Name: a new technique for quantitative analysis of hair loss in mice using grayscale analysis
Uploaded: 2015-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis at JoVE.com

We would like to thank the Children&#8217;s Hospital at Montefiore, Department of Pediatrics, for providing support for these studies. We would like to thank the National Alopecia Areata Foundation for providing financial support for conducting studies with C3H/HeJ engrafted mice.

Declaração de Ética: Todos os estudos que envolvam animais devem ser aprovados pelo IACUC da instituição (para os dados que se segue, os protocolos foram aprovados pela Montefiore IACUC, protocolo nº 11-6-240 e # 13-7-100). Animais são fornecidos anestesia luz, como indicado para o único propósito de mantê-los ainda durante a fotografia, não há procedimentos dolorosos necessários para este protocolo. 1. Aquisição de fotografias <ol><li> Definir o foco e campo de visão para imager gel usando papel com texto impresso. Verifique uniformidade da fonte de luz em toda a região fotografada. Para ajudar a garantir a uniformidade, usar um gerador de imagens gel com um construído em fonte de luz para a fotografia reflexiva. Não utilize uma fonte de luz transillumination, pois isso criaria uma silhueta do animal que não é adequado para uma análise mais aprofundada em tons de cinza. NOTA: Isto irá colocar o mouse ligeiramente fora de foco, que fornece a média óptica em toda a região de interesse (ROI) e vontadeajudar a reduzir erros quantais para regiões muito pequenas (isto é, &lt;10 pixels) de interesse. Regiões maiores de interesse não será afetado por este menor focando ajuste, nem serão afetados por diferenças no tamanho do animal. </li><li> Anestesiar os animais utilizando cetamina (100 mg / mL) / xilazina (20 mg / mL) (2: 1), pois isso proporciona um efeito de anestesia e uma recuperação rápida rápida e é ideal para fotografar vários animais. NOTA: A anestesia é confirmada quando o animal ainda é suficiente para permitir a fotografia. Como os animais tipicamente recuperar desta anestesia luz dentro de 10-15 min, o veterinário não recomenda o uso de pomadas para os olhos. </li><li> Coloque animais anestesiados em imager gel em alinhamento vertical (o mais próximo possível paralelo quanto possível). <ol><li> Para fotografias dorsais, colocar os animais em decúbito ventral, com os membros estendidos. </li><li> Para fotografias ventral, colocar os animais em decúbito dorsal, tomando cuidado para que os animais não são rodado lateralmente. </li&gt; </ol></li><li> Coloque padrão em tons de cinza na região fotografada. </li><li> Feche a porta de acesso. Importante: A luz ambiente pode apresentar variações na exposição. </li><li> Defina F-stop para uma exposição que coloca a região de interesse dentro da faixa linear de aquisição (leitura F-stop). NOTA: A maioria dos sistemas irá mostrar onde a imagem está saturada. </li><li> Tirar a fotografia. </li><li> Alterar F-stop para outra configuração de exposição que coloca a região de interesse dentro do intervalo linear, aumentando ou diminuindo o F-stop por 1, tal que tanto o padrão e a região de interesse permanece num intervalo linear de aquisição (referência