Name: determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry
Uploaded: 2014-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
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This work was funded by grant from the BBSRC (grant number BB/H019685/1 and BB/E527663/1) to the University of Exeter.

1 Determinazione di un valore approssimativo per la costante di dissociazione (cioè, entro un ordine di grandezza) <ol><li> Preparare l&#39;impasto indicato nella tabella 1. </li><li> Preparare scorte del ligando di interesse a più alta concentrazione disponibile, e poi a sei dieci diluizioni al raddoppio del presente. Qualora un approssimativo K d è noto dai dati precedenti, puntare ad avere almeno due concentrazioni al di sopra e al di sotto del K d. </li><li> Aliquota 18 ml della miscela in otto pozzetti in un piatto qPCR. Aggiungere 2 ml di solvente per il primo pozzo. Aggiungere 2 ml di ciascun membro della serie di diluizioni ligando (punto 1.2) per un bene ciascuno dei rimanenti sette pozzi. </li><li> Posizionare una guarnizione qPCR sopra la piastra. Per ottenere una buona tenuta della piastra, posizionare un applicatore mano (vedi tabelle di reagenti specifici) al centro della piastra. Smooth premuto il sigillo di lato e ripetere sull&#39;altra metà dila piastra. </li><li> Centrifugare la piastra a 500 xg per due minuti per rimuovere le bolle d&#39;aria. </li><li> Porre la piastra in uno strumento StepOne qPCR. Selezionare l&#39;opzione &quot;curva Melt&quot;, i filtri ROX, e scegliere la velocità di rampa veloce (questo fornisce una pausa di 2 min a 25 ° C, seguita da una rampa a 99 ° C oltre 40 minuti, e poi 2 minuti di pausa). Eseguire un denaturazione termica. NOTA: I file di script per l&#39;esecuzione di una corsa sono disponibili online all&#39;indirizzo http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Al termine della corsa dello strumento, fare clic sul pulsante &quot;Analizza&quot; sullo schermo. Salvare il file risultato. </li><li> Aprire il software Protein Maiusc termica. <ol><li> Creare un nuovo studio; nella scheda delle proprietà, dare a questo un nome, e nella scheda Condizioni, dettaglio i ligandi. </li><li> Passare alla scheda File Experiment, e importare il file salvato risultati (XXX.eds), e impostare il contenuto di ogni pozzetto (template files sono disponibili presso gli autori). </li><li> Passare alla scheda Analisi, e premere il pulsante &quot;Analizza&quot;. NOTA: Questo analizzerà i risultati. E &#39;possibile esportare i risultati di ulteriori indagini con Excel utilizzando la scheda Esporta. I risultati vengono esportati in un formato scheda delineata. E &#39;meglio aprire il file esportato in Excel, e immediatamente salvare in formato Excel. </li></ol></li><li> Verificare che la proteina in presenza del solo solvente dà un risultato simile a quello mostrato nella Figura 1A. Avanti, esaminare le temperature di fusione osservate nei risultati nel riquadro &quot;replicare&quot;. Assicurarsi che questa mostra un chiaro aumento della temperatura di fusione con l&#39;aumento della concentrazione di ligando. NOTA: Idealmente, questo fornirà un chiaro temperatura massima di fusione (supponendo che la proteina è completamente ligando legato), e un approssimativo K d dove la temperatura di fusione è a metà strada tra la proteina-ligando libero eil massimo. </li></ol> 2 set-up sperimentale per la determinazione della costante di dissociazione <ol><li> Preparare l&#39;impasto indicato nella tabella 2 come master mix. </li><li> Preparare le scorte di legante a quindici diverse concentrazioni, che saranno diluiti dieci volte l&#39;esperimento finale. Idealmente, includere le concentrazioni di almeno due ordini di grandezza al di sopra e al di sotto della stima K d, e centrare le concentrazioni sul stimata K d. Focus su sette dei punti all&#39;interno di un ordine di grandezza della stima K d, con altri quattro punti su entrambi i lati di questo; se vi è una scelta, includere più punti a valori che stanno saturando. NOTA: Se necessario, è possibile modificare le condizioni sperimentali in modo tale che le scorte ligando sono al doppio della concentrazione