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Declaração de Ética: NOTA: Todos os procedimentos descritos neste manuscrito estão em conformidade com as diretrizes do NIH para Pesquisa Animal (Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório) e são aprovados pelo Comitê IACUC Escola de Medicina de Harvard. Preparação 1. Pré-cirúrgica <ol><li> Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos são esterilizados por autoclave ou seja pela limpeza com a solução e / ou etanol anti-séptico, conforme necessário. Sempre que possível, use o material descartável estéril como bisturis, agulhas e seringas. </li><li> Cobrir a bancada de trabalho com campos cirúrgicos e garantir que não é uma eliminação de resíduos perigosos disponível. </li><li> Pesa-se o rato e calcular a dose de anestesia. Utilize uma mistura de cetamina / xilazina (cetamina 75 mg / kg de xilazina e 10 mg / kg) para anestesiar os ratos. NOTA: entre 200-250 g é o peso ideal para a fixação adequada do animal na moldura estereotáxica, bem como para direccionamento preciso da ATN. Isoflurane também pode ser utilizado como o agente de anestesia. </li><li> A montagem e dois eléctrodos estéreis seguras (esterilizado em autoclave ou com óxido de etileno) sobre o suporte do eléctrodo (Figura 2) de um quadro estereotáctico e cirúrgico com o auxílio de um microscópio (ampliação de 10-40X), inspeccionar as pontas do eléctrodo para adequada alinhamento. Prenda os dois eletrodos de 3,0 milímetros de distância. NOTA: Tenha cuidado para não danificar a ponta do eletrodo por tocar em superfícies duras. </li></ol> 2. DBS Cirurgia <ol><li> Injectar a ketamina / xilazina misturar intraperitoneal para o animal e confirmar que o animal chegou a um plano cirúrgico de anestesia (marcando para o reflexo toe-pitada, freqüência respiratória e profundidade e regularidade da respiração). Remover os pêlos da região do couro cabeludo, que vai ser objecto de incisão e desinfectar o couro cabeludo com 3 esfrega alternadas de cada betadine e álcool ou soro fisiológico estéril. Seguros e posicionar o animal no fram estereotáxicae. </li><li> Use circulam almofadas de água quente para manter a temperatura do corpo do animal em um nível ideal. Aplique lubrificante ocular para os olhos do animal para proteger contra o ressecamento. </li><li> Use as seguintes coordenadas estereotáxica para direccionar a ATN (Anterior núcleo talâmico): anterioposterior -1,6 mm, 1,5 mm e mediolateral dorsoventral 5,2 milímetros 1. NOTA: As coordenadas estereotáxicas são baseadas no Paxinos e Watson (6 th edition) atlas cerebral de rato 36. </li><li> Realizar uma incisão no escalpe sagital para revelar o crânio. Utilizando um par de afastadores proteger o couro cabeludo incisão para expor o crânio. Use soro fisiológico estéril para lavar a incisão. Se a incisão é muito úmido, use cotonetes estéreis para secar. Localize o bregma e marcar com um marcador preto. Para orientar a posição dos furos de rebarba, tornar mais duas marcas em aproximadamente 1,5 mm mediolaterally em ambos os lados da sutura sagital e 1,6 mm posterior ao coronai sutura. </li><li> Use uma broca de mão para fazer os furos Burr. Certifique-se a ponta do orifício de trepanação é estéril, esterilizando-o com etanol. Segure a furadeira em cerca de um ângulo de 45 ° para a superfície do crânio quando a perfuração. Alterna com freqüência entre os dois orifícios da rebarba para evitar o calor excessivo no local de qualquer orifício de trepanação. </li><li> Continuar até perfuração da dura-máter está exposta. Usando uma agulha com a ponta dobrada lembrando a forma de um &#39;L&#39;, remova quaisquer pedaços de osso que possa dificultar a inserção do eletrodo. Tome cuidado para não danificar a dura e / ou tecido cerebral subjacente ao remover fragmentos de ossos utilizando a agulha torta. NOTA: Usando uma agulha embotada ou pinça sem corte finas também é uma opção. </li><li> Fixar o conjunto de eléctrodo duplo para a pega rotativa da moldura estereotáxica e fixar a pega a um ângulo de 90 °. Usando os ajustes no quadro estereotáxico, posicione o eletrodo à esquerda exatamente acima do bregma. </li><li> Usando o aparelho de somajustes táticos para posicionamento mediolateral, mover precisamente o eléctrodo de 1,5 mm a esquerda do lado esquerdo da bregma de tal modo que agora existem dois eléctrodos perfeitamente alinhadas ao longo da sutura coronária mas espaçadas em 1,5 milímetros mediolaterally do bregma. </li><li> Usando os ajustes estereotaxia anterioposterior, mova os eletrodos 1,6 milímetros posterior à sutura coronal. </li><li> Use os ajustes dorsoventrais para diminuir os eletrodos para primeiro verificar se os furos burr foram feitas no local certo de tal modo que os eletrodos podem ser inseridos com facilidade, sem tocar as arestas dos furos Burr. Se assim for, inserir