F- pare). </li><li> Tirar a fotografia. </li><li> Uma vez que a fotografia é concluída, colocar os animais em uma tabela de aquecimento e monitorar até que possam manter decúbito esternal. Retorno animais para suas gaiolas. Retorne o grupo de animais ao biotério uma vez que todos os animais são totalmente recuperado. </li></ol> 2. Quantificação da absorção de luz &lt;/ P&gt; <ol><li> Marcar regiões de interesse nas imagens dos animais utilizando software fornecido para imager gel. <ol><li> Para ver o animal inteiro dorsal, utilizar uma imagem rectangular ou oval que se estende a partir das extremidades superiores dos membros inferiores, que se prolonga lateralmente, tanto quanto possível, de tal modo que nenhuma parte da caixa se estende para além da parte de trás do animal, tal como mostrado na Figura 1A. NOTA: Pode-se também marcar a área de interesse, utilizando uma ferramenta de desenho à mão livre. </li><li> Para animal inteiro ventral vista, use 2 retângulos: uma que cobre a região pélvica e um cobrindo a área do peito, como mostrado na Figura 1B. </li><li> Para uma região menor de interesse, ou seja, o local da administração da droga, marca, conforme apropriado. </li></ol></li><li> Região (s) Mark de juros sobre o padrão de absorção em tons de cinza. </li><li> Absorção da ficha de cada uma das regiões marcadas de interesse. </li></ol> 3. Análise Níveis de absorção obtained para as regiões de interesse podem necessitar de ser normalizadas para o padrão de fundo para comparação entre as fotografias. A relação de absorção é a exposição log-log (isto é, a relação é linear entre o log (exposição) e log (absorção)). Usando esta relação, a absorção da região de interesse pode ser normalizada a um padrão de valor de fundo, o que permitirá que as absorções de ser directamente comparados entre diferentes, incluindo as fotografias tomadas em diferentes pontos de tempo (isto é, medidas em série dentro de um protocolo de estudo). O procedimento para a execução dessas correções é detalhada em etapas opcionais 3.1 e 3.2. <ol><li> (Opcional) curva Lote de log (exposição) vs. log (absorção), utilizando os valores obtidos a partir de padrão de absorção em tons de cinza. </li><li> (Opcional) Ajuste para variações no padrão de cada fotografia da seguinte forma: <ol><li> Selecione F-stop para a leitura (como determinado na etapa 1.6) e F-stop para a referência (conforme determinado no step 1,8). </li><li> Calcule a absorção média do padrão em todas as fotografias na leitura de F-stop. Esta média é o Valor de Referência Padrão (RSV). </li><li> Calcular diferença de absorção entre a leitura e de referência configurações F-stop em cada fotografia para o padrão (delta-S) e para cada ROI definido (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X) </li><li> Calcule a absorção corrigido para cada ROI da seguinte forma: de absorção corrigido (ROI-X) = Absorção (ROI-X) com a leitura F-stop + (RSV - absorção de padrão na leitura de F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S) </li></ol></li><li> Compilar os dados experimentais e executar análise de dados usando técnicas estatísticas padrão para variáveis ​​contínuas (ie, ANOVA, T-teste). </li></ol>

