The authors thank Dr. Amir Rattner for helpful comments on the manuscript. Supported by the Howard Hughes Medical Institute.

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. Todos os animais foram tratados de acordo com cuidados com os animais institucional e uso comitê aprovou (IACUC) protocolo MO11M29 das Instituições Médicas de Johns Hopkins. Consulte as diretrizes do Comitê Animal Care e Use Institucional locais para métodos aprovados de eutanásia. Use luvas, jaleco e óculos de segurança ao manusear fixadores aldeído ou solventes orgânicos. 1. Preparação de Materiais <ol><li> Derramando Placas Sylgard <ol><li> Seguir as instruções do fabricante, misturar o agente de cura com a base, e agita-se com uma vareta de plástico. </li><li> Pipeta ~ 35 ml Sylgard líquido por 10 cm de diâmetro de cultura de tecidos prato. Placas de cultura de tecido são mais profundos do que os pratos bacterianos padrão; isso proporciona folga vertical para os pinos de insetos. </li><li> Coloque o diela está numa superfície horizontal, à temperatura ambiente durante a noite. As bolhas formadas durante a mistura irá desaparecer. </li><li> Após a polimerização, armazenar as placas de Sylgard à temperatura ambiente. NOTA: placas Sylgard pode ser armazenada à temperatura ambiente durante anos e re-utilizada várias vezes até que o Sylgard destaca do prato. </li></ol></li><li> Soluções <ol><li> Benzoato de benzilo e álcool benzílico (BBBA). Misturar 2 volumes de benzoato de benzilo e 1 volume de álcool benzílico. Loja no escuro em um frasco de vidro com tampa de vidro ou Teflon superior. CUIDADO: Usado BBBA devem ser adequadamente tratados como resíduos de solventes orgânicos. Não permita que BBBA entrar em contato com plástico. </li><li> Salina tamponada com fosfato (PBS). Adiciona-se 4 g de PFA a 80 ml de água, adicionar 0,1 ml de NaOH 1 N, agita-se em uma placa quente a ~ 70 ° C durante ~ 5 min, até a PFA esteja completamente dissolvido, e depois adicionar 10 ml de 10x PBS e levar o volume até 100 ml com água. ATENÇÃO: A inalação de formaldeído / PFA e BBBA vapores deve serminimizado, mantendo estas soluções em recipientes cobertos. Formaldeído / PFA é uma substância cancerígena. </li><li> Oil Red O. Prepare um estoque de 0,5% em isopropanol. Imediatamente antes da utilização diluída com água para uma concentração final de 0,3% de óleo Vermelho O, e depois filtrar através de um filtro de 0,2 um. </li></ol></li></ol> 2. Dissecção da pele, fixação e Clearing <ol><li> Dorsais pele para Imunocoloração e Melanina Imagem <ol><li> Por muito jovem camundongos (por exemplo, os fetos e dia pós-natal (filhotes P) 0-P3), eutanásia os ratos por inalação de isoflurano. Eutanásia ratinhos mais velhos por inalação de isoflurano ou por injecção de cetamina / xilazina, seguido por deslocação cervical. </li><li> Remova o cabelo com um barbeador elétrico e remoção gel de cabelo. Para ratos mais jovens do que P8, esta etapa pode ser ignorada. </li><li> Use uma lâmina de barbear para fazer um corte horizontal da base da cauda, ​​ao longo de cada um dos flancos, que passa no lado dorsal da base de cada membro, procedendo lateral aos ouvidos e finalção no nariz. </li><li> Descascar delicadamente a pele do tecido subjacente processo de posterior para anterior, mantendo a pele entre os dedos enluvados para que ele não fique prensado por fórceps. Ao descolar da pele ao nível das orelhas, primeiro cortar as orelhas com um par de tesouras e de proceder especialmente lentamente como a pele pode rasgar neste local. </li><li> Deste ponto em diante, orientar a pele com o interior voltado para cima. Pin a pele para Sylgard com ~ 20 pinos de insetos uniformemente espaçados em torno da periferia; não o excesso de esticar a pele (Figura 2B). Cobrir a pele com 10-20 ml de PBS. </li><li> Dissecar a gordura associada à pele e do tecido conjuntivo, utilizando um fórceps angulares ou curvadas, com a ponta do fórceps enfrentam horizontalmente para minimizar o risco de que a pinça irá penetrar a pele. Extrude as bolhas de ar que foram presos sob a pele delicadamente rolando um aplicador com ponta de algodão sobre a superfície da pele. NOTA: Se a pele está acontecendopara ser utilizado para a imunocoloração plana de montagem ou histoquímica, remover tanto do tecido conjuntivo