Imagem foi realizada em um microscópio vertical confocal Leica SP5 localizado dentro das instalações FILM, do Imperial College London, gerido pelo Dr. Martin Spitaler. O suporte da amostra e capacete foi feito em colaboração com o departamento de Engenharia Química do Imperial College de Londres, com o conselho de Samuel Jones e Dr. Simon Schultz. Nicola Ruivo, Francisco Diaz e funcionários da CBS no Imperial College foram determinantes para a sua assistência e aconselhamento sobre a criação de mouse. Mark Scott é financiado pelo HFSP e cinema, Olufolake Akinduro por CRUK e Cristina Lo Celso por CRUK, KKLF, BBSRC e HFSP.

Todos os procedimentos que envolvam o uso de animais são realizados de acordo com a legislação local. Nosso trabalho é aprovado pela UK Home Office assim como o painel de avaliação ética do Imperial College. Os procedimentos autorizados estão descritos na documentação de licença do projeto e seguir as orientações que garantem o bem-estar do animal em todos os momentos. Certifique-se a aderir à legislação em matéria de experimentação animal do país, onde o trabalho é realizado. 1. Labeling e Injection de hspCs: <ol><li> Células colheita, como descrito por Lo Celso 14-15. </li><li> Preparar as células a uma concentração de 10 6 células / ml em PBS. NOTA: Use um hemocitômetro ou as informações fornecidas pelo classificador celular para contar as células; o número de células a ser marcado e injectado varia dependendo do tipo de célula (por exemplo mancha 10.000 - 20.000, hsc 100.000 - 300.000 HPCs); se trabalhar com menos de 10 5 células, ressuspender em 100 ul de PBS; é importante para ter as células em PBS sem soro, como soro inibe a coloração. </li><li> DiD Adicionar à suspensão celular numa concentração final de 5 uM e a suspensão imediatamente vortex para assegurar que o corante não precipitar da solução e deixar de rotular as células. </li><li> Incubar durante 10 minutos a 37 ° C, em seguida, lavar por centrifugação a 500 xg durante 5 minutos, decantação do líquido e ressuspender o sedimento em um volume apropriado de injecção IV (~ 100 - 150 ul) </li><li> Ressuspender as células em 200 ul de PBS e recolher para uma seringa de insulina. NOTA: uma seringa de insulina é recomendada durante uma seringa convencional porque não tem agulha espaço morto e, portanto, permite que a administração da suspensão de células inteira para o mouse. </li><li> Injectar as células num ratinho letalmente irradiados através de injecção na veia da cauda. NOTA: A irradiação tem conhecido, um impacto considerável no microambiente da medula óssea (ambos os componentes hematopoéticas e estromais), que se desenvolve ao longo time. Por isso, é muito importante para manter sincronismo consistente para irradiação, injeção de células (4 a 24 horas de irradiação para o melhor enxerto) e de imagem. Aqui irradiação é realizada de 6 horas antes da injeção e de imagem é realizado 20 horas após a injeção. <ol><li> Colocar o rato numa câmara quente (37 ° C) até que a veia da cauda parece vasodilatado. </li><li> Mova o rato para o limitador e cuidadosamente deslize a agulha na veia da cauda. </li><li> Injectar as células na veia - nenhuma resistência a injecção deverá ser encontrado. </li><li> Deixar o rato S / N, de modo a permitir que as células migram para os espaços de medula óssea. </li></ol></li></ol> 2 Preparando o mouse for Imaging <ol><li> Autoclave um par de pinças finas e um par de tesouras finas, bem como um capacete antes de usar e armazenar em um ambiente estéril. </li><li> Certifique-se de anestésico o mais fresco possível, (0,38 ml Ketamina + 0,25 ml Medetomidine + 4,47 ml de água). NOTA: otos anestésicos aprovados, incluindo o isoflurano eo outro injetável, será muito eficaz. O coquetel descrito é para ser administrado por via intraperitoneal em 0,1 ml por 10 g de peso corporal, com recargas de 30-50 ul administrados a cada 45 minutos a 1 hora. </li><li> Ligue o laser de dois fótons, se necessário, em seguida, iniciar o microscópio e software, a calibragem do palco quando solicitado. Ligue os lasers e permitir-lhes para se aquecer e estabilizar enquanto prepara o mouse para a imagem latente. </li><li> Anestesiar o rato utilizando a mistura do anestésico preparada (passo 2.2) para o anestésico escolhido por meio de injecção intraperitoneal. Monitorizar o início da anestesia profunda através do pedal do reflexo agora e em intervalos regulares durante todo o protocolo. NOTA: o mouse devem ser cuidadosamente monitorizados durante o processo e se a anestesia parece estar iluminando (normalmente após 45 - 60 minutos) e depois administrar uma dose top-up (conforme detalhado no 2.2). Esperar alguma variação entre os ratos de diferentes idades e sexo. É importante para discutir o protocolo de anestesia com o seu veterinário local para assegurar sejam tomadas precauções adequadas para assegurar o bem-estar do mouse. </li><li> Pincelar o topo do couro cabeludo, com etanol a 70% em um tecido, garantindo a não ficar qualquer etanol nos olhos do rato. </li><li> Usando fórceps e tesouras estéreis, remover cuidadosamente a porção central do couro cabeludo para expor a área de calvária a ser trabalhada: fazer uma pequena incisão na parte de trás da cabeça entre as orelhas, levantando-se a pele com fórceps. Enquanto mantém a pele para cima, a tesoura