<ol>
	<li>McAndrews, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Hair+Loss+Association.">American Hair Loss Association.</a> , (2011).</li><li>Safavi, K. H., Muller, S. A., Suman, V. J., Moshell, A. N., Melton, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+alopecia+areata+in+Olmsted+County,+Minnesota,+1975+through+1989.">Incidence of alopecia areata in Olmsted County, Minnesota, 1975 through 1989.</a> Mayo Clin Proc. 70 (7), 628-633 (1995).</li><li>Hussein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+alopecia:+new+developments.">Chemotherapy-induced alopecia: new developments.</a> South Med J. 86 (5), 489-496 (1993).</li><li>Trueb, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+hair+loss.">Chemotherapy-induced hair loss.</a> Skin Therapy Lett. 15 (7), 5-7 (2010).</li><li>Sato, N., Leopold, P. L., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+adenovirus-mediated+expression+of+Sonic+hedgehog+gene+on+hair+regrowth+in+mice+with+chemotherapy-induced+alopecia.">Effect of adenovirus-mediated expression of Sonic hedgehog gene on hair regrowth in mice with chemotherapy-induced alopecia.</a> J Natl Cancer Inst. 93 (24), 1858-1864 (2001).</li><li>McGarvey, E. L., Baum, L. D., Pinkerton, R. C., Rogers, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychological+sequelae+and+alopecia+among+women+with+cancer.">Psychological sequelae and alopecia among women with cancer.</a> Cancer Pract. 9 (6), 283-289 (2001).</li><li>Baxley, K. O., Erdman, L. K., Henry, E. B., Roof, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alopecia:+effect+on+cancer+patients'+body+image.">Alopecia: effect on cancer patients' body image.</a> Cancer Nurs. 7 (6), 499-503 (1984).</li><li>Stough, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychological+effect,+pathophysiology,+and+management+of+androgenetic+alopecia+in+men.">Psychological effect, pathophysiology, and management of androgenetic alopecia in men.</a> Mayo Clin Proc. 80 (10), 1316-1322 (2005).</li><li>Ogunmakin, K. O., Rashid, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alopecia:+the+case+for+medical+necessity.">Alopecia: the case for medical necessity.</a> Skinmed. 9 (2), 79-84 (2011).</li><li>Olsen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized+clinical+trial+of+5%+topical+minoxidil+versus+2%+topical+minoxidil+and+placebo+in+the+treatment+of+androgenetic+alopecia+in+men.">A randomized clinical trial of 5% topical minoxidil versus 2% topical minoxidil and placebo in the treatment of androgenetic alopecia in men.</a> J Am Acad Dermatol. 47 (3), 377-385 (2002).</li><li>Rossi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1+mg+daily+administration+on+male+androgenetic+alopecia+in+different+age+groups:+10-year+follow-up.">1 mg daily administration on male androgenetic alopecia in different age groups: 10-year follow-up.</a> Dermatol Ther. 24 (4), 455-461 (2011).</li><li>Gibbons, R. D., Fiedler-Weiss, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-aided+quantification+of+scalp+hair.">Computer-aided quantification of scalp hair.</a> Dermatol Clin. 4 (4), 627-640 (1986).</li><li>Fleming, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+a+structural+analysis+of+dermatoscopic+imagery.">Techniques for a structural analysis of dermatoscopic imagery.</a> Comput Med Imaging Graph. 22 (5), 375-389 (1998).</li><li>Chamberlain, A. J., Dawber, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+evaluating+hair+growth.">Methods of evaluating hair growth.</a> Australas J Dermatol. 44 (1), 10-18 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale*. , .</li><li>Freyschmidt-Paul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+alopecia+areata+in+C3H/HeJ+mice+with+the+topical+immunosuppressant+FK506+(Tacrolimus).">Treatment of alopecia areata in C3H/HeJ mice with the topical immunosuppressant FK506 (Tacrolimus).</a> Eur J Dermatol. 11 (5), 405-409 (2001).</li><li>Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Matsushita, O., Sakon, J., Gensure, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prevention+of+chemotherapy-induced+alopecia+with+PTH-CBD,+a+collagen-targeted+parathyroid+hormone+analog,+in+a+non-depilated+mouse+model.">Treatment and prevention of chemotherapy-induced alopecia with PTH-CBD, a collagen-targeted parathyroid hormone analog, in a non-depilated mouse model.</a> Anticancer Drugs. 25 (1), 30-38 (2014).</li><li>Peters, E. M., Foitzik, K., Paus, R., Ray, S., Holick, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+modulating+chemotherapy-induced+alopecia,+using+PTH/PTHrP+receptor+agonist+and+antagonist.">A new strategy for modulating chemotherapy-induced alopecia, using PTH/PTHrP receptor agonist and antagonist.</a> J Invest Dermatol. 117 (2), 173-178 (2001).</li><li>Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Seymour, A., Sakon, J., Gensure, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parathyroid+hormone+linked+to+a+collagen+binding+domain+promotes+hair+growth+in+a+mouse+model+of+chemotherapy+induced+alopecia+in+a+dose-dependent+manner.">Parathyroid hormone linked to a collagen binding domain promotes hair growth in a mouse model of chemotherapy induced alopecia in a dose-dependent manner.</a> Anti-cancer drugs. 25 (7), 819-825 (2014).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