que possível; se a pele que vai ser usado para visualizar os folículos capilares com base na pigmentação de melanina, a remoção de menos completa do tecido conjuntivo é satisfatória. Pele pré-natal requer o mínimo de &quot;limpeza&quot; de tecido conjuntivo aderente. </li><li> Fixar a pele presa através da adição de 20 ml de preparado de fresco a 4% PFA / PBS ou 10% de formalina tamponada por placa de 10 cm Sylgard (se a pele vai ser utilizado para imagiologia de melanina ou fosfatase alcalina (AP) histoquímica) ou 20 ml de preparado de fresco 2% PFA / PBS (se a pele vai ser utilizado para a imunocoloração ou visualizar transgénico queratina (Krt) 17-GFP 11) e rode suavemente durante a noite num quarto frio. No dia seguinte, lava-PBS durante&gt; 10 min. NOTA: formalina padrão é de 37% de formaldeído; portanto, &quot;10% de formalina&quot; é de 3,7% de formaldeído. </li><li> Para a coloração AP e imunocoloração, continue na Seção 3. Para melanina imagção, desidratar a pele por meio de uma série de etanol graduada (70%, 95%, 100%), de um dia para cada passo, com rotação horizontal suave à temperatura ambiente. Remover tecidos conjuntivos residuais. </li><li> Com a pele em etanol a 100%, remover os pinos de insectos e, se desejado, cortar a pele, com uma tesoura para remover a maior parte periférica de 1-2 mm da pele com os furos de pino. </li><li> Transferir a pele de 10 cm de diâmetro prato de vidro, colocar duas lâminas de vidro sobre a pele para evitar que se enrolem, e adiciona-se 20 ml de BBBA. BBBA endurece rapidamente o tecido de modo que é importante para a pele a ser achatada sob o peso das placas de vidro antes da adição da BBBA. </li><li> Durante as próximas horas, levante os slides fora da pele por alguns segundos para permitir que o BBBA para lavar a pele. NOTA: Usar luvas ao trabalhar com BBBA. Dependendo da idade e do local da pele que podem ser tanto quanto 30% de encolhimento em BBBA. </li></ol></li><li> Pé de pele de Análise de folículo piloso Patterning NOTA: O intervalo de idades normalmente examinados é P1-P8. <ol><li> Após a eutanásia, cortar os pés acima da articulação do tornozelo e fazer um único corte reto ao longo da superfície ventral através das solas dos pés. </li><li> Suavemente tirar a pele a partir do tecido subjacente, Procedendo de proximal para distal. </li><li> Cortar os dígitos para libertar a pele e fixá-lo ao Sylgard com a superfície interior voltada para cima (Figura 2C). Há tecido conjuntivo mínimo na pele do pé. </li><li> Transgênicos Krt17-GFP pele já está pronto para a imagem latente. Para imagens melanina prosseguir com a fixação, desidratação e BBBA compensação conforme descrito na seção 2.1. </li></ol></li><li> Pé de pele para visualizar Glândulas sebáceas <ol><li> Após a eutanásia, remova o cabelo esfregando cabelo removedor de gel sobre a superfície da pele com um dedo de luva e polegar; esperar por 10 min. NOTA: Não use um barbeador elétrico, que irá danificar a delicada pele do pé. </li><li> Wcinzas da superfície da pele com água da torneira, dissecar e fixar a pele para Sylgard como descrito na seção 2.2. </li><li> Fixar com 1% PFA / PBS durante 30 min à temperatura ambiente e depois lavar com PBS. NOTA: Para visualizar as glândulas sebáceas nos pés, que se desenvolvem após a primeira semana pós-parto, a idade ideal para a análise com Oil Red O P21 é, porque isso marca o nadir da pigmentação do cabelo durante o primeiro ciclo do cabelo 12, e, portanto, as glândulas sebáceas pode ser visto mais facilmente. Com camundongos albino esta análise pode ser realizada em qualquer idade. Para obter albino progênie cruzada ratos mutantes pigmentada a uma linha mutante tirosinase como C57BL/6J-Tyr c-2J. </li></ol></li><li> Preparação da pele da cauda para a Análise da Distribuição melanina, folículo piloso Orientação e glândula sebácea Visualization <ol><li> Após a eutanásia, fazer um corte circular em volta da base da cauda, ​​e, em seguida, uma fenda longitudinal que atravessa o comprimento da cauda ao longo da sua face ventral. </li> &lt;li&gt; Retire a pele da cauda a partir de ponta de agarrar firmemente a ponta da cauda, ​​osso e / ou tecido conjuntivo com um par de pinças e com a pele de um segundo par de fórceps. Pin a pele da cauda para Sylgard. </li><li> Para a