30 segundos para girar para baixo de todos os componentes. IMPORTANTE: Vortex bem e centrifugar todas as soluções de amostra e ensaio antes da pipetagem para as entradas de chips. Não fazer isso pode resultar em uma diminuição da qualidade dos dados. NOTA: A concentração final de cada iniciador é de 5 uM na entrada e 500 nM no final da reacção. </li></ol></li><li> Priming e carregando a matriz dinâmica IFC (circuito de fluídica integrado) de chips. O chip IFC tem entradas para amostras e ensaios, bem como entradas especificadas (acumuladores) para a linha de controlo de fluido (óleo mineral) utilizados para pressurizar as câmaras de microfluidos (Figure 4A). <ol><li> Injectar fluido da linha de controlo em cada um acumulador no chip. </li><li> Remover e descartar o filme protector azul a partir do fundo do chip. </li><li> Coloque o chip no controlador IFC apropriado (controlador MX para o IFC 48,48 matriz dinâmica ou o controlador HX IFC para a 96,96 dinâmico matriz IFC), em seguida, executar o script Prime (113x) para o IFC 48,48 matriz dinâmica ou o Prime (136x) roteiro para a dinâmica 96,96 matriz IFC para ferrar o chip. </li><li> Quando o script for concluído, retire o chip ferrado do controlador IFC. </li><li> Pipeta de 5 mL de cada mistura de ensaio e 5 mL de cada amostra em Mix suas entradas. </li><li> Retorne o chip para o controlador IFC. </li><li> Usando o software controlador IFC, execute o Mix (113x) roteiro de Carga para o 48.48 dinâmico matriz IFC) ou Carregar Mix (136x) roteiro para a dinâmica 96,96 matriz IFC para carregar as amostras e ensaios para o chip. Quando o script de carga Mix terminar, retire a cargachips ed do controlador IFC. </li><li> Coloque o chip no termociclador, crie um novo prazo chip (de acordo com as instruções do fabricante), incluindo a análise de curva de fusão. Usando o software termociclador, assegurar que as câmaras de reação são reconhecidas corretamente, e permitir que a reação de correr para a conclusão. </li></ol></li></ol> Análise de Dados 8. <ol><li> A garantia da qualidade: A fim de garantir a qualidade dos dados, verificar a qualidade dos iniciadores de endereçamento curvas de diluição (como descrito acima). Monitorar a especificidade da amplificação exibindo as curvas de fusão de fragmentos amplificados, os picos de forma otimizada, que deve ser bem alinhada 29. </li><li> Visualização: Para visualização de grandes quantidades de dados obtidos pelo alto rendimento qPCR, utilize o software gerado heatmaps, em que a expressão é de intensidade de cor correspondente. Além disso, apresentar a dinâmica de transcrição de genes individuais como gráficos de dispersão alinhados. </li><li> Publicação: Em publicaçãoos resultados de expressão gênica, é aconselhável seguir as orientações MIQE para publicação de experimentos quantitativos PCR em Tempo Real, detalhando as informações mínimas que devem ser comunicadas para um experimento de qPCR para garantir a sua exactidão, a interpretação correta, e reprodutibilidade. </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+qPCR+profiling+of+gene+expression+in+single+neuronal+cells.">Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells.</a> Nature protocols. 7, 118-127 (2012).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Caracterização de sucesso da expressão gênica do tecido cerebral após paradigmas comportamentais depende de: 1) manejo cuidadoso de ratos durante o paradigma comportamental; 2) dissecção rápida e precisa do tecido de interesse; 3) medidas RNA segura de garantir a integridade do RNA; e 4) O planejamento cuidadoso de primers e delineamento experimental, bem como precisão e atenção aos detalhes na preparação para a análise de qPCR. O objectivo do processo descrito é a caracteriza...