sperimentale, dove ligando solubilità è limitante. </li><li> Aggiungere 120 ml di mastermescolare a otto pozzetti in una piastra ben fondo a U 96, a fungere da serbatoio per una comoda erogazione del master mix. Utilizzare una pipetta a 8 canali per erogare 18 microlitri in una colonna di una piastra PCR. Ripetere per altri cinque colonne, per un totale di 48 pozzetti riempiti in un modello 6 x 8 sulla piastra. </li><li> Aggiungere 20 ml di stock ligando, o il solvente, pozzetti in una piastra ben U-fondo 96. Usando una pipetta a 8 canali, aspirare 2 ml di otto diversi stock ligando (o solvente). Aggiungi questi per una colonna della piastra PCR che era pieno di master mix al passo 2.3. Ripetere con gli stessi otto ligando / scorte solvente per due ulteriori colonne. Aspirare 2 ml di restanti otto titoli leganti o solventi, e aggiungere questi per una quarta colonna nel piatto. Ripetere questa operazione per altre due colonne. Questo darà campioni in triplicato per tutti i 16 campioni di legante e solvente. </li><li> Inserite un sigillo qPCR sopra la piastra (vedi passo 1.4). </li><li> Centrifugare la piastra a 500 xg perdue min. </li><li> Posizionare la piastra nello strumento qPCR. Eseguire una denaturazione termica utilizzando i parametri specificati al punto 1.6. </li><li> Al termine della corsa dello strumento, fare clic sul pulsante &quot;Analizza&quot; sullo schermo. Salvare il file risultato. </li><li> Aprire il software Protein Maiusc termica. Creare un nuovo studio; nella scheda delle proprietà, dare a questo un nome, e nella scheda Condizioni, dettaglio i ligandi. </li><li> Passare alla scheda File Experiment, e importare il file salvato risultati (XXX.eds), e impostare il contenuto di ciascun pozzetto. NOTA: file di modello sono disponibili online all&#39;indirizzo http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Passare alla scheda Analisi, e premere il pulsante &quot;Analizza&quot;. <ol><li> Selezionare la scheda &quot;replicati&quot; dal menu sul lato sinistro dello schermo per mostrare i risultati come triplica. Valutare l&#39;affidabilità dei dati in base a come sono stretti i triplica. Should i triplicato mostrano scarsa riproducibilità, esaminare i dati grezzi da vicino. </li><li> Analizzare i dati utilizzando sia il Boltzmann o metodi derivati ​​per valutare la temperatura di fusione. Selezionare la scheda &quot;Replicare risultati&quot;, e nella &quot;Replica risultati complotto&quot;, spostare il &quot;complotto:&quot; tasto tra &quot;Tm - Boltzmann&quot; e &quot;Tm - Derivata&quot;. Selezionare il metodo che conferisce maggiore riproducibilità per il campione. Esportare i risultati di ulteriori indagini con Excel utilizzando la scheda Esporta. NOTA: Per i campioni che mostrano molteplici transizioni, è quasi sempre meglio usare il metodo Derivata in modalità multipla fusione. I risultati vengono esportati in un formato scheda delineata. E &#39;meglio aprire il file esportato in Excel, e immediatamente salvare in formato Excel. </li><li> Ripetere l&#39;esperimento almeno due volte, tra cui una ripetizione in un giorno separato, al fine di garantire la riproducibilità dei risultati. In caso di analisi dei dati (vedere il punto 3 di seguito)indicano che il valore di K d è significativamente diverso alla stima originale, alterare le concentrazioni di ligando di conseguenza (vedi punto 2.2) per garantire una buona gamma di valori intorno K d. </li></ol> 3 Analisi dei dati per determinare la costante di dissociazione sotto denaturazione termica <ol><li> Creare una tabella in Excel delle concentrazioni di ligando e la temperatura di fusione. </li><li> Aprire il software GraphPad Prism, e creare una tabella XY. Inserire i dati, utilizzando la colonna X per le concentrazioni di ligando e la colonna Y per la fusione risultati di temperatura. NOTA: un esempio è mostrato Figura 1B. Uno script con equazioni precaricati, e le istruzioni alternative per l&#39;utilizzo del pacchetto statistico SPSS, è disponibile online all&#39;indirizzo http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Nella scheda Analisi, selezionare l&#39;opzione per cambiare il parametro di