Neste relatório, uma descrição detalhada é fornecida de uma nova técnica para quantificar a perda de cabelo em roedores. Esta técnica utiliza um gerador de imagens de gel para aquisição e análise de imagem, o equipamento que está prontamente disponível, na maioria dos laboratórios. As medições foram mostrados para ser robusto para pequenas variações na técnica (Figuras 4-5), e está bem correlacionada com o grau de perda de cabelo visual em modelos de tratamento (Figura 6).</str...

Alopecia (queda de cabelo) pode ser um evento psicologicamente e emocionalmente estressante com múltiplas causas. Calvície de padrão masculino é a causa mais comum de alopecia, que afecta cerca de dois terços do sexo masculino de 35 anos 1. Um padrão semelhante de perda de cabelo pode ser observado em mulheres com síndrome do ovário policístico. Em ambos estes distúrbios, a perda de cabelo é mediada androgénio. Alopecia também pode ocorrer como uma doença auto-imune, alopecia areata, que afecta 1,7% da população 2. Alopecia pode ocorrer como um efeito colateral de alguns tratamentos médicos, tais como a quimioterapia e 3. Uma elevada percentagem (65-85%) dos pacientes de quimioterapia experimentam algum grau de alopecia 4,5. As consequências psicológicas da perda de cabelo foram bem estudados no cenário quimioterapia. Alopecia induzida pela quimioterapia pode resultar em ansiedade, depressão, uma imagem corporal negativa, baixa auto-estima e um senso reduzido de bem-estar 6,7. Uma alta eprcentage (47-58%) de pacientes com câncer feminino considerar a perda de cabelo para ser o aspecto mais traumático da quimioterapia, e até 8% declínio tratamento por medo de perda de cabelo 4,6. Há também evidências de alopecia androgênica para apoiar a terapia para reduzir as conseqüências psicológicas e até mesmo médicos de perda de cabelo 8,9. Da mesma forma, a alopecia areata foi reportado ter consequências psicológicas graves 2, e a natureza irregular da perda de cabelo pode levar a um resultado estético mais desagradável do que a maioria das outras causas de perda de cabelo. Enquanto as drogas com efeitos anti-androgênicos leves (ie, espironolactona) tinham sido utilizados com sucesso limitado como terapia para alopecia, o primeiro medicamento eficaz para alopecia foi minoxidil 10. Este anti-hipertensora tem um efeito secundário observado de provocar o crescimento do cabelo, e é agora utilizada como terapia tópica para muitas formas de alopecia. No entanto, as respostas são muitas vezes incompleta, com alguns assuntos mostrando apenas lentoção de perda de cabelo em vez de rebrota real 10. Finasteride é um antagonista competitivo de tipo II 5α-redutase, que bloqueia a conversão de testosterona em di-hidrotestosterona, resultando em melhorias na alopecia androgénica, em detrimento de androgénio bloqueio parcial sistémica. As taxas de resposta com a longo prazo (10 anos), a terapia são em torno de 50% 11. No geral, apesar de considerável pesquisa nesta área, ainda não há uma terapia adequada para a perda de cabelo. Durante décadas, cientistas e médicos examinaram métodos de medir o crescimento do cabelo do couro cabeludo em ensaios clínicos. Com o desenvolvimento de drogas que tratam alopecia, tem havido uma necessidade maior de meios fiáveis, económicos e minimamente invasivas de medição do crescimento do cabelo e, especificamente, a resposta à terapia. Tecnologia de análise de imagem para uma quantificação precisa de densidade do cabelo em pacientes com distúrbios de perda de cabelo produziu resultados consistentes e válidos no passado usando uma variedade de techniques, incluindo a análise de imagens digitalizadas 12, análise de imagem de cabelos individuais e lesões cutâneas 13, e digitalização microscópica para quantificar a massa de cabelo em uma região do couro cabeludo definido 14. Infelizmente, enquanto as metodologias acima têm proporcionado uma melhor avaliação da eficácia para o cabelo crescimento promovendo intervenções em ensaios clínicos, estes métodos não tenham sido aplicadas a estudos com roedores em investigações pré-clínicas. Nosso objetivo é desenvolver um método consistente e confiável para quantificar a perda de cabelo em ratos, o que permitirá que os investigadores a avaliar com mais precisão e comparar novas abordagens terapêuticas para várias formas de alopecia. Nós desenvolvemos uma metodologia utilizando equipamento prontamente disponível na maioria dos laboratórios que permitam a quantificação rápida e confiável de densidade de cabelo em ratos com cabelo marrom ou preto. Esta metodologia foi testada em modelos de rato de alopecia induzida por quimioterapia, alopécia areata e alopécia de waxing. Um protocolo detalhado é apresentado para a execução dessas medidas, incluindo dados de validação de C57BL / 6 e C3H / HeJ cepas de camundongos. Como esta técnica baseia-se na detecção de absorção de luz a partir de pigmentos na haste do cabelo, que não pode ser usado para detectar o crescimento de cabelo em ratinhos ou ratos albinos brancos.