Organização dinâmica do cérebro permite flexibilidade cognitiva e comportamental. Experiências são codificadas através de modificações da estrutura e força das conexões entre os neurônios no cérebro 3. Este &quot;dependente da experiência plasticidade&quot; é o resultado da indução de padrões específicos da expressão do gene que fornece as proteínas necessárias para a modificação da estrutura e força 4 sináptica. A identificação de redes de regulação gênicas mediar a formação de memórias de longo prazo é um princípio central da neurociência molecular, com a expectativa de que a identificação dos elementos dominantes de programas de transcrição irá fornecer uma visão sobre os princípios fundamentais que regulam a formação da memória, bem como metas para tratamento de doenças neurodegenerativas e distúrbios neuropsiquiátricos. Programas de transcrição desdobrar-se em ondas temporalmente definidos, cada um dos quais codificam genes de caráter diferente, que são importantes para destágios iferentes na implementação dos resultados do evento de sinalização 1,2. Por isso, é importante abordar a dinâmica de transcrição em um prazo temporal, detalhado, de modo a identificar o conjunto completo de genes induzidos, e obter insights sobre sua função potencial de acordo com a dinâmica de sua indução. A dependência de drogas é uma forma robusta de dependentes de experiência plasticidade causada pelos efeitos duradouros das drogas de abuso em circuitos neurais no cérebro 5,6. Inicial, a exposição aguda a drogas pode levar ao desenvolvimento de dependência e da transição para a utilização crónica. A informação contextual é um elemento crucial para o desenvolvimento de dependência. Pistas ambientais associadas à droga são atribuídas importância significativa nas mentes dos usuários de drogas. A informação contextual lembrando um usuário de drogas de experiência de drogas no passado pode induzir a recaída ânsia de drogas, mesmo após longos períodos de abstinência de exposição ao fármaco 7,8.Daí o grande desafio clínico em vício - a propensão dos adictos recaírem mesmo muito tempo depois de os sintomas de abstinência têm abrandado 9. Sensibilização comportamental à cocaína é um modelo simples de cocaína experiência útil no estudo dos mecanismos da dependência de drogas. Neste modelo amplamente estudado para a sensibilização de longa duração induzida pela exposição crônica às drogas de abuso, roedores estão habituados a primeira injeção de solução salina (intraperitoneal, IP) em um ambiente de romance (uma câmara de campo aberto, no qual sua atividade locomotora é monitorado) ; em seguida, eles recebem injecções diárias de cocaína nas câmaras de campo abertas, enquanto a sua actividade é monitorizada 10 (Figura 1). Este paradigma comportamental resulta tipicamente numa sensibilização robusta de comportamento locomotor (8-12 vezes superior actividade de linha de base) 11, que é mantida durante um período de vários meses após a cessação das injecções de cocaína, demonstrando a formação de um taradotraço de memória ASIVE de experiência com drogas. O circuito neural de recompensa, naturalmente envolvido em reforçar comportamentos essenciais para o sucesso de uma espécie (por exemplo, alimentação, sexo), é explorada por drogas de abuso para reforçar comportamentos associados ao fármaco 12,13. Os mecanismos moleculares e celulares, através da qual a experiência de drogas de abuso é aumentada parecem ser semelhantes aos mecanismos subjacentes à formação da memória declarativa ou semânticas em outras estruturas cerebrais 14. Portanto, a robustez do modelo sensibilização comportamental faz com que seja um sistema modelo atraente para estudar mecanismos de dependentes de experiência plasticidade. O núcleo accumbens (NAC) é um integrador central do circuito de recompensa do cérebro, e tem sido extensivamente associados com o desenvolvimento da dependência de 5,6. A formação de vício depende da transcrição de novas proteínas no núcleo accumbens, e robusto emprodução de programas de transcrição bem estruturados é observado no NAc seguinte experiência cocaína 15-19. A resposta transcricional aguda a exposição à cocaína é susceptível de funcionar em vários níveis, a fim de adaptar-se ao forte estímulo de indução e para direcionar a produção de novas proteínas que são responsáveis ​​pelas mudanças estruturais e eletrofisiológicas induzidas pela exposição à droga 6,19-22. A fim de promover o estudo dos mecanismos moleculares dos dependentes de experiência plasticidade no cérebro, um protocolo descrito para a análise global da dinâmica de transcrição em amostras de tecido cerebral após a manipulação comportamental. O protocolo é ilustrada no contexto da experiência comportamental estudada no laboratório Citri - sensibilização comportamental à cocaína, utilizando matrizes dinâmicas de microfluidos para a análise da transcrição. O protocolo descrito, obviamente, não se limita ao estudo tele nucleus accumbens no contexto da sensibilização comportamental, mas poderia ser aplicado a um grande número de paradigmas comportamentais e regiões do cérebro. Na verdade, este protocolo pode ser aplicado aos tecidos do corpo fora do cérebro, e uma variedade de experiências ou manipulações do organismo estudado. O protocolo é dividido em quatro etapas. No primeiro passo, o animal é submetido ao paradigma comportamental; No segundo passo, o tecido é microdissecados; na terceira etapa - mRNA é purificado, reversamente transcrito e sondadas, e na etapa final, os dados são analisados. No contexto do estudo da dinâmica de transcrição, o tempo preciso e definição da experiência são provavelmente os parâmetros experimentais mais importantes para o controle. Por esse motivo, o nosso modelo de comportamento de escolha é a de sensibilização comportamental à cocaína, um sistema que permite elevado nível de controlo sobre os parâmetros