analisis (Ctrl + T). Per inserire il modello corretto, selezionare &quot;Nuovo&quot; e &quot;Crea nuova equazione&quot;. Inserire l&#39;equazione indicato nella Tabella 3 come &quot;legame unico sito ligando&quot;. NOTA: Un esempio di questi passi è mostrato in Figura 1C. Quando si utilizza lo script con le equazioni precaricati, l&#39;equazione in questione può essere diretto scelti dalla lista piuttosto che inseriti. Derivazione di questa equazione è riportato in appendice. </li><li> Selezionare il &quot;Regolamento per i valori iniziali&quot; casella e inserire le regole per i valori iniziali come indicato nella tabella 3. </li><li> Vincolare il parametro P, come &quot;costante uguale a&quot; e inserire la concentrazione finale di proteine ​​(nelle stesse unità come il legante è dato in). </li><li> Selezionare OK per eseguire l&#39;analisi. NOTA: Un esempio di questi passi è mostrato in Figura 1D. Il software grafica produce una figura che mostra i dati e l&#39;adattamento al modello. Esempi di tanalisi hese sono riportati nei dati rappresentativi. </li></ol> 4. Montaggio dati a modelli cooperativi Per inserire i dati di un modello cooperativo, scegliere tra una un semplice modello cooperativo, o un modello in cui sono definite due costanti di dissociazione separati. Il primo approccio è preferito nel caso di cooperatività negativa, o come un primo esame. Tuttavia, in linea di principio è meglio in caso di cooperatività positiva per modellare due diverse costanti di dissociazione 18. In questo caso, la modellazione può procedere assumendo o sequenziale legame di ligandi, o un legame indipendente di leganti. <ol><li> Seguire gli stessi passi iniziali come nel protocollo 3 Tuttavia, al punto 3.3, inserire una delle equazioni nella tabella 3 elencata come &quot;Simple modello cooperativo&quot;, &quot;sequenziale vincolante di due ligandi&quot;, o &quot;Independent legame di due ligandi&quot; 18. </li><li> Selezionare le regole per i valori inizialiassociato a ciascuna di queste equazioni nella tabella 3. </li><li> Esaminare l&#39;adattamento del modello ai dati. Qualora i dati adattarsi male, prendere in considerazione un altro modello. NOTA: è anche importante esaminare con attenzione il montaggio della temperatura di fusione di dati da parte del software Maiusc termica Protein (passo 2,9): a volte è necessario modificare i parametri qui per ottenere i migliori risultati. Un&#39;altra considerazione è se la gamma di punti dati è l&#39;ideale, e se ci sono punti anomali: o una serie limitata di dati su entrambi i lati di K d, o un unico punto anomalo (specialmente alle più alte concentrazioni di ligando), può influenzare in modo significativo i risultati. </li><li> Ripetere l&#39;esperimento almeno due volte (vedi punto 2.12) per garantire la riproducibilità. </li></ol> 5. Montaggio dei dati per le curve che indicano Spostamenti binari in fusione Temperatura Di tanto in tanto, piuttosto che una risposta graduata a ligando, le proteine ​​sono stateosservato adottare una risposta binaria, dove campione legata sia chiaramente separata dalle campione non legato. Un esempio è fornito nei risultati rappresentativi (Figura 4). In questo caso, il montaggio delle temperature di fusione non fornirà una buona misura per K d. <ol><li> Esportare l&#39;output di dati grezzi dal Proteine ​​software Maiusc termica. Per ogni punto di temperatura, calcolare la fluorescenza media per il ligando zero e alte concentrazioni di ligando. Tabulare i risultati di ciascun punto dati accanto a questi. NOTA: L&#39;errore creato qui è inferiore errore nelle temperature di fusione a muro. </li><li> Aprire il pacchetto statistico SPSS. Copiare le temperature, le due serie di dati medi, e dati per ogni esperimento di una finestra di dati in SPSS. Nella scheda variabile, impostare il set di dati media per nessun ligando come &quot;Low&quot;, e il set di dati media per la più alta concentrazione di ligando come &quot;alto&quot;. </li><li> Scaricare il file di sintassi disponibileonline all&#39;indirizzo http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular</a> . Selezionare &quot;Esegui → Esegui tutti&quot;. </li><li> Copiare