deslize sob a pele suavemente e cortar ao longo do lado de fora da área de imagem desejada. </li><li> Limpe o osso exposto com cotonete estéril umedecido com PBS estéril para mantê-lo úmido. </li><li> Coloque a peça de cabeça de metal no crânio do rato pronto para a imagem latente. <ol><li> Misturar uma quantidade adequada de cimento dentário de um barco de pesagem, até se obter uma pasta e aplicar rapidamente para a superfície inferior do capacete que se atribuem ao sKull. </li><li> Antes dos jogos de cimento, coloque o capacete sobre o crânio do mouse, certificando-se de não obter qualquer cimento dental na área de imagem, em seguida, esperar por ele para definir. </li><li> Aplique uma pequena quantidade de Intrasite hidrogel que mantém o crânio úmido. </li></ol></li><li> Prenda o capacete para o suporte e prenda no lugar com o parafuso, assegurando que as ranhuras caber dentro dos entalhes titular. </li><li> Retire o hidrogel do crânio com cotonetes estéril e limpo com PBS estéril, antes de se transferir para o microscópio. </li><li> Insira o suporte para o estágio do microscópio, posicione o tapete de aquecimento sob o mouse, inserir a sonda termômetro retal e segura tudo no lugar no palco com fita adesiva. </li><li> Coloque uma pequena gota de pomada oftálmica nos olhos do rato para garantir que eles não sequem enquanto sob anestesia. NOTA: o mouse não devem ser deixados sozinhos em qualquer momento durante o processo de imagem sob anestesia. </li></ol>in vivo de imagens: Pilhas de alta resolução e Time-lapse Aquisição <ol><li> Concentre-se no crânio através dos pedaços de olho. <ol><li> Preencha janela de imagem com purificada, água estéril e usando uma lente de imersão de água, abaixe-o para que ele toque a gota de água. </li><li> Concentre-se no topo do crânio utilizando as oculares de microscópio, utilizando uma lâmpada externa como a fonte de luz. </li><li> Posicionar a área de imagem no sutura central e mover para a parte traseira da cabeça para localizar a sutura coronária como uma posição de partida. </li></ol></li><li> Definir o microscópio para permitir a excitação eficaz e detecção dos fluoróforos relevantes especificadas na tabela de excitação e de emissão. NOTA: enquanto um confocal vertical Leica SP5 com uma cabeça de leitura galvanometer convencional rodando a plataforma de software LAS-AF é usado aqui, o procedimento pode ser facilmente replicado em outras plataformas microscópio / software. A lente usada aqui é a Leica HCX IRAPO L 25x W / 0,95 NA blentes equivalentes ut de outros fabricantes estão disponíveis com ampliação adequada e alta NA <ol><li> Coloque o software em um modo de capturar duas imagens XY, bem como um Z-stack 3D e definir a velocidade de imagem a 400 Hz e resolução de 512 x 512 pixels. NOTA: a configuração e hardware aqui resultará em um campo de visão de 620 um e isso pode variar em outras plataformas. </li><li> Defina o software de modo que vários canais / faixas são capazes de ser capturado, bem como assegurar que o método de coleta é definido para alterar as configurações entre as pilhas, se possível, ou entre quadros, no mínimo. Configure três configurações de captura independentes, desligando a iluminação a laser, no final de aquisição de cada pilha. NOTA: três canais será necessário para este procedimento para reduzir a interferência entre canais. </li><li> Configure as definições da primeira varredura seqüencial para o sinal de osso SHG dois fótons (840 nm de excitação; 400-440 nm de emissão); abrir o obturador para o laser MP e assegurar MGanho P e deslocamento são configurados corretamente, potência do laser é de 12,5 - 25% e que o laser é ligado. Selecione um PMT apropriado como o único detector e mudar a cor para branco. Nota: Os detectores NDD com filtros apropriados devem ser utilizados para a detecção de quando o osso disponível para atingir um sinal mais claro, mais profundo. </li><li> Repita o procedimento de configuração do canal utilizado para o canal de GFP para a autofluorescência combinado (543 nm de excitação; 560 - emissão de 600 nm) e fez (633 nm de excitação; 650-720 nm de emissão), sob as segundas configurações de digitalização, utilizando duas PMTs apropriadas. Mude o canal de cor para verde para a autofluorescência e vermelho para o fizeram. Nota: usando verde como o canal de auto-fluorescência permite a detecção mais fácil de células positivas quando fez os dois canais estão sobrepostos - células autofluorescentes aparecer como amarelo / laranja devido a estar em ambos os canais, enquanto que as células aparecem apenas como uma vez que eles só aparecem no vermelho DiD canal. O canal de auto-fluorescênciasó é usado para esta comparação e não é utilizado em qualquer análise final, no entanto, se o utilizador desejar, esta pode ser alterada para uma cor diferente para efeitos de visualização, para evitar a confusão com o canal de GFP. </li><li> Finalmente, a instalação da terceira e última varredura para GFP (488 nm de excitação; 500-530 nm de emissão); certificar-se de que o obturador está aberto, se necessário e em seguida, defina a potência do laser da linha de laser de 488 nm a cerca de 15% ou um nível adequado para o laser a ser utilizado, selecione um PMT apropriado como o único detector ativo e alterar o seu pseudo-verde. </li><li> Ativar um modo de imagem &quot;ao