análise da distribuição da melanina e orientação folículo piloso, corrigir e processar a pele como descrito na seção 2.1. Para a análise das glândulas sebáceas, a pele da cauda cortada em uma série de segmentos de ~ 0,5 a 1 cm de comprimento, antes da fixação e incubar os pedaços de pele em mM EDTA PBS / 5 durante a noite a 37 ° C para enfraquecer a derme-epiderme adesão 13. </li><li> Descascar delicadamente a epiderme da derme, o pino da epiderme para Sylgard (face up interior), e corrigi-lo em 4% PFA / PBS por 1 hora em temperatura ambiente. Lava-se com PBS, e são coradas com Oil Red O, tal como descrito abaixo. Observação: Uma máquina de barbear eléctrica e / ou remoção de gel para o cabelo pode ser usado antes da dissecação mais velhos pele da cauda (por exemplo, P21), mas este tratamento é opcional uma vez que o cabelo na cauda não étão densa como em qualquer outra parte do corpo. </li></ol></li></ol> 3. Reações de Coloração <ol><li> Placenta humana de fosfatase alcalina (AP) histoquímica para Visualizar geneticamente marcado Axon mandris 10,14,15 (Figuras 3A, B) <ol><li> Após fixação em PFA Sylgard, coloque peles fixados em de 10 cm prato de vidro e submergir sob PBS / 1 mM MgCl2. Suavemente rodar o prato em um banho de água a 70 ° C durante 90 minutos para destruir a actividade de fosfatase endógena. </li><li> Visualizar a actividade repórter AP histoquimicamente com 4-48 horas de incubação à temperatura ambiente, em 0,1 M de Tris, pH 9,5, 0,1 M de NaCl, 50 mM de MgCl2, 0,34 mg / ml de NBT, e 0,175 ug / ml BCIP, tipicamente usando 10-15 ml de solução de coloração por pele dorsal P21. Monitorar a reação sob o microscópio de dissecação, tomando cuidado para não deixá-lo prosseguir para além do tempo ideal, a julgar por inspeção visual da coloração axônio intensidade relativa à deposição de NBT inespecífica. </li&gt; <li> Parar a reacção de lavagem com três mudanças de PBS/0.1% Tween-20 ao longo de 1 hora, re-pin as peles para Sylgard, desidratar as peles através de uma série de etanol, em seguida, transferir os skins para uma placa de 10 cm com BBBA. NOTA: BBBA dissolve lentamente o precipitado NBT. Durante as primeiras horas em BBBA, um fundo multa de precipitado NBT irá dissolver; como resultado, a solução BBBA vai escurecer, ea pele vai clarear. Mude para BBBA fresco depois de algumas horas. </li><li> Depois de imagens do AP-pele manchada, transferi-lo para o etanol para&gt; de 1 hora à temperatura ambiente e, em seguida, armazená-lo em etanol fresco à temperatura de -20 ° C. Peles AP-coradas pode ser armazenado nesta forma durante meses sem qualquer perda de sinal. </li></ol></li><li> Oil Red O Coloração para Visualize Glândulas sebáceas 4 (Figuras 3C-F) <ol><li> Retirar os pinos de insetos e transferir o pé levemente fixado ou peles cauda a partir da placa Sylgard para os poços de uma placa de 6 poços de cultura de tecidos, com a-se a duas amostras de pele por poço. Lava-se com 60:40 de isopropanol: água, durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Mancha em 2 ml de 0,3% Oil Red O em 60:40 isopropanol: água (ver secção 1.2) à temperatura ambiente por 2 horas. </li><li> Lava-se com 60:40 de isopropanol: água, durante 5 minutos à temperatura ambiente, seguido por uma lavagem com água. Aparar cuidadosamente as arestas da pele, incluindo os furos de pino, com uma tesoura fina de modo a que a superfície da pele pode ser feita tão plana quanto possível. </li><li> Coloque a pele em um slide com a superfície externa voltada para cima, adicione algumas gotas de água ou meio de montagem aquoso, cobrir a pele com uma lamela, e depois gravá suavemente a lamela para o slide para achatar ainda mais a pele. </li></ol></li><li> Monte Plano Imunocoloração 4,16,17 (Figura 3G, H) <ol><li> Corte um retângulo de pele PFA fixo (por exemplo, um centímetro x 0,5 cm), marcando a sua orientação com um corte assimétrico (por exemplo, o clipe de canto anterior direito). Realizar a incubação elavar passos com a rotação suave em uma plataforma horizontal de rotação. Nos poços de uma 6 - ou 12 poços da placa de cultura de tecidos, lavar várias vezes com PBS para remover o PFA residual, lavou-se com ~ 10 mudanças de PBS com 0,3% de Triton X-100 (0,3% PBST) durante 5-8 horas a temperatura ambiente, para permeabilizar a