do experimentador da experience. Paradigmas comportamentais adicionais que permitem o sincronismo preciso e abordam diferentes modelos de dependentes de experiência plasticidade ou a formação da memória estão disponíveis. Estes modelos incluem o medo condicionado 23, enriquecimento ambiental aguda 24,25, romance objeto de exploração 26 e experiência visual após criação escuro 27. Ainda assim, a sensibilização comportamental à cocaína é uma manipulação comportamental consistentemente robusta, criando um traço de memória altamente penetrante, que dura meses seguintes experiência cocaína 28. O cérebro é seccionado, seguido por microdissecção manual dos nucleus accumbens. Tem sido a nossa experiência que microdissecção Manual de fatias de cérebro rapidamente preparados proporciona o método mais fiável e rápido de extracção do tecido relevante para o paradigma comportamental, e com a experiência, as fronteiras do tecido tornam-se evidentes e facilmente reconhecidas. Alternativamente, fatias finas poderiam ser prepared, seguido por captura a laser microdissecção. Embora este método permite a delineação muito da região de interesse definidas, isto é lento (correndo assim o risco de perda de ARNm lábil), fastidioso e requer equipamento dispendioso dedicado (um microscópio equipado com uma instalação de captura por laser). O protocolo aqui definido também pode ser adaptado para análises de transcrição de uma única célula, por aspiração do citoplasma das células identificadas visualmente, utilizando pipetas de remendo 29. É importante notar que o protocolo descrito fornece uma média populacional, ao mesmo tempo que é altamente provável que, na maioria dos casos, apenas uma sub-população de células dentro do tecido são, na verdade, envolvido na resposta à experiência. É de interesse para o perfil de transcrição de forma seletiva a partir de dentro de populações de células específicas em resposta à experiência, mas a discussão dessas abordagens está além do escopo atual. Para a purificação de ARNm, transcrição reversa e de qPCR de consulta, o tecidoé interrompido por passagem através de agulhas finas, seguido pela utilização de kits comerciais (para mais informações, consulte a Tabela 8). A escolha é informado pela experiência com essas metodologias que garantam a extração segura de RNA de alta qualidade e resultados robustos de aplicações a jusante. Enquanto o protocolo é descrito por de alto rendimento qPCR utilizando matrizes dinâmicas, as amostras podem ser sondado para a expressão de genes usando ponto final PCR, de baixo rendimento qPCR, microarrays de expressão gênica ou seqüenciamento de profundidade. A preferência por qPCR de alto rendimento, utilizando matrizes dinâmicas é devido ao facto de ARNm obtido a partir de núcleos cerebrais seguinte paradigmas comportamentais é frequentemente de quantidades limitantes. Matrizes dinâmicas fornecer uma plataforma que permite a análise global eficiente dos transcritos de um grande número de amostras em paralelo numa única experiência. Após a aquisição inicial do sistema de microfluidos (vulgarmente uma pu institucionalrchase), as experiências são relativamente baratos para ser executado. Na sequência desta análise, mais consultas das amostras pode ser realizada utilizando as plataformas mais caras para procurar novas transcrições (por microarrays ou RNAseq) com as matrizes dinâmicas proporcionando uma referência abrangente para a garantia da qualidade. Finalmente, para a análise de dados, são utilizados métodos convencionais. Ponteiros específicos a respeito de questões que possam surgir serão discutidos no texto do protocolo. Este protocolo é mais apropriado para os investigadores interessados ​​em uma investigação completa do seu sistema de interesse, estudando várias condições e repetições. O protocolo também é mais adequado para os investigadores que já afinados (através de microarray ou RNAseq experimentos) em um subconjunto de 50-500 genes de interesse, que eles estão interessados ​​em consultar repetidamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="453">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Virusol</td>
			<td>Oriek Medical</td>
			<td>J29D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP 100%</td>
			<td>MINRAD INC</td>
			<td>NDC 60307-110-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy plus Universal Mini Kit</td>
			<td>QIAGENE</td>
			<td>73404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAshredder</td>
			<td>QIAGENE</td>
			<td>79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>AB-4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>1355656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm)</td>
			<td>Self assembled</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inner Perspex box (30X30cm)</td>
			<td>Self assembled</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and video recorder</td>
			<td>Campden Inst</td>
			<td>CMD-80051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Recorder software</td>
			<td>Noldus</td>
			<td>NDS-NMR3-00M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>FST-14062-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sagital Brain slicer with a 0.5mm section</td>
			<td>Brain Tree Scientific</td>
			<td>BS-AL-505S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>The Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microspun spatula</td>
			<td>Bochem Instrument GmbH</td>
			<td>3213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomark HD Reader</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMHD-BMKHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic array Chip for 96.96gene expression</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M-96.96</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive analysis of transcription dynamics from brain samples following behavioral experience