vivo&quot; para começar a digitalização de visualização do canal selecionado e ajuste de ganho do detector e Compensação da exposição ideal. Repita esse procedimento para cada varredura na janela seqüencial. </li><li> Salve as configurações desses scans multi-canal para facilitar a reutilização. NOTA: esta permite ao usuário recarregar as configurações nas sessões subseqüentes. </li></ol></li><li> Ative captura multi-posição, conhecido como &#39;Mark umnd Encontrar &quot;no software demonstrado, e redefinir os pontos de coordenadas. </li><li> Digitalizar área de imagem do osso, a partir do cruzamento entre a sutura central e coronal, digitalização a profundidade da área de medula óssea usando tanto autofluorescência (pseudo cor verde) e fez (pseudo-cor vermelha) com uma imagem composta. NOTA: As células autofluorescentes estará presente em ambos os canais aparecem laranja / amarelo na imagem composta enquanto que as células marcadas aparece como o vermelho-apenas as células na imagem composta. </li><li> Quando é detectada uma célula, marque-a como uma nova posição coordenada (x, y e z) no &quot;Mark and Find &#39;ferramenta clicando na janela&quot; Adicionar Novo ícone de posição no lado esquerdo da &quot;Mark and Find&quot; . </li><li> Quando o campo de vista atual foi examinado, passar a fase a distância de um campo de visão para a esquerda / direita / cima / baixo. Repita esse processo para cada campo de visão, trabalhando gradualmente em torno de toda a área da janela de imagem para a esquerda de the sutura central, movendo-se em direção ao nariz do mouse. Uma vez que a bifurcação sutura central é à vista, passar para o lado direito da sutura e repita o procedimento a digitalização do lado esquerdo no sentido inverso (ou seja, em direção à sutura coronal). Marque as coordenadas de todas as novas células de interesse pelo &quot;Mark and Find &#39;ferramenta. </li><li> Quando a digitalização da janela de imagem é completo, use o &quot;Mark and Find &#39;ferramenta para rever os pontos (selecione o ponto desejado e analisar cada ponto individualmente). Defina a parte superior e inferior de uma pilha Z em torno de cada célula para cada posição, (muitas plataformas de software permitirá que você execute z-stacks independentes para cada posição, o que reduz a captura de espaço vazio). Para cada ponto, o foco para cima e para baixo e definir posições Z superior e inferior para 3D captura z-stack e atualizar o ponto individual no &#39;Mark and Find &quot;. Definir intervalo de Z-Stack para 5m e uma média para cada canal de varredura seqüencial para a qualidade adequada: Linha oQuadro média r. NOTA: O aumento do número de exames a média aumenta o período de tempo de aquisição. </li><li> Adquirir uma pilha de referência de alta qualidade para cada ponto de interesse, iniciando todo o processo de digitalização (muitas vezes referida como &#39;Start&#39; em vez de &quot;Capture&quot;). Nota: Esta verificação pode funcionar como uma referência para a futura imagem de alta velocidade. </li><li> Após ter terminado com a digitalização de alta qualidade, activar uma definição de lapso de tempo para a captura. </li><li> Nas configurações de lapso de tempo, defina o intervalo de tempo para 5 minutos e tempo total de execução para o comprimento desejado (por exemplo, 5 h). &quot;Aplicar&quot; estas definições para a digitalização total. NOTA: para reduzir este tempo de verificação para permitir um intervalo de lapso de tempo de 5 minutos, pode-se necessário reduzir o número de exames utilizados para cálculo da média, limitar a resolução de 512 x 512 pixels, converter a digitalização para bidirecional (com correção de fase necessário para alinhar ambas as direções de varredura), e / ou aumentar a velocidade de verificação a 600 Hz ou mais (mais de 600Hz fará com que o zoom da área de imagem para a plataforma de software demonstrado). É também importante notar que, enquanto um modo de imagiologia sequencial foi usada para adquirir uma imagem de alta qualidade pilha inicialmente, a aquisição simultânea é utilizado para aumentar a velocidade durante a imagiologia de lapso de tempo - isto pode resultar em alguma ligeira a diafonia entre canais, que coloca adicional importância na captura inicial das pilhas de referência com precisão separados. </li><li> Começar de imagem (como antes, clicando no botão &#39;Iniciar&#39; no software demonstrado). NOTA: certifique-se de manter o nível adequado de anestesia pela administração de mais, doses menores quando necessário, tomando cuidado para não overdose o mouse, regularmente completar a água para garantir o objetivo não secar e monitorar os sinais vitais e temperatura de aquecimento-pad por toda parte. </li><li> Quando terminar, levante a lente do suporte e, em seguida, remova o suporte desde a fase de microscópio, assegurando os fios da sonda retal e hcomer tapete não estão danificados. </li><li> Desaparafuse o capacete do detentor do palco e remova cuidadosamente o mouse. Abater o mouse usando deslocamento cervical e remover a cabeça-peça de metal colocando-a fora do crânio. Salve os dados em disco e transferência de servidor para posterior análise. NOTA: A peça de cabeça é de preferência feita por meio de imersão em acetona durante algumas horas e finalmente a esfregar o cimento residual fora. </li></ol>

