Name: determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry
Uploaded: 2014-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry at JoVE.com

This work was funded by grant from the BBSRC (grant number BB/H019685/1 and BB/E527663/1) to the University of Exeter.

1 Determinação de um valor aproximado para a constante de dissociação (ou seja, dentro de uma ordem de grandeza) <ol><li> Preparar a mistura detalhado na Tabela 1. </li><li> Prepare stocks do ligante de interesse na maior concentração disponível, e então em seis de dez diluições desta. Onde um K d de aproximadamente é conhecida a partir dos dados anteriores, o objectivo de ter pelo menos duas concentrações acima e abaixo do K d. </li><li> Aliquota de 18 ul da mistura em oito poços de uma placa em qPCR. Adicionar 2 mL de solvente para o primeiro poço. Adicionar 2 mL de cada membro da série de diluição de ligando (passo 1.2), bem cada um dos restantes sete poços. </li><li> Coloque um selo sobre a placa de qPCR. Para alcançar uma boa vedação da placa, colocar um aplicador de mão (ver tabelas de reagentes específicos) no centro da placa. Alisar o selo para um lado e repita na outra metade doda placa. </li><li> Centrifugar a placa a 500 x g durante dois minutos para remover as bolhas de ar. </li><li> Coloque a placa em um instrumento StepOne qPCR. Seleccione a opção &quot;curva Melt&quot;, os filtros ROX, e escolher a velocidade rampa rápida (isto proporciona uma pausa de 2 min a 25 ° C, seguido de uma rampa de 99 ° C durante 40 minutos, e, em seguida, uma pausa de 2 min). Executar uma desnaturação térmica. NOTA: Os arquivos de script para a realização de uma corrida estão disponíveis online em http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Na conclusão do instrumento de execução, clique no botão &quot;Analisar&quot; na tela. Salve o arquivo de resultado. </li><li> Abra o software Protein deslocamento térmico. <ol><li> Criar um novo estudo; na aba de propriedades, dar a este um nome, e na guia Condições, detalhar os ligantes. </li><li> Mover para a aba Arquivos Experiment, e importar o arquivo salvo resultados (XXX.eds), e definir o conteúdo de cada poço (modelo files estão disponíveis a partir dos autores). </li><li> Mude para a guia Análise, e pressione o botão &quot;Analisar&quot;. NOTA: Isto irá analisar os resultados. É possível exportar os resultados para uma investigação mais aprofundada com o Excel usando a guia de exportação. Os resultados são exportados em um formato de guia delineada. É melhor abrir o arquivo exportado no Excel, e imediatamente salve em formato Excel. </li></ol></li><li> Verificar que a proteína na presença de solvente sozinho dá um resultado semelhante ao mostrado na Figura 1A. Em seguida, examinar as temperaturas de fusão observados nos resultados no painel &quot;replicar&quot;. Certifique-se de que isso mostra um claro aumento na temperatura de fusão com o aumento da concentração do ligante. NOTA: Idealmente, isto irá proporcionar uma temperatura máxima de fusão claro (assumindo que a proteína é completamente ligando ligado), e um K d aproximado em que a temperatura de fusão está a meio caminho entre a proteína e sem ligandoo máximo. </li></ol> 2. Experimental Set-up para a determinação da constante de dissociação <ol><li> Preparar a mistura detalhado na Tabela 2, tal como uma mistura de base. </li><li> Prepare a existências do ligando em quinze concentrações diferentes, que serão diluídas dez vezes na última experiência. O ideal é incluir as concentrações de pelo menos duas ordens de magnitude acima e abaixo da estimada K d, e do centro de concentrações no estimada K d. Concentre-se em sete dos pontos dentro de uma ordem de grandeza da estimativa K d, com mais quatro pontos em ambos os lados deste; se existe uma escolha, incluir mais pontos em que os valores são saturantes. NOTA: Se necessário, é possível alterar as condições experimentais tais que as unidades são ligandos com o dobro da concentração experimental, onde a solubilidade do ligando é limitante. </li><li> Adicionar 120 mL do mestremisture até oito poços em um U-fundo placa de 96 poços, para atuar como um reservatório para distribuição conveniente da mistura principal. Use uma pipeta de 8 canais para dispensar 18 ul em uma coluna de uma placa de PCR. Repita durante mais cinco colunas, para dar um total de 48 poços cheios com um padrão de 6 x 8 na placa. </li><li> Adicione 20 l de os estoques ligante, ou solvente, para separar poços em um U-fundo placa de 96 poços. Usando uma pipeta de 8 canais, aspirado 2 l de oito ações ligantes diferentes (ou solvente). Adicionar estas para uma coluna da placa de PCR, que foi enchida com uma mistura mestre no passo 2.3. Repita o procedimento com os mesmos oito ligando / stocks de solventes para mais duas colunas. Aspirar 2 ul de oito existências ligando ou solventes remanescentes, e adicione-os a uma quarta coluna na placa. Repita esse procedimento para mais duas colunas. Isto vai dar amostras em triplicado para todos os 16 ligando e as amostras de solvente. </li><li> Coloque um selo sobre a placa de qPCR (ver passo 1.4). </li><li> Centrifugar a placa a 500 xg durantedois min. </li><li> Coloque a placa no