pele. </li><li> Incubar com anticorpo primário em PBST 0,3% com 5% de soro de cabra e 20% de DMSO, durante cinco dias à temperatura ambiente. Cubra os poços da placa com fita adesiva transparente ou plástico adesivo para eliminar perdas por evaporação. </li><li> Lava-se com 10-15 mudanças de 0,3% PBST durante 5-8 hr e incubar com o anticorpo secundário em PBST 0,3% com 5% de soro de cabra e 20% de DMSO durante 3 dias à temperatura ambiente. </li><li> Lava-se com 10-15 mudanças de 0,3% PBST mais 5-8 horas. </li><li> Desidratar em 25%, 50%, e 75% de metanol durante 5 minutos cada e depois 3x em metanol a 100% durante 20 min cada. </li><li> Limpar em BBBA noite à temperatura ambiente. NOTA: Plano de montagem imunocoloração de pele mais jovem do que~ P1 pode ser executada como descrito acima, mas com mais curto de incubação e lavagem vezes. Por exemplo, P1 pele pode ser imunocoradas com uma incubação durante a noite no anticorpo primário e um várias horas de incubação em anticorpo secundário, e com a intervenção de lavagens apenas 2-3 h em 0,3% de PBST. Como observado acima, as peles jovens são também suficientemente finas que podem ser visualizados sem BBBA compensação. </li></ol></li><li> Visualizando Merkel grupos de células com Nerve fluorescente Terminal Dye Captação (Figuras 3I-L) AMI-43 (verde) e AM4-65 (vermelho) são corantes fluorescentes solucionáveis ​​que entram as células via não-seletivo do canal de cátions 18. Na pele viva estes corantes são tomados selectivamente se e concentrou-se em células de Merkel. <ol><li> Dissolve-se 1 mg AM1-43 ou AM4-65 em 2 ml de PBS e armazenar-se em aliquotas a -80 ° C. </li><li> Injetar filhotes recém-nascidos por via subcutânea com 2-10 mg de corante por grama de peso corporal usando uma agulha G 29. </li><li> Um dia depois, a eutanásia os ratos e divulCT peles dorsais. </li><li> Corrigir as peles em PFA 4% / PBS a 4 ° C durante a noite, lavar com PBS, e montar a pele como descrito na seção 3.2. </li></ol></li></ol> 4. Imagem e Análise de Imagem <ol><li> Imagiologia Orientação folículo piloso (Figura 4) <ol><li> Use de um microscópio de dissecação para dorsal da imagem, pé, ou peles de cauda que estão submersos em BBBA, achatada sob uma lâmina de vidro, e ainda no prato de vidro - esta abordagem minimiza a contaminação BBBA do microscópio. </li><li> Iluminar o prato abaixo. Para minimizar a variação espacial da intensidade de luz em todo o campo de visão, elevar o prato de vidro para uma altura de ~ 10 cm acima da superfície de trabalho normal do microscópio de dissecação e colocar um difusor de plástico ou chapa de vidro ao longo da fonte de luz. </li><li> E volta a pele de etanol a 100% para o armazenamento a longo prazo a -20 ° C. NOTA: Deixar a pele em BBBA por mais de um dia faz com que os grânulos de melanina para quebrar umparte. Uma vez que a pele foi tratada BBBA ele vai endurecer e permanecer estáveis ​​a partir desse ponto em diante. Diferentes peles pode ser codificada com uma série de entalhes na sua anterior e / ou posterior termina, de modo a que possam ser juntos armazenar, para economizar espaço no congelador. </li></ol></li><li> Imagem e Rastreamento Axon mandris (Figuras 3A, B) <ol><li> Coloque AP manchado da pele (seção 3.1.3) entre duas placas de vidro, do tipo usado para pequenas géis de proteína. Evite a introdução de bolhas de ar entre as placas e da pele, e, então, cuidadosamente pavio fora qualquer excesso BBBA com uma toalha de papel. Colocar a placa de sanduíche de pele de placa em um estágio de microscópio (Figura 2D). </li><li> Use de campo claro ou DIC iluminação com uma objetiva de 10X e 2 m ou 5 m Z-passos. Use um estágio XY mecanizada para capturar uma montagem de imagens XY que são costuradas juntas para criar um único conjunto de dados tridimensional em escala de cinza. NOTA: Para uma única grande caramanchão axônio, este conjunto de dados pode ser umé maior do que 5 GB. </li><li> Realize manual, automático ou semi-automático de rastreamento de pavilhões axônio com qualquer um de uma variedade de pacotes de software. ATENÇÃO: Software como Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) é uma ferramenta de reconstrução neuronal gratuito que é executado em um ambiente de PC e é relativamente fácil de dominar 10. </li></ol></li></ol>