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There is nothing to disclose.

O que foi realizado? O protocolo usa imagem multi-dimensional de lapso de tempo para monitorar a migração de FACS purificado, ex vivo rotulados, hspCs transplantadas em camundongos medula óssea calvária. Identificação das células transplantadas único foi alcançado e estes foram monitorados ao longo de períodos prolongados de tempo (hr) com alta precisão. Respirar artefatos de movimento induzidos foram minimizados e as células foram reimaged repetidamente ao longo de um curso de tempo prolongado. Quais são os caminhos futuros? O desenvolvimento da técnica pode progredir para ensaios de recuperação, para permitir a imagiologia em vários dias, ao longo de uma semana ou mais, e o uso de gases anestésicos tais como o isoflurano para reduzir e simplificar o processo de recuperação para o rato (Nota: ensaios de recuperação requerem estritamente condições da cirurgia estéreis e administração de analgésicos apropriado). Devolvimento de uma maior paleta de cores de corantes in vivo, bem como a rotulagem genética eficiente de células hematopoiéticas também irá facilitar experiências múltiplas de rotulagem, fornecer mais conhecimento sobre as interacções célula-célula dentro da medula óssea e para permitir experiências mais complexas no futuro. Além disso, a rotulagem simultânea de estruturas de medula óssea múltiplas e componentes do estroma irá fornecer uma imagem mais completa dos eventos que ocorrem em nichos HSPC. Estabilidade de imagem dos filmes de lapso de tempo poderia ser melhorado preacquisition, estabilizando o microscópio ainda mais, bem como minimizar os gradientes de temperatura na amostra e pós-aquisição por meio de algoritmos de registro de imagem. Limitações: A técnica descrita apresenta algumas limitações. A sobrevivência de ratinhos após a administração de anestésicos injectáveis ​​é imprevisível e é muito fácil de complicações experiência, dependendo da resposta individual aoanestésico. Geralmente, quanto mais tempo uma sessão de imagens, mais difícil é para o mouse para recuperar da anestesia e por isso é importante planejar com cuidado se o rato está a ser recuperado, o ideal é limitar a duração do tempo de lapso de imagem. O uso de anestésicos injetáveis ​​limita o tempo de cada sessão de imagens pode durar. Embora seja possível para prolongar a anestesia por readministrar uma dose menor de anestésico, é difícil executar esta precisão e uma overdose o mouse é uma das causas mais freqüentes de cessação antecipada de imagem in vivo. Anestesia gás é menos tóxico e permite uma sessão de imagens mais inicial, porém rápida recuperação do mouse depois de&gt; 2 horas longa administração de isoflurano raramente é bem sucedida. Outra limitação desta técnica é o limite de resolução de imagens que podem ser obtidos durante a multi-ponto de lapso de tempo de imagem, em virtude da necessidade de adquirir imagens rapidamente. Isso, juntamente com desvio de foco ou campo saltos (discoussed acima), pode fazer o rastreamento de células difícil. Comparação com métodos alternativos: HspCs são geralmente marcadas com o corante lipofílico fez, mas dir e DII corantes são alternativas equivalentes e outros corantes celulares podem ser utilizados, desde que suficientemente brilhante, como revisto em [16]. Mesmo ex vivo marcação das células com DID tem sido demonstrado que não afectam a função a longo prazo de HSCs, que tem a limitação de que DiD (ou qualquer outro corante químico) é diluída depois da divisão celular. Desde HSCs proliferar durante os primeiros dias após o transplante, a relação sinal-ruído para as células deteriora-se rapidamente. Rotulagem endógena de células por meio de manipulação genética e expressão de proteínas fluorescentes é um método viável, alternativo, enquanto as proteínas fluorescentes são expressos em níveis suficientemente elevados para gerar sinal detectável através do osso do crânio. Há um número de tecnol alternativaiques disponíveis para realizar imagem de hspCs dentro do espaço da medula óssea, cada uma com suas próprias vantagens e limitações. A inserção de dispositivos de imagem baseada em fibra óptica permitido para imagens de reconstituição da medula óssea em ossos longos [8], enquanto a imagem confocal após a exposição cirúrgica da tíbia e afinamento do esmalte óssea com uma broca cirúrgica [12] produziu imagens detalhadas de hspCs residente em as áreas periféricas dos ossos longos. Esses métodos, porém, são muito mais invasivo do que o descrito aqui e, portanto, não permitem a repetir as sessões de imagem com foco na mesma área da medula óssea dentro do mesmo mouse. Além disso, é possível que estas técnicas podem afectar as células observadas tendo em conta a resposta inevitável danos extensos no tecido circundante. HspCs foram fotografada por curtos períodos de tempo através de lamelas colocadas sobre excisadas, fêmures fraturados [11], no entanto, o impacto dessa preparação dura do tecido em hspCs não é clear ea técnica foi utilizada unicamente para obter observações pontuais vez. Ossos fixos foram seccionados em cortes seriados, com detalhes, e as imagens obtidas reconstruídas em um modelo 3D, proporcionando excelente resolução 3D, especialmente quando são utilizados moldes vasculares [17] e, recentemente, Laser Scanning Citometria (LASC) tem sido usado para obter quantitativa medidas sobre hspCs in situ, com destaque para imunomarcação [18], mas são incapazes de fornecer qualquer informação temporal sobre o comportamento das células. As técnicas descritas nesta nova técnica de proporcionar uma combinação de boa resolução em 3D, amostragem temporal suficiente para monitorar as células em 4D e são relativamente não-invasivo, por conseguinte, oferecer uma abordagem ideal para atingir controlo a longo prazo de hspCs interagindo com a medula óssea microambiente.