os eléctrodos a uma profundidade de 5,2 mm a partir da superfície do crânio. </li><li> Conecte-se os eletrodos através leva a um estimulador fixado em 130 Hz, 2,5 V e 90 ms pulsewidth 1. </li><li> Proporcionar alta frequência de estimulação durante uma hora (ou durante um período de tempo desejado conforme a configuração experimental). Durante o curso da estimulação, p lembrar assegurarprofundidade anestésica roper regularmente, verificando a ausência de retirada da pata em resposta a uma pitada dedo do pé. Suplemento anestesia com aproximadamente metade da dose inicial utilizada para induzir a anestesia. Evitar a contaminação de suas luvas estéreis durante a verificação da profundidade anestésica e alterá-las se necessário. Realizar estimulação unilateral ou bilateral com base nas necessidades experimentais de um. Incluir controles, como a baixa freqüência de estimulação (por ex., 10 Hz) e animais não estimuladas (inserindo eletrodos sem estimulação subsequente). </li><li> Após a estimulação estiver pronto, retire os eletrodos com cuidado e suturar a incisão com 3-0 ou com grampos cirúrgicos estéreis. </li><li> Administrar buprenorfina (0,05 mg / kg) por via subcutânea, a analgesia. Monitorar o animal até que ele retorne à atividade normal e, em seguida, devolvê-lo à instalação de alojamento. </li><li> Depois de um período de tempo definido com base no design experimental (por exemplo: 0, 3, 6 ou 12 horas após a cirurgia DBS), Eutanásia do animal com anestesia overdose. Depois de confirmar a ausência de sinais vitais, decapitar o animal. </li><li> Dissecar o cérebro, primeiro removendo a pele com uma tesoura. Cortar o osso ao longo da sutura sagital usando tesouras de dissecação. Faça mais duas incisões (cerca de um centímetro cada) através do osso em ambos os lados laterais. Usando fórceps, levantar a peça cortada parcialmente de osso a partir do topo do crânio para expor o cérebro. </li><li> Usando uma tesoura fina ou fórceps, desalojar o cérebro do crânio e transferir para uma placa de Petri com PBS frio no gelo. NOTA: Tome cuidado para evitar danos ao cérebro ao fazer as incisões através do osso. </li></ol> 3. Hippocampus Isolation NOTA: Faça todos os passos subsequentes nesta seção no gelo. <ol><li> Coloque o cérebro em uma matriz de acrílico cérebro pré-resfriado em gelo. Usando uma lâmina de barbear, cortar o cérebro coronally em cerca de 7-8 mm do anterior mais-edge do cérebro. Faça um segundo corte coronal e posterior ao primeiro corte de tal forma que uma fatia do cérebro cerca de 5 mm de espessura pode ser removido. </li><li> Transferir a fatia de cérebro para uma placa de Petri com PBS gelado. Usando lâmina de barbear, cortar as duas seções hemisféricas e tomar o cuidado de observar qual hemisfério corresponde aos lados esquerdo e direito, respectivamente. Isto é especialmente importante durante a execução de estímulos unilaterais. </li><li> Usando uma pinça fina e tesouras remover o hipocampo cuidadosamente. </li><li> O Flash congelar o tecido do hipocampo em gelo seco e armazenar em freezer -20 ° C até que esteja pronto para as etapas de extração de RNA subsequentes. NOTA: Para o armazenamento a longo prazo, é aconselhável armazenar amostras de tecido em um congelador a -80 ° C. </li></ol> 4. Extração de RNA e PCR quantitativa <ol><li> Certifique-se que o tecido permanece congelado em gelo seco até que esteja pronto para a homogeneização. </li><li> NOTA: Execute esta etapa no capô. <ol><li> Adicionar 1 ml de reagente Tri para Hippocampal tecido num tubo de centrífuga de 1,5 ml, e homogeneizar por pipetagem primeira várias vezes até que o tecido está dividido em peças mais pequenas. Além disso homogeneizar o tecido passando através de uma seringa com uma agulha de 25 G até que não há tecido ininterrupta visível. Execute as etapas de homogeneização no gelo. </li><li> Após a homogeneização do tecido, permite a suspensão de células em repouso à temperatura ambiente durante 5 min para permitir a lise celular. NOTA: Findo este período a suspensão celular pode ser rapidamente congeladas e armazenadas em -70 ° C até posterior processamento. </li></ol></li><li> Adicionar 0,2 ml de clorofórmio e misturar em vortex durante 20 segundos e deixar a solução restante à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Centrifuga-se as amostras a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Após a centrifugação, remover os tubos com cuidado, sem perturbar as três camadas separadas que serão visíveis. NOTA: A fase inferior (vermelho) contém proteínas, fase nublado meio contém DNA eo topo fase clara contém RN / D. </li><li> Transferir a fase superior clara (ARN) em 1,5 ml de um novo tubo de centrífuga (tipicamente 500 ul da fase contendo ARN é obtido). Para este adicionar 0,5 ml isopropanol e misture por vórtex. Para este adicionar 2-3 ul de glicogénio (20 mg / ml) como o veículo para o RNA. Deixar a amostra para descansar sobre a mesa à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Centrifuga-se a amostra a 12.