A codificação de experiências no cérebro e na consolidação de memórias de longo prazo dependerá de transcrição do gene. Identificar a função de genes específicos em experiência de codificação é um dos principais objetivos da neurociência molecular. Além disso, a associação funcional de genes definidos com comportamentos específicos tem implicações para a compreensão da base de transtornos neuropsiquiátricos. A indução da transcrição de programas robustos foi observado no cérebro de ratinhos após várias manipulações comportamentais. Enquanto alguns elementos genéticos são utilizados recorrentemente seguinte diferentes manipulações comportamentais e em diferentes núcleos do cérebro, os programas de transcrição são em geral única para os estímulos indutores e a estrutura na qual eles são estudados 1,2. Nesta publicação, um protocolo é descrito para perfilamento transcricional robusta e abrangente de núcleos cerebrais de ratos em resposta à manipulação comportamental. Aprotocolo é demonstrado no contexto da análise da dinâmica de expressão de genes no núcleo accumbens seguinte experiência aguda cocaína. Subseqüente a um definido na experiência vivo, o tecido neural alvo é dissecado; seguido por purificação de RNA, a transcrição reversa e a utilização de matrizes de microfluidos para a análise detalhada de qPCR de múltiplos genes alvo. Este protocolo é voltada para análise abrangente (dirigindo-50-500 genes) de limitar a quantidade de matéria-prima, tais como amostras de cérebros pequenos, ou mesmo uma única célula. O protocolo é o mais vantajoso para a análise de amostras múltiplas em paralelo (por exemplo, células isoladas, análise dinâmica seguinte farmacêutica, viral ou perturbações comportamentais). No entanto, o protocolo também pode servir para a caracterização e garantia de qualidade das amostras antes de estudos todo o genoma por microarrays ou RNAseq, bem como a validação dos dados obtidos a partir de estudos de todo o genoma.