Apesar de nichos de células estaminais terem sido reconhecido há décadas 3 e bem caracterizados em vários tecidos, tais como o bolbo olfactivo, fibra muscular, bojo folículo piloso ou CNS zona subventricular 4-7, as interacções entre as células hematopoiéticas estaminais (HSCs) e microambiente da medula óssea ( BM) são ainda mal compreendido, devido à dificuldade de observar directamente através de células individuais do osso, bem como a natureza extremamente fluido do próprio tecido. Tem sido demonstrado, por meio de um número de estudos funcionais baseados em ablação ou sobre-expressam genes específicos em qualquer HSCs ou as células estromais do próprio microambiente, que uma rede complexa de diferentes tipos de células e os sinais reguladores é responsável por regular o equilíbrio delicado entre a quiescência , proliferação, diferenciação e expansão de HSCs 1-2. O crosstalk entre HSCs e seus nichos podem ser compreendidas em profundidade apenas através da observação direta. Este é achgraças ievable para o desenvolvimento de protocolos avançados de imagem, combinando a tecnologia disponível não só em termos de microscopia, mas também de soluções de suporte da amostra e do software de aquisição. Resolução de uma única célula de imagem ao vivo de células estaminais progenitoras hematopoiéticas e transplantados (hspCs) na BM compartimento dos ossos calvária de ratinho mostrou que hspCs enxertar localizar na proximidade de vasos SDF-1 e VCAM-1-positivos, 8-9 e que as células mais imaturas encontram-se dentro de 15 - 20 micra de células osteoblásticas GFP positivas (Col2.3-GFP linha de rato transgénico, em que o promotor de colagénio 1α restrição osteoblastos dirige a expressão da GFP), enquanto a sua descendência são mais distal 10. Observações semelhantes foram obtidos a partir dissecados e fraturado ossos do fêmur e dos ossos 11 tibeal diluído 12. Imagens de medula óssea calvária permanece a abordagem menos invasiva para alcançar a visualização direta de hspCs dentro thmicroambiente nativo eir. Com qualquer imagem espécime vivo há uma necessidade inerente de manter a amostra o mais imóvel possível para evitar qualquer tipo de artefato desnecessários devido ao movimento da amostra. A respiração faz com que os movimentos oscilatórios da cabeça do rato, que precisam ser evitados na obtenção de imagens de medula óssea calvária. Titulares estereotáxicos convencionais, usados ​​por exemplo para imagiologia cerebral e de eletrofisiologia, não são adequados para a imagem latente calvarium porque obstruir os ossos frontais. A partir de um suporte de rato usado para minimizar o sofrimento durante o exame e eletrofisiologia estudos ao vivo 13, o titular da 2 componente foi desenvolvido, com um pequeno pedaço fixado na cabeça do mouse para criar uma janela de imagem ligada a um braço maior garantia de manter estável com um placa de base pesada que assegura firmemente no estágio do microscópio. Protegendo a peça de cabeça para o crânio do mouse permite a respiração livre, enquanto ainda imobilizar a cabeça no lugar e eliminando adequadamente movements devido à respiração. Um mecanismo de &quot;fechadura e chave&quot; que liga a cabeça de peça para o corpo de suporte permite que o tamanho da janela para ser minimizados, bem como o aumento da precisão de posicionamento, por conseguinte, simplificar a cirurgia, e o ajuste da placa de base na fase de permite um alinhamento preciso do microscópio. Para monitorar com precisão células móveis, um protocolo de lapso de tempo multi-ponto foi projetado para permitir o rastreamento de células ao longo do tempo com intervalos de 5 min entre os períodos. HSCs Aqui, fez marcados são injetadas em ratos repórter col2.3GFP osteoblasitc 10,14 e fotografada, aproximadamente, 20 horas mais tarde. O titular do rato que foi concebido e as configurações de imagem necessários para realizar uma rápida multi-ponto de lapso de tempo de imagem das mesmas áreas ao longo de um período de horas múltipla são descritos em detalhe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine(Narketan 100mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:119px;">407575 0107 C</td>
			<td style="width:167px;">Other anesthetics may be used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Medetomidine(Domitor 1mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Elanco</td>
			<td style="width:119px;">134800-2</td>
			<td style="width:167px;">Other analgesics may b used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Vibrant DiD cell labeling solution</td>
			<td style="width:71px;">Roche Products Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">V22887</td>
			<td style="width:167px;">Other colors are available and may be used if required.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lacrilube ophtalmic ointment</td>
			<td style="width:71px;">Allergan</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">avaliable by prescription by the local vet</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Kemdent &#34;Diamond Carve&#34; glass ionomer cement</td>
			<td style="width:71px;">Associated Dental Products Ltd. via Kemdent</td>
			<td>SUN527</td>
			<td style="width:167px;">We use shade A3, but any shade of cement can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sterile water</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Insulin syringes</td>
			<td style="width:71px;">Terumo Medical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">SS10M3109</td>
			<td style="width:167px;">1mL, 31G</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">340031</td>
			<td style="width:167px;">Cone type (small)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Autoclaved forceps and scissors</td>
			<td style="width:71px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AGT577 
			AGT5034</td>
			<td style="width:167px;">Iris scissors - 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Weigh boat and cement stirrer</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>611-1996/231-0370</td>
			<td style="width:167px;">5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td>Not available</td>
			<td style="width:167px;">Call for quote</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506323</td>
			<td style="width:167px;">HCX IRAPO L lens</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Custom designed mouse holder</td>
			<td style="width:71px;">Imperial College Engineering Workshop</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">See Figure 1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Heating pad with rectal thermometer probe</td>
			<td style="width:71px;">BASi Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502</td>
			<td style="width:167px;">Heat mat/ Control box/ Thermometer probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow

Através de um delicado equilíbrio entre a quietude ea proliferação, auto-renovação e produção de progênie diferenciada, as células-tronco hematopoéticas (CTH) manter o volume de negócios de todas as linhagens de células sanguíneas maduras. A coordenação dos sinais complexos que levam a destinos específicos HSC depende da interação entre HSCs e microambiente da medula óssea complexo, que ainda é pouco compreendida [1-2]. Descrevemos como pela combinação de um suporte de amostra recentemente desenvolvido para o posicionamento dos animais estável com confocal multi-passo e de dois fotões, em técnicas de imagiologia in vivo, é possível obter pilhas 3D de alta resolução contendo hspCs e seus nichos circundantes e controlá-los ao longo do tempo através de vários pontos de lapso de tempo de imagem. Imagem de alta definição permite detectar ex vivo de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas rotulados (hspCs) residentes dentro da medula óssea. Além disso, vários pontos de time-lapse de imagens 3D, obtained com configurações de aquisição mais rápidos, fornece informações precisas sobre o movimento HSPC e as interações recíprocas entre hspCs e células do estroma. Rastreio de hspCs em relação às células osteoblásticas positivo para GFP é mostrado como um exemplo de aplicação do presente método. Esta técnica pode ser utilizada para rastrear qualquer hematopoiético estromal ou célula marcada de forma apropriada de interesse dentro do espaço da medula óssea do rato calvária.