instrumento qPCR. Executar uma desnaturação térmica usando os parâmetros especificados no passo 1.6. </li><li> Na conclusão do instrumento de execução, clique no botão &quot;Analisar&quot; na tela. Salve o arquivo de resultado. </li><li> Abra o software Protein deslocamento térmico. Criar um novo estudo; na aba de propriedades, dar a este um nome, e na guia Condições, detalhar os ligantes. </li><li> Mover para a aba Arquivos Experiment, e importar o arquivo salvo resultados (XXX.eds), e definir o conteúdo de cada poço. NOTA: arquivos de modelo estão disponíveis online em http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Mude para a guia Análise, e pressione o botão &quot;Analisar&quot;. <ol><li> Escolha a aba &quot;réplicas&quot; no menu do lado esquerdo da tela para mostrar os resultados como triplicatas. Avaliar a confiabilidade dos dados com base em quão apertado as triplicatas são. Should as triplicatas mostram uma reprodutibilidade, examinar os dados brutos de perto. </li><li> Analisar os dados usando tanto o Boltzmann ou métodos derivativos para avaliar a temperatura de fusão. Selecione a opção &quot;Replicar resultados&quot; guia, e no &quot;Replicar resultados enredo&quot;, alterne o &quot;Plot por:&quot; botão entre &quot;Tm - Boltzmann&quot; e &quot;Tm - Derivado&quot;. Seleccione o método que dá a maior reprodutibilidade para a amostra. Exportar os resultados para uma investigação mais aprofundada com o Excel usando a guia de exportação. NOTA: Para obter exemplos que mostram várias transições, é quase sempre melhor usar o método derivativo no modo de fusão múltipla. Os resultados são exportados em um formato de guia delineada. É melhor abrir o arquivo exportado no Excel, e imediatamente salve em formato Excel. </li><li> Repita a experiência, no mínimo, por duas vezes, incluindo a repetição de um dia separado, para assegurar a reprodutibilidade dos resultados. Caso a análise de dados (consulte a etapa 3 abaixo)indicam que o valor de K d é significativamente diferente para o cálculo inicial, alterar as concentrações de ligando em conformidade (ver passo 2.2) para garantir uma boa gama de valores de cerca de K d. </li></ol> 3 Análise de dados para determinar a constante de dissociação sob desnaturação térmica <ol><li> Criar uma tabela no Excel da concentração de ligando e a temperatura de fusão. </li><li> Abra o software GraphPad Prism, e criar uma mesa XY. Entre os dados, usando a coluna de X para as concentrações de ligando e a coluna de Y para a fusão de temperatura resulta. NOTA: um exemplo é mostrado Figura 1B. Um roteiro com as equações pré-carregados e instruções alternativas para a utilização do pacote estatístico SPSS, estão disponíveis online em http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Na guia Análise, selecione a opção para alterar o parâmetro de análises (Ctrl + T). Para entrar no modelo correto, selecione &quot;New&quot; e &quot;Criar uma nova equação&quot;. Inserir a equação detalhado na Tabela 3 como &quot;sítio de ligação do ligando Single&quot;. NOTA: Um exemplo dessas medidas é mostrado na Figura 1C. Quando se utiliza o script pré-carregado com equações, a equação pode ser dirigida relevante escolhido a partir da lista, em vez de inserido. Derivação desta equação é fornecida em um apêndice. </li><li> Selecione as &quot;regras de Valores Iniciais&quot; caixa e digite regras para os valores iniciais, conforme detalhado na Tabela 3. </li><li> Restringir o parâmetro P, como &quot;constante igual a&quot; e introduzir a concentração final de proteína (nas mesmas unidades que o ligando é dada em). </li><li> Selecione OK para realizar a análise. NOTA: Um exemplo dessas medidas é mostrado na Figura 1D. O programa gráfico produz uma figura que mostra os dados e o ajuste para o modelo. Exemplos de tstas análises são apresentados nos dados representativos. </li></ol> 4. Ajustando os dados para modelos cooperativos Para ajustar os dados para um modelo de cooperativa, ou escolher entre um modelo de cooperativa simples, ou um modelo onde duas constantes de dissociação separados são definidos. A primeira abordagem é o preferido no caso de uma cooperatividade negativa, ou como uma investigação inicial. No entanto, em princípio, é melhor nos casos de cooperatividade positiva para modelar dois dissociação diferentes constantes 18. Neste caso, a modelagem pode continuar assumindo qualquer ligação sequencial de ligantes, ou ligação independente de ligantes. <ol><li> Siga os mesmos passos iniciais como no protocolo 3 No entanto, no passo 3.3, inserir uma das equações na Tabela 3 listado como &quot;modelo cooperativo Simples&quot;, &quot;ligação sequencial de dois ligantes&quot;, ou &quot;Independent ligação de dois ligantes&quot; 18. </li><li> Selecione as regras aplicáveis ​​para valores iniciaisassociada com cada uma destas equações na Tabela 3. </li><li> Examinar o ajuste do modelo aos dados. Se os dados se encaixam mal, considere um outro modelo. NOTA: também é importante analisar cuidadosamente a montagem da temperatura de fusão de dados pelo software deslocamento térmico Protein (passo 2.9): às vezes é necessário alterar os parâmetros aqui para obter os melhores resultados. Outra