A qualidade dos resultados obtidos através da aplicação deste protocolo crucialmente depende de um número de parâmetros. Planeamento experimental adequada irá resultar na perturbação mínima aos ratinhos experimentais, de modo a que a experiência testado (neste exemplo, que a exposição a cocaína) será a experiência mais dominante na sua história recente, e, portanto, irá resultar num forte e específico da transcrição programa. Figura 1 descreve o plano experimental para a sensibiliza?...

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Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

Análise abrangente de Transcrição Dynamics de amostras de cérebro seguinte experiência Behavioral

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

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11.5K visualizações.  The Hebrew University of Jerusalem. This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays. 

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Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

Injeção estereotáxica de microRNA-expressando Lentiviruses ao mouse Região CA1 do hipocampo e avaliação do resultado Behavioral

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Comportamento

Compensatory Limb Use and Behavioral Assessment of Motor Skill Learning Following Sensorimotor Cortex Injury in a Mouse Model of Ischemic Stroke

Mouse models have become increasingly popular in the field of behavioral neuroscience, and specifically in studies of experimental stroke. As models advance, it is important to develop sensitive behavioral measures specific to the mouse. The present protocol describes a skilled motor task for use in mouse models of stroke. The Pasta Matrix Reaching Task functions as a versatile and sensitive behavioral assay that permits experimenters to collect accurate outcome data and manipulate limb use to mimic human clinical phenomena including compensatory strategies (i.e., learned non-use) and focused rehabilitative training. When combined with neuroanatomical tools, this task also permits researchers to explore the mechanisms that support behavioral recovery of function (or lack thereof) following stroke. The task is both simple and affordable to set up and conduct, offering a variety of training and testing options for numerous research questions concerning functional outcome following injury. Though the task has been applied to mouse models of stroke, it may also be beneficial in studies of functional outcome in other upper extremity injury models.

Mouse models have become increasingly popular in studies of behavioral neuroscience. As models advance, it is important to develop sensitive behavioral measures specific to the mouse. This protocol describes the Pasta Matrix Reaching Task, which is a skilled motor task for use in mouse models of stroke.

Compensatória Limb Uso e Avaliação Comportamental de Habilidade Aprendizagem Motora Após Lesão Sensorimotor Cortex em um modelo do rato de Acidente Vascular Cerebral Isquêmico

Mouse models have become increasingly popular in the field of behavioral neuroscience, and specifically in studies of experimental stroke. As models ...

Transcranial Magnetic Stimulation for Investigating Causal Brain-behavioral Relationships and their Time Course

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a safe, non-invasive brain stimulation technique that uses a strong electromagnet in order to temporarily disrupt information processing in a brain region, generating a short-lived &#8220;virtual lesion.&#8221; Stimulation that interferes with task performance indicates that the affected brain region is necessary to perform the task normally. In other words, unlike neuroimaging methods such as functional magnetic resonance imaging (fMRI) that indicate correlations between brain and behavior, TMS can be used to demonstrate causal brain-behavior relations. Furthermore, by varying the duration and onset of the virtual lesion, TMS can also reveal the time course of normal processing. As a result, TMS has become an important tool in cognitive neuroscience. Advantages of the technique over lesion-deficit studies include better spatial-temporal precision of the disruption effect, the ability to use participants as their own control subjects, and the accessibility of participants. Limitations include concurrent auditory and somatosensory stimulation that may influence task performance, limited access to structures more than a few centimeters from the surface of the scalp, and the relatively large space of free parameters that need to be optimized in order for the experiment to work. Experimental designs that give careful consideration to appropriate control conditions help to address these concerns. This article illustrates these issues with TMS results that investigate the spatial and temporal contributions of the left supramarginal gyrus (SMG) to reading.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a technique for non-invasively disrupting neural information processing and measuring its effect on behavior. When TMS interferes with a task, it indicates that the stimulated brain region is necessary for normal task performance, allowing one to systematically relate brain regions to cognitive functions.

Estimulação Magnética Transcraniana para investigar relações causais Brain-comportamentais e seu Curso de Tempo

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a safe, non-invasive brain stimulation technique that uses a strong electromagnet in order to temporarily ...