la proporzione risultati legati ad una nuova cartella di lavoro di Excel, con le relative concentrazioni di ligando. </li><li> Aprire il software GraphPad, e creare una tabella XY. Inserire i dati, utilizzando la colonna X per le concentrazioni di ligando e la colonna Y per la fusione risultati di temperatura. Nella scheda di analisi, selezionare &quot;Parametri cambiamento di analisi&quot;. Per inserire il modello corretto, selezionare &quot;Nuovo&quot; e &quot;Crea nuova equazione&quot;. Inserire l&#39;equazione data nella tabella 3, indicato come &quot;Analisi degli spostamenti binari a temperatura di fusione&quot;. </li><li> Selezionare la casella &quot;Norme per valori iniziali&quot;, e inserire le regole per i valori iniziali specificati nella tabella 3. Vincolare il parametro P, come &quot;costante uguale a&quot; e inserire la concentrazione finale di proteine ​​(nelle stesse unità della ligand è dato in). NOTA: esempi di completare queste scatole per il protocollo nella sezione 3 sono mostrati in figura 1C, D. </li><li> Se c&#39;è una buona misura, i risultati possono essere migliorati estrapolando al risultato atteso a una concentrazione del ligando infinita. Dal modello della percentuale legata a ciascuna concentrazione ligando, esaminare il valore per il valore più alto di concentrazione di ligando. Se questa è la 0.99 o superiore, ulteriori analisi è improbabile per migliorare i risultati. </li><li> Se la proporzione è minore di 0,99, un passaggio aggiuntivo è richiesto per correggere gli effetti della proteina non legata nel più alto campione concentrazione del ligando. Al punto 5.2, scrivere la percentuale di legante legato al più alto punto di concentrazione del ligando (dal punto 5.7) nella cella R2 (una cella diversa può essere utilizzato, e R2 sostituito opportunamente nell&#39;equazione nella tabella 3). Creare una colonna supplementare dopo la media dei risultati più alti di concentrazione ligando. Negli abeticellule T, copiare l&#39;equazione elencati nella Tabella 3 come &quot;estrapolazione all&#39;infinito concentrazione di ligando&quot;. Copia questa formula per le celle rimanenti in questa colonna. NOTA: Questo calcolo elimina l&#39;effetto della proteina non legata a più alta concentrazione di ligando. La differenza tra la proteina ligando libero e la più alta concentrazione ligando viene moltiplicato per il reciproco della proporzione vincolato alla massima concentrazione ligando per fornire la differenza attesa tra stati proteiche completamente legati e non legati ad ogni punto di temperatura. Questa differenza viene aggiunto o sottratto dallo stato non legato per dare la fluorescenza previsto per la proteina legante completamente legata. </li><li> Sostituire la colonna di concentrazione massima ligando nella scheda tecnica SPSS con questa nuova rubrica, e ripetere il raccordo dei dati. NOTA: i passaggi 5,7-5,9 può avere bisogno di essere ripetuta se il modello suggerisce un ulteriore cambiamento significativo della percentuale legata ai concentrazi massime ligando(se questo è il caso, probabilmente sarebbe l&#39;ideale per ripetere l&#39;esperimento con un più alto punto di concentrazione del ligando incluso). </li><li> Nei casi in cui la proteina mostra un comportamento cooperativo traslazione binaria e display, l&#39;equazione suggerito nel passaggio 5.5 dovrebbero essere sostituite con quelle dal punto 4.1. I parametri &quot;bottom&quot; &quot;Top&quot; e dovrebbero essere sostituiti da 1 e 0, rispettivamente. </li><li> Ripetere l&#39;esperimento almeno due volte (vedi punto 2.12) per garantire la riproducibilità. </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+alpha-D-glucose-1-phosphate+cytidylyltransferase+from+Salmonella+typhi.">Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi.</a> J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).</li><li>Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+the+GTP-GDP-operated+conformational+switch+of+selenocysteine-specific+translation+factor+SelB.">Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB.</a> J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have nothing to disclose.