<table><tbody><tr><td>KODAK Gel Logic 100 Imaging System</td><td>Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA</td><td></td><td>Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography.</td></tr><tr><td>The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale</td><td><a href="http://www.imatest.com/docs/q13/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Imatest</a></td><td></td><td>Greyscale standard</td></tr><tr><td>C57BL/6J Mice</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine</td><td></td><td>Mice for representative study</td></tr><tr><td>C3H/HeJ engrafted mouse</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine</td><td></td><td>Mice for representative study</td></tr></tbody></table>

a new technique for quantitative analysis of hair loss in mice using grayscale analysis

Alopecia é uma forma comum de perda de cabelo, que pode ocorrer em diversas condições, incluindo a perda de padrão masculino de cabelo, síndrome do ovário policístico, e alopecia areata. Alopecia também pode ocorrer como um efeito secundário da quimioterapia em pacientes com cancro. Neste estudo, o nosso objectivo foi desenvolver um método consistente e fiável para quantificar a perda de cabelo em ratinhos, o que vai permitir aos investigadores comparar e avaliar com precisão a novas abordagens terapêuticas para estas várias formas de alopécia. O método utiliza um gerador de imagens de gel padrão de obtenção e processamento de imagens de ratos, medindo a absorção de luz, o que ocorre em proporção com a quantidade aproximada de cabelo preto (ou cinzento) no rato. Os dados que foram quantificados desta forma podem ser analisados ​​utilizando técnicas estatísticas padrão (ou seja, ANOVA, teste t). Esta metodologia foi testada em modelos de rato de alopecia induzida por quimioterapia, alopécia areata e alopécia de depilação. Neste relatório, o protocolo detalhado é prestura orientada para a execução dessas medidas, incluindo dados de validação de C57BL / 6 e C3H / HeJ cepas de camundongos. Esta nova técnica oferece uma série de vantagens, incluindo a relativa simplicidade de aplicação, a confiança no equipamento que está prontamente disponível na maioria dos laboratórios de pesquisa, e aplicar uma avaliação objectiva, quantitativa que é mais robusto do que avaliações subjetivas. Melhorias na quantificação do crescimento do cabelo em camundongos vai melhorar estudo de modelos de alopecia e facilitar a avaliação de novas terapias promissoras em estudos pré-clínicos.

Esta técnica foi validado utilizando camundongos C3H / HeJ em vós implantada, a modelo de rato com alopecia areata 16. Estes animais desenvolvem a perda de cabelo global que progride de forma gradual ao longo do tempo. No entanto, a perda de cabelo ocorre em manchas, e pode variar de um rato para o outro, a introdução de uma grande variabilidade e dificulta as avaliações qualitativas. Este modelo proporcionou uma oportunidade para testar as correlações entre as medições de densidade óptica em difer...

Watch this Scientific Journal Video about A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis at JoVE.com

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Uma nova técnica de Análise Quantitativa de perda de cabelo em ratos usando Análise Tons de Cinza

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

a-new-technique-for-quantitative-analysis-hair-loss-mice-using

Research

JoVE Journal

Biology

8.9K visualizações.  Children's Hospital at Montefiore. Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Vídeo: A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

Plano Monte imagem de Rato pele e sua aplicação à análise do folículo piloso Padronização e Sensorial Axon Morfologia

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Neurociência

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Gravação combinado de saída Mecanicamente Stimulated aferentes e Nerve Terminal Rotulagem no mouse do folículo piloso Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Monitoramento óptico do nervo Viver Terminal Etiquetagem na folículo piloso Lanceolate Endings da<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse pele da orelha

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Bioluminescence imaging is a well-known tool for localizing tumors and metastases, but quantification of these images often requires complex calculations and particular instruments. We describe the easy-to-use luminoscore method, based on precise acquisition conditions, requiring no calculations, and enabling tumor burden and treatment response to be monitored in mouse models.