consideração é se o intervalo de pontos de dados é o ideal, e se existem pontos anômalos: ou um conjunto limitado de dados de ambos os lados de K d, ou um único ponto anômalo (especialmente nas concentrações mais altas ligante), pode afetar significativamente os resultados. </li><li> Repita a experiência, no mínimo, por duas vezes (ver passo 2.12) para assegurar a reprodutibilidade. </li></ol> 5. Ajustando os dados para curvas que mostram deslocamentos binários na temperatura de fusão Ocasionalmente, em vez de uma resposta graduada a ligando, as proteínas foramObservou-se adotar uma resposta binária, onde a amostra ligado é nitidamente separada da amostra não ligado. Um exemplo é fornecido nos resultados representativos (Figura 4). Neste caso, a montagem das temperaturas de fusão não irá proporcionar um bom ajuste para K d. <ol><li> Exportar a saída de dados brutos do Protein software deslocamento térmico. Para cada ponto de temperatura, o cálculo da média de fluorescência para o ligando de zero, e as concentrações mais elevadas de ligandos. Tabular os resultados a partir de cada ponto de dados seguinte a estes. NOTA: O erro criado aqui é menor do que o erro nas temperaturas de fusão embutidos. </li><li> Abra o pacote estatístico SPSS. Copie as temperaturas, os dois conjuntos de dados médios, e os dados de cada experimento para uma janela de dados em SPSS. Na aba variável, definir o conjunto de dados médio para não ligando como &quot;baixo&quot;, eo conjunto de dados média para a maior concentração ligante como &quot;alto&quot;. </li><li> Baixe o arquivo de sintaxe disponívelon-line em http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular</a> . Selecione &quot;Executar → Executar tudo&quot;. </li><li> Copie a proporção resultados ligados a um novo livro do Excel, com as concentrações ligando relevante. </li><li> Abra o software Graphpad, e criar uma mesa XY. Entre os dados, usando a coluna de X para as concentrações de ligando e a coluna de Y para a fusão de temperatura resulta. Na guia de análise, selecione &quot;parâmetros de análise mudança&quot;. Para entrar no modelo correto, selecione &quot;New&quot; e &quot;Criar uma nova equação&quot;. Introduza a equação dada na Tabela 3, listados como &quot;análise de desvios em binários temperatura de fusão&quot;. </li><li> Marque a caixa &quot;regras para os valores iniciais&quot;, e inserir regras para valores iniciais detalhados na Tabela 3. Restringir o parâmetro P, como &quot;constante igual a&quot; e digite a concentração final de proteína (nas mesmas unidades que a ligand é dada em). NOTA: exemplos de concluir essas caixas para o protocolo na seção 3 são mostrados na Figura 1C, D. </li><li> Se existe um bom ajuste, os resultados podem ser melhorados através da extrapolação do resultado esperado na concentração do ligando infinito. A partir do modelo da parte ligada a cada concentração de ligando, examinar o valor para o valor mais alto de concentração do ligando. Se esta é 0,99 ou maior, é improvável para melhorar os resultados uma análise mais aprofundada. </li><li> Se a proporção é inferior a 0,99, uma etapa adicional é requerido para corrigir os efeitos da proteína não ligada na amostra mais elevada concentração de ligando. No passo 5.2, escrever a proporção de ligando ligado ao ponto de maior concentração de ligando (a partir do passo 5.7) em célula R2 (uma célula diferente, podem ser utilizados, e R2 apropriadamente substituído na equação na Tabela 3). Criar uma coluna extra após a média dos valores mais elevados de concentração de ligando. Nos abetoscélula T, copiar a equação listadas na Tabela 3 como &quot;A extrapolação para o infinito concentração do ligando&quot;. Copie esta fórmula para as células restantes nesta coluna. NOTA: Este cálculo remove o efeito da proteína não ligada na concentração mais elevada de ligando. A diferença entre a proteína do ligando livre e a concentração mais elevada de ligando é multiplicado pelo inverso da percentagem ligada a uma concentração mais elevada de ligando para proporcionar a diferença esperada entre estados proteína totalmente ligadas e não ligadas, em cada ponto de temperatura. Esta diferença é adicionado ou subtraído do estado desagregado para dar a fluorescência esperado para a proteína totalmente ligando ligados. </li><li> Substituir a coluna para a concentração máxima ligando na folha de dados SPSS com esta nova coluna, e repetir o ajuste de dados. NOTA: os passos 5,7-5,9 pode precisar ser repetido se o modelo sugere uma nova mudança significativa na proporção ligação nas concentrati máximas liganteem (se este for o caso, provavelmente seria ideal para repetir o experimento com um ponto de concentração de ligante superior incluído). </li><li> Nos casos em que a proteína apresenta um comportamento cooperativo deslocamento binário e exibe, a equação sugerida no passo 5.5 devem ser substituídos com aqueles do passo 4.1. Os parâmetros &quot;fundo&quot; &quot;Top&quot; e deve ser substituído por 1 e 0, respectivamente. </li><li> Repita a experiência, no mínimo, por duas vezes (ver passo 2.12) para assegurar a reprodutibilidade. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have nothing to disclose.