Combined Shuttle-Box Training with Electrophysiological Cortex Recording and Stimulation as a Tool to Study Perception and Learning

Shuttle-box avoidance learning is a well-established method in behavioral neuroscience and experimental setups were traditionally custom-made; the necessary equipment is now available by several commercial companies. This protocol provides a detailed description of a two-way shuttle-box avoidance learning paradigm in rodents (here Mongolian gerbils; Meriones unguiculatus) in combination with site-specific electrical intracortical microstimulation (ICMS) and simultaneous chronical electrophysiological in vivo recordings. The detailed protocol is applicable to study multiple aspects of learning behavior and perception in different rodent species.
Site-specific ICMS of auditory cortical circuits as conditioned stimuli here is used as a tool to test the perceptual relevance of specific afferent, efferent and intracortical connections. Distinct activation patterns can be evoked by using different stimulation electrode arrays for local, layer-dependent ICMS or distant ICMS sites. Utilizing behavioral signal detection analysis it can be determined which stimulation strategy is most effective for eliciting a behaviorally detectable and salient signal. Further, parallel multichannel-recordings using different electrode designs (surface electrodes, depth electrodes, etc.) allow for investigating neuronal observables over the time course of such learning processes. It will be discussed how changes of the behavioral design can increase the cognitive complexity (e.g. detection, discrimination, reversal learning).

Shuttle-box avoidance learning is well-established in behavioral neuroscience. This protocol describes how shuttle-box learning in rodents can be combined with site-specific electrical intracortical microstimulation (ICMS) and simultaneous chronical in vivo recordings as a tool to study multiple aspects of learning and perception.

Combinado Shuttle-Box Formação com eletrofisiológica Cortex Gravação e Estimulação como Ferramenta para o Estudo de Percepção e Aprendizagem

Shuttle-box avoidance learning is a well-established method in behavioral neuroscience and experimental setups were traditionally custom-made; the ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Roedor Cérebro microinjeção para estudar substratos moleculares do comportamento motivado

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

Estimulação do nervo vago como uma ferramenta para induzir plasticidade em Pathways relevantes para a Aprendizagem Extinção

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Assessing Working Memory in Children: The Comprehensive Assessment Battery for Children &#8211; Working Memory (CABC-WM)

The Comprehensive Assessment Battery for Children - Working Memory (CABC-WM) is a computer-based battery designed to assess different components of working memory in young school-age children. Working memory deficits have been identified in children with language-based learning disabilities, including dyslexia1,2 and language impairment3,4, but it is not clear whether these children exhibit deficits in subcomponents of working memory, such as visuospatial or phonological working memory. The CABC-WM is administered on a desktop computer with a touchscreen interface and was specifically developed to be engaging and motivating for children. Although the long-term goal of the CABC-WM is to provide individualized working memory profiles in children, the present study focuses on the initial success and utility of the CABC-WM for measuring central executive, visuospatial, phonological loop, and binding constructs in children with typical development. Immediate next steps are to administer the CABC-WM to children with specific language impairment, dyslexia, and comorbid specific language impairment and dyslexia.

Assessing Working Memory in Children: The Comprehensive Assessment Battery for Children &amp;#8211; Working Memory (CABC-WM)

Working memory predicts a significant amount of variance for a variety of cognitive tasks, including speaking, reading, and writing. However, few tools are available to assess working memory in children. We present an innovative, computer-based battery that comprehensively assesses different components of working memory in school-age children.

Avaliando memória de trabalho em crianças: a bateria de avaliação abrangente para crianças - Memória de trabalho (CABC-WM)

The Comprehensive Assessment Battery for Children - Working Memory (CABC-WM) is a computer-based battery designed to assess different components of ...

Detecting Behavioral Deficits in Rats After Traumatic Brain Injury

With the increasing incidence of traumatic brain injury (TBI) in both civilian and military populations, TBI is now considered a chronic disease; however, few studies have investigated the long-term effects of injury in rodent models of TBI. Shown here are behavioral measures that are well-established in TBI research for times early after injury, such as two weeks, until two months. Some of these methods have previously been used at later times after injury, up to one year, but by very few laboratories. The methods demonstrated here are a short neurological assessment to test reflexes, a Beam-Balance to test balance, a Beam-Walk to test balance and motor coordination, and a working memory version of the Morris water maze that can be sensitive to deficits in reference memory. Male rats were handled and pre-trained to neurological, balance, and motor coordination tests prior to receiving parasagittal fluid percussion injury (FPI) or sham injury. Rats can be tested on the short neurological assessment (neuroscore), the beam-balance, and the Beam-Walk multiple times, while testing on the water maze can only be done once. This difference is because rats can remember the task, thus confounding the results if repeated testing is attempted in the same animal. When testing from one to three days after injury, significant differences are detected in all three non-cognitive tasks. However, differences in the Beam-Walk task were not detectable at later time points (after 3 months). Deficits were detected at 3 months in the Beam-Balance and at 6 months in the neuroscore. Deficits in working memory were detected out to 12 months after injury, and a deficit in a reference memory first appeared at 12 months. Thus, standard behavioral tests can be useful measures of persistent behavioral deficits after FPI.