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. Certifique-se de que o sedimento de ARN é visível na parte inferior do tubo. </li><li> Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento de ARN por adição de 1 ml de etanol a 75% (feito com água livre de nuclease). Inverta a amostra várias vezes até que o sedimento que se desprende da parte inferior do tubo e flutua na solução. Centrifuga-se a solução a 12000 xg durante 10 min a 4 ° C. NOTA: O sedimento em etanol a 75% pode ser armazenado a -20 ° C até serem medidas adicionais. </li><li> Permitir que o sedimento de ARN para ar seco, deixando os tubos abertos para 5 min à temperatura ambiente. Tome precauções para evitar over secagem do sedimento como esta pode afectar a sua dissolução em água no passo subsequente. </li></ol> 5. Remover DNA a partir da preparação RNA <ol><li> Adicionar 9 mL de água livre de nuclease ao sedimento RNA e certifique-se o pellet é dissolvido antes de prosseguir em vortex suavemente o tubo. Para este adicionar 1 ml de Tampão de 10x ADNase I e 1 ul de ADNase recombinante (a partir de ADNase I kit), misturar sacudindo suavemente os tubos, giram brevemente os tubos e incubar a 37 ° C em banho-maria durante 30 min. </li><li> Adicionar 2 mL de reagente de inactivação de DNase (a partir de ADNase I kit) para a amostra e incubar à temperatura ambiente durante 2 min e misturar frequentemente sacudindo suavemente o tubo. Centrifugar a 12.000 xg durante 10 min e transferência aproximadamente 10 ul de sobrenadante límpido para um novo tubo de centrífuga de 1,5 ml. </li><li> Medir a concentração de ARN utilizando um espectrofotómetro ou NanoDrop. </li></ol> 6. Fazendo ADNc a partir de ARN <ol><li> Adicionar th volume necessárioem contém 1 mg de RNA e levar o volume total de 8 mL por adição de água livre de nuclease. Para isso, adicione 1 mL 10 mM dNTP misturar e 1 ml de hexâmeros aleatórios do Kit sobrescrito First Strand Synthesis. Misturar suavemente e incuba-se a 65 ° C durante 5 min em qualquer um banho de água ou em um termociclador pré-programado. </li><li> Fazer uma pré-mistura contendo os seguintes reagentes: 2 ul de Tampão 10 x RT, 4 mL de 25 M de MgCl2, 2 ul de DTT 0,1 M e 1 uL de RNAse FORA (40 U / ul). NOTA: Os volumes indicados são por reação, o usuário precisaria escalar de acordo com sua necessidades experimentais. </li><li> Após a remoção da amostra contendo ARN de 65 ° C, ajustar o tubo à temperatura ambiente durante um minuto. Adicionar a solução de pré-mistura 9 ul e incubar à temperatura ambiente durante 2 min. Adicionar 1 ml de enzima transcriptase reversa Superscript II (50 U / ul) e, em seguida incubar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Incubar as amostras a 42 ° C durante 50min para a transcrição inversa ocorra. </li><li> Incubar as amostras a 70 ° C durante 15 minutos para terminar a reacção. </li><li> Coloque as amostras em gelo e brevemente adicionar 1 ul ARNaseH (2 U / ul) e incubar a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Resumidamente centrifugar os tubos a 3000 xg de girar o líquido condensado. NOTA: Este é o ADNc que será utilizada para a PCR quantitativa. cDNA pode ser armazenado no congelador a -20 ° C até que a configuração de PCR. cDNA também pode ser diluído com água isenta de nuclease antes de prosseguir para a PCR. </li></ol> 7. PCR quantitativa <ol><li> Faça uma mistura mestre contendo os seguintes reagentes (volumes indicados são por reacção): 6,3 l de 2x Sybr Mix Verde, 0,6 l de Adiante Primer (10 mM), 0,6 l de primer reverso (10 mM) e 0,5 mL de água livre de nuclease . NOTA: Projeto Primer foi feito usando o &#39;Escolha Primers &quot;opção em página sequência de nucleotídeos do NCBI para o gene de interesse. </li><li> Adicionar 10 ul mastermix a cada poço de uma placa de PCR de 96 bem. Adicionar 2,5 uL de ADNc feitas anteriormente para o poço que contém o mastermix. Certifique-se de criar reações de PCR em triplicado para cada amostra. </li><li> Depois de se completar a adição de mastermix e ADNc, cobrir a placa de PCR, utilizando uma folha adesiva óptica para vedar os poços. Girar a placa brevemente durante 5 min a 500 xg numa centrifugadora de bancada para resolver tudo o líquido para o fundo do poço. </li><li> Carregue a placa de PCR numa máquina de RT-PCR pré-programado. Use os parâmetros de PCR previstas na Tabela 1. </li><li> A análise dos dados: Use os valores C t da saída qPCR para outros cálculos. Junto com o gene teste, criado reações de PCR para os genes de controlo interno, 18S rRNA (para garantir a igualdade de entrada) e β-actina (controle negativo). Calcule mudanças vezes com base no método de ΔΔCt 37. </li></ol>