Fluorimetria diferencial de varredura demonstrou seu poder como um método robusto e versátil para a caracterização de proteínas e identificação de potenciais ligantes protéicos. Os sucessos bem documentados em acelerar a estabilização da proteína, descoberta de drogas (especialmente em laboratórios menos financiados) e cristalização 10,23-25 ​​tornaram um método atraente para a triagem inicial de compostos. Compostos adicionados às proteínas mostram um claro aumento dependente da dose na temperatura de fusão aparente de 7,9. No entanto, tem havido algumas tentativas para utilizar os resultados destas experiências para determinar as constantes de ligação aparentes para ajudar na classificação compostos quanto à sua afinidade. Aqui, nós apresentamos um método para a determinação sistematicamente uma constante de dissociação aparente de proteínas na presença de um ligando. Os resultados aqui apresentados demonstram que a DSF pode rapidamente e de forma robusta fornecer estimativas da constante de dissociação parauma combinação de proteína-ligando. Os dados observados podem ser manipulados com instrumentos disponíveis comercialmente para fornecer uma rápida determinação de K d, sem a necessidade de fazer hipóteses sobre o valor provável de parâmetros. O método tem uma vantagem significativa sobre alguns métodos comparáveis ​​de ser parcimoniosa em proteínas e tempo requerido. O experimento descrito aqui vai consumir 0,13 mg de proteína por experiência (aproximadamente 0,4 mg por experiências repetidas em triplicata). Isso se compara favoravelmente com a calorimetria de titulação isotérmica (ITC), onde uma única experiência com uma média de 40 kDa vai consumir uma quantidade similar. O conjunto completo de experimentos necessários para este protocolo iria consumir em torno de 4 horas, incluindo a preparação, para um único conjunto de experimentos. Mais uma vez, esta é provavelmente a ser consideravelmente mais rápida do que os métodos tais como ITC ou ressonância de plasma de superfície, enquanto que muitas vezes requerem optimização poderoso considerável para atingir melhores dados. Os nossos resultados demonstram que continua a existir uma exigência de examinar cuidadosamente os dados brutos, o ajuste destes dados para determinar a temperatura de fusão, e o ajuste dos dados de temperatura de fusão para determinar a constante de dissociação. O primeiro desafio é a forma dos dados brutos produzidos na proteína de fusão. Em alguns casos, a forma pode não aproximados ao observado na Figura 1A. Problemas comuns incluem mudanças de temperaturas baixas na ligação do ligando, alta fluorescência de fundo e várias transições incomuns de temperatura. Deslocamentos de baixa temperatura são vistas em ligação um número de ligandos. Por este método, o parâmetro mais crítico é o erro na medição de T m, em comparação com a mudança de temperatura. Os dados geralmente pode ser equipado razoavelmente bem quando o desvio padrão das medições em triplicata não excedam 10% do deslocamento da temperatura de fusão entre a proteína não ligada e totalmente vinculado. Nossa experiência é que quando essa temperaturadeslocamentos ratura são apenas 2 ° C, isto pode ser suficiente para o ajuste dos dados, se os pontos de dados individuais são altamente precisos. Uma segunda questão é incomum em forma de curvas. Estas muitas vezes diferem entre a proteína livre e as formas de ligando ligado, como a ligação do ligando afecta modos desdobramento da proteína. Nestes casos, o utilizador tem de determinar se os dados podem ser usados ​​com a devida consideração dos modelos para ser utilizado para a determinação da temperatura de fusão e a constante de dissociação. Um outro problema comum é que a adição de um co-factor para a proteína (por exemplo, MgCl 2, no nosso exemplo com hexocinase) é necessário para obter os dados mais fiável. Nossa experiência tem demonstrado que uma análise cuidadosa de todos os fatores prováveis ​​no experimento na fase de fazer leituras iniciais é essencial para a obtenção dos melhores resultados. Além disso, os tratamentos teóricos alternativos pode revelar características destes dados 15,17. Finalmente, não é incomum para algumas proteínas que contain nativamente exposta regiões hidrofóbicas para mostrar alta fluorescência de fundo. Há um certo número de soluções para estes problemas, que têm sido extensivamente avaliação outras posições 6,9. Em particular, o utilizador deve-se considerar a possibilidade de utilizar o Boltzmann modelos ou derivados (por exemplo, Figura 4), ​​e no caso de utilização de derivados, se derrete múltiplas devem ser modeladas. Os dois métodos de modelação do desdobramento térmico diferem na medida em que o método de Boltzmann ajusta os dados experimentais com a equação de Boltzmann, assumindo um formato regular para a sigmoidal curva desdobramento. Em contraste, o método derivado leva a primeira derivada dos dados experimentais em cada ponto (painel inferior da Figura 1A), e considera que a temperatura de fusão ser o ponto mais elevado da primeira derivada. O método geralmente derivado retorna uma temperatura de fusão mais elevada de cerca de 2-3 ° C. A maioria das proteínas irá retornar uma mais consistenteresultado (isto é, o erro padrão da temperatura de fusão para as experiências em triplicado é inferior) por um dos dois métodos. Isto é geralmente intimamente relacionada com a forma exacta da proteína se desdobrar curva, e que é necessário para determinar empiricamente o melhor método, em cada caso. Quando o modelo derivado é utilizado, é também importante considerar vários eventos de fusão. Alguns dados mostram claramente evidência para múltiplas transições, e, nestes casos, os resultados tendem a ser mais fáceis de interpretar se estes eventos de fusão múltiplos são modelados. No contexto do presente protocolo, que é muitas vezes o caso de que a adição do ligando pode provocar uma proteína para