The goal of the behavioral tests presented here is to detect functional deficits in rats after traumatic brain injury. Four specific tests are presented that detect deficits in behaviors to reflect the damage to specific brain areas at times extending to one year after injury.

Detecção de défices comportamentais em ratos após lesão cerebral traumática

With the increasing incidence of traumatic brain injury (TBI) in both civilian and military populations, TBI is now considered a chronic disease; however, ...

An Automated T-maze Based Apparatus and Protocol for Analyzing Delay- and Effort-based Decision Making in  Free Moving Rodents

Many neurological and psychiatric patients demonstrate difficulties and/or deficits in decision making. Rodent models are helpful to produce a deeper understanding of the neurobiological causes underlying the decision-making problems. A cost-benefit based T-maze task is used for measuring decision making in which rodents choose between a high reward arm (HRA) and a low reward arm (LRA). There are two paradigms of the T-maze decision-making task, one in which the cost is a time delay and the other in which it is physical effort. Both paradigms require a tedious and labor-intensive management of experimental animals, multiple doors, pellet reward, and arm choice recordings. In the current work, we invented an apparatus based on traditional T-maze with full automation for pellet delivery, door management and choice recordings. This automated setup can be used for the evaluation of both delay- and effort-based decision making in rodents. With the protocol described here, our lab investigated the decision-making phenotypes of multiple genetically modified mice. In the representative data, we showed that the mice with ablated medial habenular showed aversions of both delay and effort and tended to choose the immediate and effortless reward. This protocol helps to decrease the variability caused by experimenter intervention and to enhance experiment efficiency. In addition, chronic silicon probe or microelectrode recording, fiber-optic imaging and/or manipulation of neural activity can be easily applied during the decision-making task using the setup described here.

This article introduces an automated T-maze apparatus that we invented, and a protocol based on this apparatus for analyzing delay-based decision making and effort-based decision making in free moving rodents.

Uma ZIF automatizado baseado aparelhos e protocolo para análise de tomada de decisão baseada em atraso e esforço em roedores em movimento livre

Many neurological and psychiatric patients demonstrate difficulties and/or deficits in decision making. Rodent models are helpful to produce a deeper ...

Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage

Multiple factors&#8212;such as aging and genes&#8212;are frequently associated with cognitive decline. Genetically modified mouse models of cognitive decline, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), have become a promising tool to elucidate the underlying mechanisms and promote the therapeutic advances. An important step is the validation and characterization of expected behavioral abnormality in the models, in the case of AD, cognitive decline. The long-term behavioral investigations of laboratory animals to study the effect of aging demand substantial efforts from researchers. The IntelliCage system is a high-throughput and cost-effective test battery for mice that eliminates the need for daily human handling. Here, we describe how the system is utilized in the long-term phenotyping of a genetic Alzheimer&#39;s disease model, specifically focusing on the cognitive functions. The experiment employs repeated battery of tests that assess spatial learning and executive functions. This cost-effective age-dependent phenotyping allows us to identify the transient and/or permanent effects of genes on various cognitive aspects.

Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer&#039;s Disease, Using IntelliCage

This paper describes a protocol for cognitive assessments for genetic models of the Alzheimer&#39;s disease using the IntelliCage system, which is a high throughput automated behavioral monitoring system with operant conditioning.

Automatizada, a longo prazo ensaio comportamental para funções cognitivas em vários modelos genéticos da doença de Alzheimer, usando IntelliCage

Multiple factors&#8212;such as aging and genes&#8212;are frequently associated with cognitive decline. Genetically modified mouse models of cognitive ...