The authors have no disclosures.

Após o trabalho de Marco por Benabid et al. Em usar estimulação cerebral profunda para tratar a doença de Parkinson e tremor essencial, a técnica cirúrgica DBS foi investigado com muito interesse ao longo da última década para tratar vários distúrbios neurológicos 6,10,43. DBS estudos que visam várias regiões neuro-anatômica dos circuitos cerebrais são atualmente realizados por vários grupos para abordar as principais doenças neuronais e estão em várias fases de ensaios clínicos. ...

A história por trás do desenvolvimento de estimulação profunda do cérebro como uma técnica neurocirúrgica remonta à década de 1870, quando a possibilidade de estimular eletricamente o circuito cerebral foi explorada 2. O uso da estimulação de alta frequência crônica como tratamento para distúrbios neuronais começou na década de 1960 3. Mais tarde, na década de 1990, com o advento de eléctrodos de implantação crónica de DBS 4-6, o número de distúrbios neuronais que foram tratados por DBS continuou a aumentar. A estimulação cerebral profunda foi usado pela primeira vez nos Estados Unidos como um tratamento para o tremor essencial 6. Hoje, a cirurgia é amplamente utilizado para tratar desordens neuronais que estão actualmente tratável por intervenção farmacológica. DBS é actualmente utilizado para o tratamento de perturbações do movimento da doença de Parkinson e distonia 7-9. Demência de tipo Alzheimer, doença, epilepsia, dor e doenças neuropsiquiátricas tal depressão de Huntington, OCD, Tourette7; s síndrome e vício são algumas das condições passíveis de tratamento por DBS 10-12. Enquanto a cirurgia DBS é aprovado pela FDA para o tratamento da doença de Parkinson, a distonia e tremor essencial, a utilização de DBS para o tratamento de outras condições mencionadas acima estão em vários estágios de laboratório e estudos clínicos que oferecem a promessa muito doentes 13,14. Clinicamente, a cirurgia de DBS é realizada em duas fases. A primeira etapa envolve a posicionar os eléctrodos cirurgicamente DBS na localização anatómica alvejado usando uma combinação de posicionamento radiológico, CT, MRI, bem como leituras microeléctrodos para maior precisão. A segunda fase envolve a implantação de um gerador de impulsos no peito do paciente e a instalação de extensões do couro cabeludo para o gerador de impulsos. Com base na condição neurológica, vários esquemas de programação para o gerador de impulsos foram padronizados e irá ser utilizado para entregar a tensão desejada. A final, voltagem é atingida de forma gradual, de modo a receber a melhor resposta clínica com o mínimo de tensão 15. No entanto, nos nossos estudos, ao contrário dos implantes DBS crónicas utilizado clinicamente, por uma questão de simplicidade, que recorreram a estudar um tempo de estimulação de alta frequência (durante 1 hora) nos modelos animais. Parte da pesquisa do nosso grupo concentra-se em investigar o uso da cirurgia DBS para a epilepsia refratária ao tratamento. Abordagens cirúrgicas estereotáxica, com auxílio de estimulação de alta frequência tem sido explorado por muitos outros como uma opção eficaz para tratar a epilepsia clinicamente refratária, que constitui cerca de 30% de todas as incidências de epilepsia 10,16,17. Estimulação cerebelar direccionamento da superfície cortical bem como os núcleos profundos do cerebelo têm sido utilizados no passado como alvos para o tratamento de epilepsia 10,18,19. Além disso, a estimulação hipocampo também foi tentado, mas com resultados mistos 20,21. Alguns dos outros investigadaMetas DBS para a epilepsia incluem o córtex cerebral, tálamo, núcleo subtalâmico e nervo vago 8. No entanto, após os resultados de vários estudos nos últimos anos, o núcleo talâmico anterior (ATN) emergiu como o alvo mais comum DBS para o tratamento da epilepsia 10,22. Com base nos conhecimentos sobre circuitos neuroanatomical e resultados de modelos animais, vários estudos têm-se centrado sobre o efeito terapêutico de estimulação cerebral profunda da ATN no tratamento de epilepsia 23-26. A ATN é parte do circuito límbico e está localizado na região do cérebro que afeta a frequência de crises. Estudos por Hamani et al., Testaram a eficácia da NTA-DBS em um modelo de epilepsia induzida por pilocarpina e descobriu que a estimulação bilateral ATN latências para convulsões induzidas por pilocarpina e estado de mal epiléptico 24 prolongada. Além disso, a alta estimulação da ATN frequência foi encontrada para reduzir a freqüência de crises em um modelo de pentilenotetrazol (PTZ) de epilepsy 25,27-29. Lee et al., Relataram uma redução média da frequência de crises por cerca de 75% em cima da estimulação cerebral profunda crônica da ATN no tratamento da epilepsia refratária parcial 30. Um recente estudo clínico sobre a epilepsia refratária ao tratamento tem mostrado resultados promissores após a cirurgia DBS visando o núcleo talâmico anterior (ATN) 22. Um ensaio clínico multicêntrico, randomizado, com 110 pacientes submetidos a DBS bilateral da ATN para o tratamento de epilepsia refratária (trial SANTE) indicaram uma queda na frequência de crises por cerca de 40% 31. Os resultados deste estudo também sugeriu em um efeito anti-epiléptico ideal atrasado observado em 2-3 meses após a cirurgia. Estudos adicionais por Toda et al., Corroborado com estes resultados, onde eles demonstraram neurogênese acontecendo em um momento pós tarde DBS (dias 3-5) em modelos animais 1. Além disso, Encinas et al., Relataram neurogène hipocamposis no giro denteado do rato adulto, após a estimulação da ATN 32 de alta freqüência. Estudos anteriores 33-35 relataram declínio neurogênese em certos casos de epilepsia, como a epilepsia crônica do lobo temporal e uma associação com déficits de