passar de ter múltiplas transições de fusão para uma única transição (por exemplo, por meio da estabilização do mais frágil termicamente subdomínio), ou vice-versa. Teríamos, portanto, defendem que os dados brutos são examinadas em conjunto, antes de considerar qual abordagem será melhor para usar. Seguindo o modelling das temperaturas de fusão individuais, outros problemas podem surgir na montagem destes para os modelos apresentados na seção de protocolo. É imperativo examinar cuidadosamente o ajuste à equação constante de dissociação usando uma escala logarítmica, como esta análise frequentemente destaca discrepâncias entre os dados observados eo modelo (e .g., Figura 3). Embora os resultados obtidos são geralmente robusto, o cuidado na interpretação oferece a oportunidade de extrair os melhores resultados, e a maior significado, a partir dos dados. A questão específica levantada por esses dados é a interpretação que deve ser colocado em proteínas que mostram cooperatividade, ou vários eventos de ligação, na DSF. Temos, até o momento, apenas observou esse fenômeno em proteínas que são esperados para ter vários eventos de ligação específicos (por exemplo, WcbM, uma proteína cuja homólogo melhor é uma multï¿½ero 26, e que atua como um multï¿½ero em cromatografia de exclusão de tamanho [de dados nãomostrados]). Não é de modo nenhum claro que a cooperatividade negativa observada na DSF desnaturação da enzima indica que, em última análise mostram cooperatividade negativa: em vez disso, esta pode ser uma indicação de que o complexo de ligação tem de ser explorado mais exaustivamente utilizando uma gama mais larga de métodos. Isto sugere a nós, no entanto, que mais extensos estudos de tais proteínas são susceptíveis de identificar efeitos interessantes. Os valores indicados para a constante de dissociação utilizando este método são, em geral da mesma ordem que aquelas fornecidas por outros métodos, tais como calorimetria de titulação isotérmica e de ressonância de plasmon de superfície. No entanto, os valores absolutos observados são frequentemente mais elevados do que os observados usando esses métodos. Isto é, pelo menos em parte uma consequência do facto de a constante de dissociação é observada na temperatura de fusão com a proteína do ligando. Este K d é geralmente maior do que a temperaturas fisiológicas. O dissociation constante está relacionada com a temperatura da reacção pelas equações: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg" /> [1] <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg" /> [2] (Em que c é a concentração θ referência padrão, Δ r G é a variação de energia livre de Gibbs da reacção, R é a constante dos gases molar, Δ H é a variação de entalpia na reacção, e Δ S é a variação de entropia na reacção .) As reacções com as constantes de dissociação na gama mensurável de este método terá geralmente um negativo Δ r L, e de modo que o efeito de um aumento na temperatura na equação [1] será o aumento da constante de dissociação. Ambos os termos Δ H e Δ S que constituem a energia livre de Gibbs (equação [2]) são temperaturdependente e 27, e o efeito sobre a constante de dissociação dependerá da amplitude e sinal de estas dependências de temperatura, e será, necessariamente, dependente interacção. Por conseguinte, não é inesperado que as constantes de dissociação determinadas por este método são, por vezes, maior do que os valores determinados por métodos que operam à temperatura ambiente. A dependência da temperatura é, evidentemente, também a ressalva de muitos outros métodos, os quais tendem a fornecer a constante de dissociação em temperaturas mais baixas do que a temperatura fisiológica. Outra ressalva do método DSF é que é um método marcado, ao contrário de ITC. O marcador fluorescente utilizado (SYPRO Laranja) é hidrofóbico, e portanto em alguns casos, pode competir com a ligação de ligandos a proteínas hidrofóbicas. Por conseguinte, é provável que, em alguns casos, a constante de dissociação obtida vai ser artificialmente elevado devido à competição com o rótulo. No entanto, para a comparação de diferentes ligandos, (o principal usoDSF), as diferenças não são susceptíveis de ser suficientemente significativa para afetar a classificação de compostos por afinidade. Uma potencial desvantagem deste método é o limite de detecção que pode ser alcançado. Em princípio, não deverá ser possível medir com precisão a um valor de K d que é inferior a 50% da concentração de proteína, e até mesmo os valores nesta gama são susceptíveis de ser de precisão duvidosa. Embora o limite de detecção a esta extremidade do intervalo pode ser alargado por uma pequena redução da concentração de proteína e de corantes, a sensibilidade do instrumento vai evitar mais redução na concentração de proteína. Do mesmo modo, a extremidade superior da sensibilidade serão determinadas pela solubilidade do ligando. Para obter uma estimativa matematicamente robusto para o K d, é a mais importante para a obtenção de dados com 90% da proteína presente sob a forma ligada ao ligando, que requer concentrações de ligando a ser aproximadaly dez vezes K d (assumindo que não há cooperatividade). O limite de detecção, portanto, de ser necessariamente um décimo da solubilidade do ligando no tampão relevante. Isto significa que os limites de detecção do método irá tipicamente variar entre 1 uM e entre 1 e 100 mM, dependendo da proteína e do ligando. Em conclusão, a fluorimetria de varrimento diferencial é uma técnica versátil aplicável a uma ampla gama de proteínas. Usando os métodos aqui apresentados, é possível determinar rapidamente e de forma barata a afinidade de uma proteína para diferentes ligandos. Isto tem um grande potencial de aplicação em purificação de proteínas e de estabilização, a esclarecer a função ou especificidade de enzimas de metagenomes, e na descoberta de medicamentos, especialmente em pequenos laboratórios.