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Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Aal Ert&#252;rk, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Domínio dos métodos de dissecação descritos acima requer apenas paciência, uma mão firme, e algumas boas ferramentas de dissecação. A pele dissecção dorsal é relativamente fácil, mas a cauda e pele pé dissecações - especialmente em idades pós-natais - são mais exigentes. Em idades precoces pré-natal (por exemplo, antes de E15), a pele é difícil de remover, sem rasgá-la. Convenientemente, para muitos estudos de crescimento e padronização de estruturas da pele em ratos, os eventos de intere...

A pele é um dos maiores órgãos do corpo, com funções importantes no somato-sensação, isolamento / termorregulação e defesa imunológica 1. Compreender a base molecular e celular do desenvolvimento da pele e função tem sido de interesse de longa data por causa da importância fundamental da pele como um sistema biológico e sua relevância para a dermatologia. Pele de mamíferos contém uma variedade de estruturas multicelulares, incluindo camadas estratificadas de queratinócitos, tecido conjuntivo dérmico, vários tipos de folículos capilares, glândulas sebáceas, músculo eretor de pêlos, vasos sanguíneos, e pelo menos uma dúzia de classes distintas de aferentes (sensoriais) e nervo eferente fibras (Figura 1). Diferentes regiões do corpo estão associadas com caracteristicamente diferentes tipos de pele. Na maioria dos mamíferos, quase toda a superfície corporal é coberta com pele que é densamente com folículos pilosos. [Os seres humanos e os ratos-toupeira pelados constituem exceções ao thé padrão.] cabelo está ausente das superfícies palmar das mãos e dos pés, que também estão associados a padrões especializados epidérmico (dermatoglyphs), as glândulas exócrinas, e terminações nervosas sensoriais. Os eventos celulares e moleculares que controlam o crescimento, diferenciação e arranjo espacial das células dentro do folículo piloso são de especial interesse como cada exposições do folículo, em miniatura, muitas das características centrais da organogênese 2. Esses recursos incluem a existência de células-tronco e um nicho de células-tronco, as migrações celulares precisamente coreografadas, ea montagem de estruturas multicelulares a partir de componentes embriologicamente distintas. Este artigo descreve métodos para dissecar, fixação, rotulagem, e pele do rato de imagem como uma folha bidimensional intacto, referido como um &quot;todo monte&quot; ou &quot;flat montar&quot; preparação. Desde que a pele do rato é relativamente fina, é possível para a imagem em toda a espessura de esqui achatadan, usando microscopia confocal convencional. A abordagem plana de montagem para imagiologia pele de mamíferos é tecnicamente vantajosa, pois evita a necessidade de seccionamento físico, permitindo assim que as estruturas de ser reconstruído inteiramente por seccionamento óptico. Uma vez que quase toda a pele é processado como um único objecto, o plano de montagem abordagem também facilita a criação da imagem de várias regiões da superfície do corpo, enquanto preserva as informações sobre a posição e orientação em relação aos eixos do corpo. Finalmente, as estruturas dentro da pele estão tipicamente presentes em padrões que são repetidos em intervalos regulares, facilitando assim a obtenção de imagens a partir de vários representantes de uma dada estrutura. Estas características são familiares para neurobiologists que trabalham na retina, uma peça de duas dimensões do sistema nervoso central, que goza de vantagens análogas para estudos de morfologia neuronal 3. A abordagem plana montar aqui descrito é de utilit especialy para o estudo das estruturas que exibem organização espacial numa escala relativamente grande dentro do plano bidimensional da pele. Um exemplo de organização espacial em larga escala é a polaridade coordenada dos folículos pilosos e as estruturas associadas ao folículo piloso - grupos de células de Merkel, músculos eretor do pêlo, glândulas sebáceas, e terminações nervosas 4. Os folículos do cabelo são orientados com um ângulo em relação ao plano da pele, e o componente do vector de folículo, que se situa dentro do plano da 2-dimensional da pele exibe geralmente uma orientação em relação aos eixos do corpo que é determinada com precisão para cada posição sobre o corpo. Por exemplo, os folículos pilosos no ponto de volta da rostral para caudal e cabelo na superfície dorsal dos pés apontam de proximal para distal. Orientação folículo de cabelo é controlado por planar sinalização polaridade celular (PCP, também chamado de polaridade de tecido 5). Este sistema de sinalização foi descoberto em Drosophila, onde um pequenoconjunto de genes de PCP núcleo foi encontrada para controlar a orientação dos cabelos cuticulares e cerdas. Três ortólogos de genes de mamíferos PCP fundamentais - homólogos frisado 6 (Fzd6, também conhecido como Fz6), caderina EGF LAG sete-pass G-receptor tipo 1 (Celsr1) e burro-like 2 (Vangl2) - exercer funções análogas em mamíferos pele, coordenando as orientações dos folículos pilosos com os eixos do corpo. Os estudos de camundongos knockout Fz6 (Fzd6 tm1Nat, doravante referida como Fz6 - / -) mostram que o defeito primário na ausência de sinalização PCP é uma randomização inicial ou desorganização da orientação folículo piloso, com nenhum efeito sobre a estrutura intrínseca dos folículos 6-8. Um segundo sistema não-PCP age mais tarde para promover alinhamento local de folículos próximos, o que leva à produção de padrões de cabelo em grande escala, tais como espirais e tufos. Um segundo exemplo de grande escalaorganização espacial dentro da pele é visto nas morfologias de mandris axônios sensoriais. Neurônios sensoriais que inervam a pele têm seus corpos celulares na raiz dorsal e gânglios trigeminal. Estes neurônios detectar a temperatura, dor, prurido, e vários tipos de deformações mecânicas que incidem sobre a pele e cabelo 9. Eles podem ser divididos em subtipos baseados nas diâmetro e velocidade de condução axonal, a estrutura final do nervo terminal, e os padrões de expressão dos receptores, canais e outras moléculas. Devido à elevada densidade de inervação dentro da pele, as análises que envolvem a visualização de todos os axónios (por exemplo, a imunocoloração anti-neurofilamento) ou mesmo todos os axónios de uma classe única (como se vê quando um único tipo de célula está marcada pela expressão de um repórter fluorescente) geralmente revela uma sobreposição densa de axônios que faz com que seja impossível definir a morfologia de um mandril individual. Para contornar esse problema, temos utilizado extremamente escassa l geneticamente dirigidoAbeling para produzir amostras de pele dorsal, em que os mandris de axónios individuais bem isoladas são visualizadas através da expressão de um repórter histoquímica, fosfatase alcalina da placenta humana 10. Esta abordagem permite a visualização não ambígua de morfologias axônio mandril individuais e uma definição de tipos de neurônios somatossensorial com base em critérios morfológicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:256px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383221001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM1-43</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AM4-65</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>402834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>B-6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:256px;">Zeiss</td>
			<td style="width:145px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3-alpha smooth muscle actin antibody</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C6198</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokeratin-8&#160;</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-c</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td>scissors and forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric razor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoromount G</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass dishes</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td></td>
			<td>6 cm and 10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass plates</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>SE202P-10</td>
			<td>10 cm x 8 cm x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hair remover&#160;</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horizontal rotating platform&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Hoefer</td>
			<td style="width:145px;">PR250 Orbital shaker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine/xylazine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitroblue tetrazolium (NBT)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>11383213001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:256px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">55411-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Alexa-dye conjugated&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard-184</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9020938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plastic dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6- and 12-well&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology

A pele é um tecido altamente heterogêneo. Estruturas intra-dérmica incluem folículos pilosos, músculo eretor de pêlos, especializações epidérmicas (como aglomerados de células de Merkel), glândulas sebáceas, nervos e terminações nervosas e capilares. O arranjo espacial destas estruturas é rigidamente controlado numa escala microscópica - como pode ser visto, por exemplo, no arranjo ordenado de tipos de células dentro de um único folículo de cabelo - e numa escala macroscópica - como pode ser visto pelas orientações quase idênticas de milhares de cabelo folículos dentro de uma região local de pele. A visualização destas estruturas, sem seccionamento fisicamente a pele é possível por causa da geometria 2-dimensional deste órgão. Neste protocolo, que mostram que a pele do rato pode ser dissecado, fixo, permeabilizadas, manchado, e esclareceu como um objeto dimensional dois intactos, uma montagem plana. O protocolo permite a fácil visualização das estruturas da pele na sua totalidade, através de toda a espessura de grandes áreas da pele por optseccionamento iCal e reconstrução. Imagens dessas estruturas também podem ser integrados com a informação sobre a posição e orientação em relação aos eixos do corpo.

Brightfield imagiologia de flatmounts de pele pode ser utilizado para imagem aferentes sensoriais cutâneas (Figura 3A) e 10 padrões de folículos de cabelo com base na pigmentação de melanina (Figura 4). Imagem confocal de flatmounts pele pode ser utilizada para definir a geometria da (1) de agregados de células de Merkel, visualizadas com anticorpos anti-citoqueratina-6 ou com a absorção do corante AM (Figuras 3I-l), (2) os músculos arrector pili, vi...