aprendizagem, perda de memória e espontâneas convulsões motoras recorrentes. Além disso, houve uma redução nos factores de células estaminais progenitoras neurais, tais como o FGF2 e de IGF-1 no hipocampo cronicamente epiléptico em modelos animais 33. Considerando isso, estratégias de intervenção, tais como DBS que mostram um aumento da neurogênese no giro dentado são caminhos interessantes para a pesquisa. Estes resultados têm nos encorajado a explorar mais profundamente o mecanismo subjacente tratamento neurogênese pós-DBS para a epilepsia. Temos como alvo a ATN tanto unilateral (dados não publicados), bem como a nível bilateral (em resultados representativos) e neurotrofina elevado visto (BDNF) expressão no giro dentado de ratos. Nosso current hipótese é que a expressão de BDNF inicia uma cascata de expressão do gene que culmina na neurogénese que traduz o efeito anti-epiléptico de cirurgia de DBS. Neste artigo, apresentamos os nossos métodos de cirurgia DBS visando a ATN em ratos, seguido de análise de expressão gênica como uma abordagem atraente para estudar o mecanismo subjacente aos benefícios do DBS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1211">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:236px;">Deep Brain Stimulation Surgery</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:604px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent/Equipment</td>
			<td>Vendor Name</td>
			<td>Catalog No.&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereotactic frame</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Drill&#160;</td>
			<td>Dremmel</td>
			<td>7700, 7.2 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scalpel</td>
			<td>BD</td>
			<td>372610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637</td>
			<td>Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylazine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-808-1947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenorphine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-850-2280</td>
			<td>Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical staples</td>
			<td>ConMed Corporation</td>
			<td>8035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sutures (3-0)&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-3333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (1 ml, 29 1/2 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>329464</td>
			<td>Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (3 ml, 25 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309570</td>
			<td>Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305761</td>
			<td>Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Use for general sterilization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eye Lubricant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-898-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stimulator</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>Model 3628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DBS electrodes</td>
			<td>Rhodes Medical Instruments, CA</td>
			<td>SNEX100x-100mm</td>
			<td>Electrodes are platinum, concentric and bipolar</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Betadine (Povidone-Iodine)&#160;</td>
			<td>PDI</td>
			<td>S23125</td>
			<td>Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="2" height="25" style="height:25px;">&#160;Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent/Equipment</td>
			<td>Vendor Name</td>
			<td>Catalog No.&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acrylic Rodent Brain Matrix</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>175-300</td>
			<td>www.emsdiasum.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Razor Blade</td>
			<td>V W R</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guillotine Scissors</td>
			<td>Clauss</td>
			<td>18039</td>
			<td>For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td>Codman Classic</td>
			<td>34-4098</td>
			<td>Use for removing the brain from the skull</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72957-06</td>
			<td>Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BM-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="2" height="25" style="height:25px;">&#160;RNA Extraction and cDNA Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent/Equipment</td>
			<td>Vendor Name</td>
			<td>Catalog No.&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tri Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9424</td>
			<td>Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (3 ml, 25 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309570</td>
			<td>Use for tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dnase I Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superscript First Strand Synthesis Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11904-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tabletop Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">&#160;Quantitative PCR</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent/Equipment</td>
			<td>Vendor Name</td>
			<td>Catalog No.&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Custom Oligos</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10668051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Plates (96 wells)</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>C18080-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optical Adhesive Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease free Water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30538-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Real Time PCR Machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>7500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus

A estimulação cerebral profunda (DBS) cirurgia, tendo como alvo várias regiões do cérebro, como os gânglios basais, tálamo e regiões subtalâmico, é um tratamento eficaz para vários distúrbios de movimento que não conseguiram responder à medicação. Os progressos recentes no campo da cirurgia DBS começou a alargar a aplicação desta técnica cirúrgica para outras condições tão diversas como obesidade mórbida, depressão e transtorno obsessivo compulsivo. Apesar dessas indicações em expansão, pouco se sabe sobre os mecanismos fisiológicos subjacentes que facilitam os efeitos benéficos da cirurgia DBS. Uma abordagem a esta questão é a realização de análise de expressão gênica em neurônios que recebem a estimulação elétrica. Estudos anteriores demonstraram que a neurogénese no giro dentado de ratos é induzida em DBS segmentação do núcleo anterior do tálamo 1. Cirurgia DBS visando a ATN é amplamente utilizado para o tratamento da epilepsia refratária. É, portanto, de muito interest para nós para explorar as mudanças de transcrição induzidos ao estimular eletricamente o ATN. Neste artigo, são apresentadas as nossas metodologias para estereotaxicamente-guiada cirurgia DBS visando a ATN em ratos Wistar machos adultos. Discutimos também as etapas subseqüentes para dissecção dos tecidos, o isolamento do RNA, a preparação de cDNA e RT-PCR quantitativo para medir as mudanças de expressão gênica. Este método pode ser aplicado e modificado para estimular os gânglios da base e em outras regiões do cérebro normalmente clinicamente alvo. O estudo de expressão gênica descrito aqui assume uma abordagem gene alvo candidato para descobrir jogadores moleculares que poderiam ser direcionando o mecanismo para DBS.