Método Tumor Quantificação Baseada em bioluminescência para a progressão do tumor Monitoramento e efeitos do tratamento em modelos de ratos linfoma

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. ...

Medicina

Analysis of Craniomaxillofacial Malformations in Mice Using Three-dimensional Microcomputed Tomography

To model craniofacial malformations caused by vitamin A deficiency (VAD), we expressed a dominant-negative retinoid receptor mutation in osteoblasts to specifically inhibit RAR transcriptional activity in mice. This approach allowed us to investigate the effects of VAD on cranial hypomineralization, mandibular deformity, and clavicular hypoplasia in clinical cases. In this study, microcomputed tomography (microCT) scanning of the craniomaxillofacial region of mice represented a valuable tool for studying the growth and development of this animal model. The manual estimation of images is both time-consuming and inaccurate. Hence, here, we present a straightforward, efficient, and accurate approach for segmenting and quantifying the microCT images of each craniomaxillofacial bone. MicroCT software was used to slice the mandible, frontal bone, parietal bone, nasal bone, premaxilla, maxilla, interparietal bone, and occipital bone of mice and measure their corresponding lengths and widths. This segmentation method can be applied to study growth and development in developmental biology, biomedicine, and other related sciences and allows researchers to analyze the effects of genetic mutations on individual craniofacial bones.

Here, we describe in depth a method, which is based on microcomputed tomography, to segment and measure 3D models of craniomaxillofacial bones in mice, for better assessment of craniomaxillofacial bone development in mice than what is possible with current methods.

Análise de malformações craniomaxilofaciais em camundongos por meio de tomografia computadorizada tridimensional

To model craniofacial malformations caused by vitamin A deficiency (VAD), we expressed a dominant-negative retinoid receptor mutation in osteoblasts to ...

Biologia do Desenvolvimento

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Biologia

Digital Planimetry for Assessing Wound Closure Kinetics in a Mouse Model

Chronic wounds, due to their high prevalence, are a serious global health concern. Effective therapeutic strategies can significantly accelerate healing, thereby reducing the risk of complications and alleviating the economic burden on healthcare systems. Although numerous experimental studies have investigated wound healing, most rely on qualitative observations or quantitative direct measurements. The objective of this study was to standardize an indirect wound measurement method using digital planimetry, incorporating digital scaling and segmentation. This approach addresses the lack of detailed, step-by-step methodologies for accurate wound assessment. A photodocumentation booth was designed and constructed, and computer-assisted digital planimetry tools were employed to minimize variability in measurements of the wound area, perimeter, and the distance from the wound center to its edges. A circular traumatic wound (5 mm in diameter) was created on the dorsal midline at the shoulder blade level of male CD1 mice (n = 4, 10 weeks old, 30-35 g). Wound evolution was photodocumented for 14 days using the custom-designed photo booth, which controlled lighting conditions, focal distance, and subject positioning. Scaling and wound measurements were performed using segmentation in ImageJ software, and statistical analysis was conducted using statistical analysis software. The kinetics of wound closure showed a slight increase in wound size and perimeter between day 0 and day 2, followed by a gradual decrease until complete closure by day 14. The photodocumentation booth and computer-assisted digital planimetry enabled quantitative measurements with minimal variability. In conclusion, these tools provide a reliable and reproducible method for evaluating wound closure kinetics in pre-clinical models.

Wounds represent a global health challenge. This study developed a standardized photo booth utilizing digital planimetry to minimize wound measurement variability. Monitoring wounds in mice over 14 days revealed an initial increase in wound area and perimeter, followed by gradual closure. This methodology may aid in evaluating wound closure kinetics in pre-clinical models.

Planimetria digital para avaliar a cinética de fechamento de feridas em um modelo de camundongo

Chronic wounds, due to their high prevalence, are a serious global health concern. Effective therapeutic strategies can significantly accelerate healing, ...