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Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Pele de mamíferos contém um diversificado leque de estruturas - como os folículos capilares e terminações nervosas - que apresentam padrões distintos de organização espacial. Analisando a pele como uma montagem plana aproveita a geometria 2-dimensional deste tecido para produzir de espessura total imagens de alta resolução de estruturas da pele.

Plano Monte imagem de Rato pele e sua aplicação à análise do folículo piloso Padronização e Sensorial Axon Morfologia

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

flat-mount-imaging-mouse-skin-its-application-to-analysis-hair

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.2K visualizações.  Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine.  Pele de mamíferos contém um diversificado leque de estruturas - como os folículos capilares e terminações nervosas - que apresentam padrões distintos de organização espacial. Analisando a pele como uma montagem plana aproveita a geometria 2-dimensional deste tecido para produzir de espessura total imagens de alta resolução de estruturas da pele. 

Vídeo: Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Neurociência

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

Análise de imagens de Neuron Glia para Interação em Plataforma Cultura microfluídicos (MCP) baseado Axon Neuronal e Sistema Glia co-cultura

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imagem Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics nos terminais Cone fotorreceptores Axon do mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Gravação combinado de saída Mecanicamente Stimulated aferentes e Nerve Terminal Rotulagem no mouse do folículo piloso Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Monitoramento óptico do nervo Viver Terminal Etiquetagem na folículo piloso Lanceolate Endings da<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse pele da orelha

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Patch-clamp gravação de células Starburst Amácrinas em um monte de Luxo Preparação de Deafferentated mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...