Todas as proteínas vão ligar, com afinidades diferentes, para uma variada gama de outras moléculas de íons simples para outras grandes macromoléculas. Em muitos casos, as proteínas se ligam a pequenas parceiros da molécula, como parte da sua função normal (por exemplo, ligação de uma cinase de ATP). Outras interacções podem não estar relacionadas com a função, mas são úteis como ferramentas experimentalmente (por exemplo, moléculas pequenas que estabilizam proteínas para melhorar o sucesso de cristalização, ou ajudar a manter as proteínas em solução); enquanto que as moléculas pequenas que se ligam a locais activos e locais alostéricos das proteínas podem agir como inibidores e assim modular a actividade de enzimas. Há uma grande variedade de técnicas que podem ser utilizadas para determinar a afinidade de proteínas de moléculas parceiras. Calorimetria isotérmica de titulação 1 é amplamente visto como um &quot;padrão-ouro&quot;, uma vez que fornece informações ricas sobre as reações, é o rótulo de livre, e tem oportunidades limitadas para umartifacts do experimento. No entanto, apesar das recentes melhorias na sensibilidade da instrumentação e automação de set-up experimental, ainda é relativamente caro em termos de exigências de proteína, tem no máximo um rendimento baixo e médio, e é mais adequado para interações com moderada a afinidades elevadas (10 nm a 100 M K d) 2. Outros rótulo métodos gratuitos, como ressonância de plasma de superfície ou bicamada interferometria 3 oferta débitos mais elevados, e ter conseguido a sensibilidade para detectar moléculas menores tão baixas quanto 100 Da. No entanto, os instrumentos de alto rendimento para estes métodos são relativamente caros, só se justificam em que haverá uma taxa de transferência contínua de projetos relevantes, e por isso é provável que sejam inacessíveis para muitos laboratórios acadêmicos. Fluorimetria de varrimento diferencial (DSF ou thermofluor) foi descrita pela primeira vez em 2001 4 como um método para a descoberta da droga. Neste metod, as proteínas são incubadas com um corante fluorescente (foram utilizados corantes inicialmente naftaleno-sulfónico), o qual altera a sua fluorescência após ligação para as regiões hidrófobas das proteínas. A amostra de proteína-corante é, em seguida, aquecida, e a fluorescência monitorizada como o calor aumenta. O desdobramento da proteína, e a exposição das partes hidrofóbicas da proteína, dá origem a um padrão característico da fluorescência como uma função de temperatura (Figura 1A). A experiência pode ser realizada em pequenos volumes em qualquer instrumento de PCR quantitativo comercial, e assim numa única experiência, um grande número de amostras podem ser testadas simultaneamente (normalmente 48, 96 ou 384 amostras, dependendo do modelo de instrumento). Experiências pode geralmente ser realizada em cerca de uma hora, dando a possibilidade de análise de alto rendimento das amostras 5. Outras melhorias na metodologia de ter visto a adoção de corantes com melhores propriedades espectrais 6,7 </sup&gt;, ferramentas genéricas para análise de dados, e sugeriu protocolos para a triagem inicial 8,9. A gama de aplicações do método foi estendido, com um foco particular em estabelecer as condições ideais para a preparação e armazenamento de proteínas 10, e na identificação de potenciais parceiros de ligação para ajudar a cristalização 11. O relativamente elevado rendimento do método, de custo relativamente baixo teor em proteína (~ 2 g por reacção), e a aplicabilidade ao estudo de moléculas de ligação fracas fez DSF uma ferramenta valiosa para a concepção de fármacos com base fragmento, especialmente no contexto académico 12-14. Apesar da ampla aplicação da DSF para estudar as interações proteína-ligante, poucos estudos têm descrito a determinação de constantes de dissociação desses estudos. No entanto, estes tendem a produzir equações detalhados que descrevem o desdobramento da proteína, com muitos parâmetros que devem ser equipados com dados esparsos ou em alguns casos, ecalculados a 7,15-17. Estes métodos são de particular relevância nos casos difíceis, tais como os compostos de ligação com força, ou proteínas que apresentam transições incomuns. No entanto, para muitos laboratórios, estas análises detalhadas são demasiado pesado para uso rotineiro. Propomos, portanto, tratamentos alternativos para diferentes cenários, e demonstrar como estes podem ser usados ​​para ajustar os dados resultantes de diferentes interações proteína-ligante. Nosso método utiliza o instrumento StepOne qPCR, para que o software de análise de dados sob medida está disponível; enquanto que esta aumenta a velocidade de análise de dados, os resultados de outros instrumentos podem ser processadas utilizando os métodos previamente publicados 9, e a mesma análise a jusante pode ser realizada.