As Figuras 1A e 1B mostram a expressão relativa de BDNF e GABRD em relação ao controlo do gene da β-actina. BDNF, uma neurotrofina é freqüentemente associada com efeitos neuroprotetores em muitas doenças neuronais 38-41. Por isso, é interessante analisar o perfil de BDNF expressão em resposta à estimulação da ATN que rende benefícios terapêuticos para doentes epilépticos. Na Figura 1A, que mostra o perfil de expressão gênica de BDNF entre os ...

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Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Análise das Alterações Gene expressão no Rat Hippocampus Após Estimulação Cerebral Profunda do Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

analysis-gene-expression-changes-rat-hippocampus-after-deep-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.8K visualizações.  Brigham & Women's Hospital, Harvard Medical School. The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

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TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Usando o protocolo Theta-Burst para Explorar Mechasnism de Plasticidade em Indivíduos com Síndrome do X Frágil e Autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Neurociência

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

O dispositivo NeuroStar TMS: Conduzindo a FDA Aprovado protocolo para o tratamento da depressão

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Eletrofisiologia II: Fabricação Eletrodo de Sucção Extracelular

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

Análise otimizado de metilação do DNA e expressão gênica de pequenas áreas anatomicamente definidos do Cérebro

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Microdissecção Captura de Populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Micromanipulação de expressão gênica no cérebro adulto Zebrafish Usando microinjeção Cerebroventricular de Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

Estimulação Cerebral Profunda com fMRI simultâneo em Roedores

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Usando fluorescência celular ativado Classificando a Examine-Cell-tipo específico Expressão Gênica em Tissue cérebro de um rato

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, dystonia or tremor. DBS is based on the delivery of electrical stimuli to specific deep anatomic structures of the central nervous system. However, the mechanisms underlying the effect of DBS remain enigmatic. This has led to an interest in investigating the impact of DBS in animal models, especially in rats. As DBS is a long-term therapy, research should be focused on molecular-genetic changes of neural circuits that occur several weeks after DBS. Long-term DBS in rats is challenging because the rats move around in their cage, which causes problems in keeping in place the wire leading from the head of the animal to the stimulator. Furthermore, target structures for stimulation in the rat brain are small and therefore electrodes cannot easily be placed at the required position. Thus, a set-up for long-lasting stimulation of rats using platinum/iridium electrodes with an impedance of about 1 M&#937; was developed for this study. An electrode with these specifications allows for not only adequate stimulation but also recording of deep brain structures to identify the target area for DBS. In our set-up, an electrode with a plug for the wire was embedded in dental cement with four anchoring screws secured onto the skull. The wire from the plug to the stimulator was protected by a stainless-steel spring. A swivel was connected to the circuit to prevent the wire from becoming tangled. Overall, this stimulation set-up offers a high degree of free mobility for the rat and enables the head plug, as well as the wire connection between the plug and the stimulator, to retain long-lasting strength.

A method for implanting electrodes into the subthalamic nucleus (STN) of rats is described. Better localization of the STN was achieved by using a microrecording system. Furthermore, a stimulation set-up is presented that is characterized by long-lasting connections between the head of the animal and the stimulator.

Microeletrodos guiada implantação de eletrodos no subtalâmica Núcleo de Ratos por longo prazo Estimulação Profunda do Cérebro

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...