O costume fez, titular do mouse de alta precisão, incluindo uma janela de imagem calvarium permite imagens prolongado de FACS purificados hspCs, rotuladas injetadas em ratos receptores letalmente irradiados (Figura 1A). Tipicamente, após a injecção de entre 15-20000 células marcadas, 8 a 15 células são normalmente reconhecidas dentro da área de imagem da medula óssea do crânio no dia seguinte. Aqui é mostrado como adquirir resolução célula pilhas 3D únicos de HSPC contendo áreas de medula óssea de aproximadamente 90-120 espessura um, (Figura 1B), seguido por filmes dos hspCs identificados (Figura 1C e filme) lapso de tempo 4D. Resultados sub-óptimos são obtidos se o cimento dental não é optimamente preparada, por exemplo, a água pode vazar a partir de áreas não seladas, e mesmo que ela pode ser carregada a partir da parte superior do suporte, de qualquer período de tempo em que a lente não é mergulhado em água leva a preto f<html> Rames. Alguns deriva nas imagens é inevitável devido à expansão térmica dos materiais de suporte do mouse, no entanto, pode ser acentuada pela aderência de cimento abaixo do ideal, levando ao descolamento progressivo do mouse, e por perturbações da imagem criada, levando a mudanças súbitas do foco durante o exame de lapso de tempo. Deriva durante multi-ponto de lapso de tempo de imagem também pode ser causada por imprecisões nos movimentos de palco quando revisitar posições previamente trabalhada. Deriva e gaguejar artefatos em filmes de lapso de tempo pode ser corrigida por meio de algoritmos de registro de imagem. Tabela 1 Excitação e configurações de emissão. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td style="width:204px;"> Cor Canal </td><td style="width:213px;"> Excitação </td><td style="width:208px;"> Emissão </td></tr><tr><td style="width:204px;"> GFP </td>13px; &quot;&gt; 488 nm </td><td style="width:208px;"> 500-530 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> Autofluorescência </td><td style="width:213px;"> 543 nm </td><td style="width:208px;"> 560-610 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> DiD </td><td style="width:213px;"> 633 nm </td><td style="width:208px;"> 640-700 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> SHG </td><td style="width:213px;"> 840 nm (MP) </td><td style="width:208px;"> 400-450 nm </td></tr></tbody></table><img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51683/51683fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1 in vivo 4D de hspCs no rato calvária. Células exemplos de resultados obtidos (B) fatias 2D a partir de uma pilha 3D (profundidade total é de 114 mm), contendo sinal do osso colágeno (branco), fez marcados (vermelho) - (A) Esquema do experimento (C B).. , cel autofluorescentls (amarelo) e osteoblastos (verde). Barras de escala: 100 mm fatias (C) 2D a partir de um filme de lapso de tempo 4D mostra uma fez marcado HSC (vermelho), que migram na proximidade de células osteoblásticas (verde).. A linha pontilhada destaca o deslocamento da célula. Barras de escala: 50 mm (B) e 100 um (de C). NOTA:. O filme obtido a partir da aquisição de lapso de tempo em (C) é mostrada durante o artigo de vídeo <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51683/51683fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