<table><tbody><tr><td>StepOne real time PCR instrument</td><td>Life Technologies</td><td>4376357</td><td>DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis.</td></tr><tr><td>Protein thermal shift software v1.0</td><td>Life Technologies</td><td>4466037</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast optical 48-well plates&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4375816</td><td></td></tr><tr><td>Optical sealing tape&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4375323</td><td>Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier</td></tr><tr><td>U-bottomed 96-well plates</td><td>Fisher</td><td>11521943</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td>Life Technologies</td><td>S6650</td><td>For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692</td></tr><tr><td>SPSS statistics version 20</td><td>IBM</td><td></td><td>Other statistics packages will provide similar functionality</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.02</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Other statistics packages will provide similar functionality</td></tr><tr><td>Hand applicator (PA1)</td><td>3M</td><td>75-3454-4264-6</td><td></td></tr><tr><td>Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher scientific</td><td>10141520</td><td></td></tr></tbody></table>

determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry

Uma grande variedade de métodos estão disponíveis para a determinação da constante de dissociação entre uma proteína e as moléculas pequenas interagem. No entanto, a maioria destes requerem acesso a equipamento especializado, e muitas vezes exigem um grau de conhecimento para efetivamente estabelecer experimentos confiáveis ​​e analisar dados. Fluorimetria exploratória diferencial (DSF) está sendo usado cada vez mais como um método robusto para a triagem inicial de proteínas para interagir moléculas pequenas, tanto para a identificação de parceiros fisiológicas ou para a descoberta hit. Esta técnica tem a vantagem de que ele requer apenas uma máquina de PCR adequados para a PCR quantitativa, de modo adequado e instrumentação disponível na maioria das instituições; uma excelente gama de protocolos já estão disponíveis; e há fortes precedentes na literatura para múltiplos usos do método. Últimos trabalhos propôs vários meios de cálculo constantes de dissociação de dados QSD, mas estes são matematicamente exigente. Aqui, nós demtrar um método para estimar as constantes de dissociação a partir de uma quantidade moderada de dados experimentais DSF. Esses dados geralmente pode ser coletados e analisados ​​em um único dia. Demonstramos como diferentes modelos podem ser usados ​​para ajustar os dados coletados a partir de eventos de ligação simples, e onde os sítios de ligação ou ligação independente cooperativas estão presentes. Por fim, apresentamos um exemplo de análise de dados em um caso em que os modelos padrão não se aplicam. Estes métodos são ilustrados com os dados recolhidos em proteínas de controlo comercialmente disponíveis, e as duas proteínas do nosso programa de pesquisa. No geral, o nosso método fornece uma maneira simples para que os pesquisadores ganhar rapidamente uma visão mais aprofundada interações proteína-ligante utilizando DSF.

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Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Determinação de interacções proteína-ligante Usando Differential Scanning Fluorimetria

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

61.5K visualizações.  University of Exeter. Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

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Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Bioquímica

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the case of protein samples, DSC profiles provide information about thermal stability, and to some extent serves as a structural &#8220;fingerprint&#8221; that can be used to assess structural conformation. It is performed using a differential scanning calorimeter that measures the thermal transition temperature (melting temperature; Tm) and the energy required to disrupt the interactions stabilizing the tertiary structure (enthalpy; &#8710;H) of proteins. Comparisons are made between formulations as well as production lots, and differences in derived values indicate differences in thermal stability and structural conformation. Data illustrating the use of DSC in an industrial setting for stability studies as well as monitoring key manufacturing steps are provided as proof of the effectiveness of this protocol. In comparison to other methods for assessing the thermal stability of protein conformations, DSC is cost-effective, requires few sample preparation steps, and also provides a complete thermodynamic profile of the protein unfolding process.