Bioengenharia

Non-invasive Skeletal Muscle Quantification in Small Animals Using Micro-computed Tomography

Skeletal muscle size, mass, and composition are critical properties for studying metabolic and muscle-related diseases, as they directly impact the understanding of disease progression and treatment outcomes. Quantifying a live animal's lean, adipose, and skeletal mass is important in metabolic, physiology, pharmacologic, and geroscience studies. However, obtaining accurate body composition measurements, especially of lean mass, remains challenging due to the inherent limitations of conventional assessment techniques. Micro-computed tomography (micro-CT) is a non-invasive radiological technique that enables high-resolution visualization of internal structures in small animal models. A standardized micro-CT method can significantly enhance translational research with more reliable and impactful results, particularly during aging studies or at different time points within the same animal. Despite its potential, the lack of standardization in image acquisition and analysis methods significantly hinders the comparability of results across different studies. Herein, we present a comprehensive and detailed low-cost protocol for lean mass analysis using micro-CT to address these challenges and promote consistency in research involving small animal models.

This protocol uses micro-computed tomography to enable the cost-effective quantification of lean mass, including skeletal muscle and visceral tissue, adipose tissue, and skeletal tissue in small animals. It distinguishes between lean and adipose tissue, which offers significant advantages for biomedical research, particularly in translational research in small animals.

Quantificação não invasiva do músculo esquelético em pequenos animais por meio de microtomografia computadorizada

Skeletal muscle size, mass, and composition are critical properties for studying metabolic and muscle-related diseases, as they directly impact the ...

Non-Invasive Visualization of Nailbed Microvascular Morphology in Mice Using Capillaroscopy

Imaging microcapillary networks of the skin in humans using nailfold capillaroscopy (NFC) has underscored the importance of microcirculation as a target organ system in critical systemic illnesses. Nailfold capillaroscopy is applied clinically to detect peripheral microvascular dysfunction and abnormalities in a range of systemic conditions, including rheumatic, cardiac, ocular (e.g., glaucoma), and endocrine disorders (e.g., hypertension and diabetes mellitus). NFC is useful not only in detecting peripheral systemic microvasculature disruption but also in assessing drug efficacy. However, translating clinical NFC findings to animal disease models can be challenging. Detecting microvascular dysfunction or abnormalities in animals is often invasive (e.g., endoscopic), carried out ex vivo (e.g., post-mortem imaging of tissues), or expensive, requiring specialized equipment such as those used in microcomputed tomography and photoacoustic imaging techniques. Developing quick, non-invasive, and inexpensive techniques to image peripheral microvasculature in animal models of disease is warranted to decrease research expenses and increase translatability to the clinic.
Capillaroscopy has previously been used to visualize the nailfold microvasculature in animal models, including in guinea pigs and mice, thus demonstrating the capability of capillaroscopy as a non-invasive imaging tool in animal models. This study provides a protocol that applies capillaroscopy to a mouse nailbed, allowing researchers to easily and inexpensively assess the morphology of its microvasculature. Representative images of typical nailbed microvascular architecture in wild-type mice using two commonly used laboratory strains, SV129/S6 and C57/B6J, are provided. Further studies using this method are essential for applying nailbed capillaroscopy to a wide range of mouse disease models with peripheral microvascular abnormalities.

Capillaroscopy is an accessible tool for direct, inexpensive, and non-invasive visualization of microvasculature. The goal of this protocol is to enable researchers to use capillaroscopy for the visualization of peripheral microvascular morphology in the nailbeds of mice.

Visualização não invasiva da morfologia microvascular do leito ungueal em camundongos usando capilaroscopia

Imaging microcapillary networks of the skin in humans using nailfold capillaroscopy (NFC) has underscored the importance of microcirculation as a target ...

A Technique for Human Skin Grafting in a Mouse Model

Source: Moss, M. I. et al., <a href="https://app.jove.com/v/64040">Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses&#160;In Vivo.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates a method for grafting human skin onto an immunodeficient mouse with a suppressed neutrophil response. The method involves applying human split-thickness skin to the mouse&#39;s graft bed, sealing it, and covering it for recovery. Eventually, the human skin adheres to the mouse&#39;s skin, establishing vascularization and circulation, resulting in a successful skin xenograft.

Uma técnica para enxerto de pele humana em um modelo de camundongo

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...