A natureza das interações entre células tronco e progenitoras hematopoéticas (hspCs) e nichos de medula óssea é pouco compreendido. Modificações de hardware personalizado e um protocolo de aquisição multi-passo permite o uso de dois fótons e microscopia confocal a imagem ex vivo hspCs rotulados hospedados dentro de áreas da medula óssea, as interações de rastreamento e movimento.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

13.7K visualizações.  Imperial College London.  A natureza das interações entre células tronco e progenitoras hematopoéticas (hspCs) e nichos de medula óssea é pouco compreendido. Modificações de hardware personalizado e um protocolo de aquisição multi-passo permite o uso de dois fótons e microscopia confocal a imagem ex vivo hspCs rotulados hospedados dentro de áreas da medula óssea, as interações de rastreamento e movimento. 

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Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Transplante de Medula Renal inteiro em Zebrafish Adulto

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biologia

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

Homing das células hematopoiéticas da medula óssea

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolamento e expansão em grande escala de Adulto Humanos endotelial Colony Células Progenitoras Forming

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

Osteoclastos Derivação do mouse Medula Óssea

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

Melhorando a exatidão da avaliação cytometric do fluxo do potencial mitochondrial da membrana em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor através da inibição de bombas do Efflux

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

In Vivo Imagem de dois fótons de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their energetic needs. However, under stress conditions such as infection or blood loss, HSCs become proliferative and rapidly produce downstream progenitor cells, which in turn further differentiate, ultimately producing mature blood cells. During this transition and differentiation process, HSCs exit from quiescence and rapidly undergo a metabolic switch from glycolysis to oxidative phosphorylation (OxPHOS). Various stress conditions, such as aging, cancer, diabetes, and obesity, can negatively impact mitochondrial function and thus can alter the metabolic reprogramming and differentiation of HSCs and progenitors during hematopoiesis. Valuable insights into glycolytic and mitochondrial functions of HSCs and progenitors under normal and stress conditions can be gained through the assessment of their extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which are indicators of cellular glycolysis and mitochondrial respiration, respectively. 
Here, a detailed protocol is provided to measure ECAR and OCR in mouse bone marrow-derived lineage-negative cell populations, which include both hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs), using the extracellular flux analyzer. This protocol describes approaches to isolate lineage-negative cells from mouse bone marrow, explains optimization of cell seeding density and concentrations of 2-deoxy-D-glucose (2-DG, a glucose analog that inhibits glycolysis) and various OxPHOS-targeted drugs (oligomycin, FCCP, rotenone, and antimycin A) used in these assays, and describes drug treatment strategies. Key parameters of glycolytic flux, such as glycolysis, glycolytic capacity, and glycolytic reserve, and OxPHOS parameters, such as basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP production, spare respiratory capacity, and coupling efficiency, can be measured in these assays. This protocol allows ECAR and OCR measurements on non-adherent HSPCs and can be generalized to optimize analysis conditions for any type of suspension cells.

The method presented here summarizes optimized protocols for assessing cellular bioenergetics in non-adherent mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs) using the extracellular flux analyzer to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of HSPCs in real time.

Avaliação de Bioenergésicos Celulares em Tronco Hematopoiético de Camundongos e Células Progenitoras Primitivas usando o Analisador de Fluxo Extracelular

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...