Differential scanning calorimetry measures the thermal transition temperature(s) and total heat energy required to denature a protein. Results obtained are used to assess the thermal stability of protein antigens in vaccine formulations.

Calorimetria exploratória diferencial - um método para avaliar a estabilidade térmica e Conformação do Antigen Protein

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding interactions. This information is critical in the design of new pharmaceutical compounds. However, many pharmaceutically relevant ligands are chemically unstable at the high temperatures used in DSC analyses. Thus, measuring binding interactions is challenging because the concentrations of ligands and thermally-converted products are constantly changing within the calorimeter cell. Here, we present a protocol using thermolabile ligands and DSC for rapidly obtaining thermodynamic and kinetic information on the folding, binding, and ligand conversion processes. We have applied our method to the DNA aptamer MN4 that binds to the thermolabile ligand cocaine. Using a new global fitting analysis that accounts for thermolabile ligand conversion, the complete set of folding and binding parameters are obtained from a pair of DSC experiments. In addition, we show that the rate constant for thermolabile ligand conversion may be obtained with only one supplementary DSC dataset. The guidelines for identifying and analyzing data from several more complicated scenarios are presented, including irreversible aggregation of the biomolecule, slow folding, slow binding, and rapid depletion of the thermolabile ligand.

We present a protocol for rapid characterization of biomolecular folding and binding interactions with thermolabile ligands using differential scanning calorimetry.

Medição de perfis Biomolecular DSC com ligantes termolábeis para caracterizar rapidamente de dobramento e vinculação de interações

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

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Contraste de fase e de interferência diferencial Contrast Microscopy (DIC)

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Biologia

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Uma rápida e quantitativa método fluorimétrico para-Targeting proteína pequena molécula Rastreio de drogas

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Bioengenharia

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolume determinação da concentração de proteína utilizando o NanoDrop 2000c Espectrofotômetro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer composition). The utility of TSA, and specifically of nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), has been established over the years, both for finding conditions that help stabilize a specific protein and for looking at ligand binding by monitoring changes in the apparent Tm. This paper presents an efficient screening of the Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragment library (768 compounds) by the use of nano-DSF, monitoring Tm to identify potential fragment binding. The prerequisites regarding protein quality and concentration for performing nano-DSF experiments are briefly outlined followed by a step-by-step protocol that uses a nano-liter robotic dispenser commonly used in structural biology laboratories for preparing the required samples in 96-well plates. The protocol describes how the reagent mixtures are transferred to the capillaries needed for nano-DSF measurements. In addition, this paper provides protocols to measure thermal denaturation (monitoring intrinsic tryptophan fluorescence) and aggregation (monitoring light back-scattering) and the subsequent steps for data transfer and analysis. Finally, screening experiments with three different protein targets are discussed to illustrate the use of this procedure in the context of lead discovery campaigns. The overall principle of the method described can be easily transferred to other fragment libraries or adapted to other instruments.

Monitoring changes in the melting temperature of a target protein (i.e., thermal shift assay, TSA) is an efficient method for screening fragment libraries of a few hundred compounds. We present a TSA protocol implementing robotics-assisted nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) for monitoring intrinsic tryptophan fluorescence and light back-scattering for fragment screening.

Fluormetria de varredura nano-diferencial para triagem em descoberta de chumbo baseada em fragmentos

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

Detecção de alta sensibilidade da ligação composto-proteína usando fluorescência

Detection of CD40 Protein-Umbelliferone Interaction via Differential Scanning Fluorescence

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. Umbelliferone, an active ingredient in Tibetan medicine Vicatia thibetica, exhibits an immunomodulatory effect with an unknown mechanism. The CD40 protein is a key target in the immune response. Therefore, this study employs the principle of differential scanning fluorescence technology to analyze the interactions between CD40 protein and umbelliferone using fluorescent enzyme markers. Initially, the stability of the protein fluorescent orange dye was experimentally verified, and the optimal dilution ratio of 1:500 was determined. Subsequently, it was observed that the temperature melting (Tm) value of CD40 protein tended to decrease with an increase in concentration. Interestingly, the interaction between CD40 protein and umbelliferone was found to enhance the thermal stability of CD40 protein. This study represents the first attempt to detect the binding potential of small molecule compounds and proteins using fluorescence microplates and fluorescent dyes. The technique is characterized by high sensitivity and accuracy, promising advancements in the fields of protein stability, protein structure, and protein-ligand interactions, thus facilitating further research and exploration.

Autor em destaque: simplificando os métodos de PCR para maior acessibilidade e eficiência

This protocol describes a unique method for detecting the binding between compounds and protein molecules, offering the advantages of minimal protein sample loss and high data accuracy.

Detecção da interação proteína-umbeliferona CD40 por fluorescência de varredura diferencial

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. ...

Determinação de interacções proteína-ligante Usando Differential Scanning Fluorimetria

Resumo

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