Fluorimetria differenziale a scansione ha dimostrato il suo potere come un metodo robusto e versatile per la caratterizzazione delle proteine, e identificare potenziali ligandi proteici. I successi ben documentati in expediting stabilizzazione proteica, la scoperta di farmaci (in particolare nei laboratori meno ben finanziati) e cristallizzazione 10,23-25 ​​hanno reso un metodo interessante per lo screening iniziale dei composti. Composti aggiunti alle proteine ​​mostrano una dose di chiara dipendente aumento della temperatura di fusione apparente 7,9. Tuttavia, ci sono stati alcuni tentativi di utilizzare i risultati di questi esperimenti per determinare le costanti di legame apparente per aiutare nella classifica composti per la loro affinità. Qui, presentiamo un metodo per determinare sistematicamente una costante di dissociazione apparente di proteine ​​in presenza di un ligando. I risultati qui presentati dimostrano che DSF può rapidamente e robusta fornire stime della costante di dissociazione peruna combinazione di proteina-ligando. I dati osservati possono essere manipolati con gli strumenti disponibili in commercio di fornire una rapida determinazione di K d, senza la necessità di effettuare assunzioni riguardanti il valore probabile di parametri. Il metodo ha un vantaggio significativo su alcuni metodi comparabili di essere parsimoniosi in proteine ​​e tempo necessario. L&#39;esperimento descritto qui consumerà 0,13 mg di proteine ​​per dell&#39;esperimento (circa 0,4 mg per esperimenti ripetuti in triplice copia). Questo confronto con Calorimetria isotermica di titolazione (ITC), in cui un singolo esperimento con una media di 40 kDa consumerà un importo simile. La serie completa di esperimenti necessari per questo protocollo sarebbe consumare circa 4 ore, compresa la preparazione, per un singolo set di esperimenti. Ancora una volta, questo è probabile che sia molto più veloce di metodi come ITC o risonanza plasmonica di superficie, che pur potenti spesso richiedono notevole ottimizzazione per ottenere migliori dati. I nostri risultati dimostrano che permane l&#39;obbligo di esaminare attentamente i dati grezzi, la misura di questi dati per determinare la temperatura di fusione, e la misura dei dati di temperatura di fusione per determinare la costante di dissociazione. Un primo problema è la forma dei dati grezzi prodotti nella proteina di fusione. In alcuni casi, la forma non può approssimare a quello osservato nella Figura 1A. Problemi comuni includono bassi turni di temperatura sulla ligando vincolanti, sfondo di alta fluorescenza, e inusuali più transizioni di temperatura. A bassa temperatura turni sono visti sul legame un numero di ligandi. Per questo metodo, il parametro più critico è l&#39;errore nella misurazione T m, rispetto al cambiamento di temperatura. I dati di solito può essere montato abbastanza bene quando la deviazione standard delle misurazioni triplice copia non supera il 10% del turno di temperatura di fusione tra proteine ​​non legato e completamente legato. La nostra esperienza è che quando tale temperaturaturni lette- sono solo 2 ° C, questo può essere sufficiente per il montaggio dei dati, se i singoli punti di dati sono molto accurate. Un secondo problema è insolitamente a forma di curve. Questi spesso differiscono tra proteina libera e forme ligando legato, come il legame ligando influisce modalità della proteina dispiegarsi. In questi casi, l&#39;utente deve esaminare se i dati possono essere utilizzati con idonei considerazione dei modelli da utilizzare per la determinazione della temperatura di fusione e la costante di dissociazione. Un altro problema comune è che l&#39;aggiunta di un cofattore per la proteina (ad esempio, MgCl 2 nel nostro esempio con esochinasi) è necessario per ottenere i dati più affidabili. La nostra esperienza è stata che un attento esame di tutti i fattori che possono nell&#39;esperimento in fase di prendere dei valori iniziali è essenziale per ottenere i migliori risultati. Inoltre, i trattamenti teorici alternativi possono rivelare le caratteristiche di questi dati 15,17. Infine, non è raro che alcune proteine ​​che contain nativamente esposto regioni idrofobiche di mostrare sfondo ad alta fluorescenza. Ci sono una serie di soluzioni a questi problemi, che sono stati ampiamente recensito altrove 6,9. In particolare, l&#39;utente deve valutare se usare la Boltzmann o modelli derivati ​​(ad esempio, figura 4), ​​e nel caso di utilizzo di derivati, se più fusi devono essere modellati. I due metodi di modellazione del dispiegamento termico differiscono dal fatto che il metodo di Boltzmann adatta ai dati sperimentali di Boltzmann, assumendo una forma sigmoidale regolare la curva di dispiegamento. Al contrario, il metodo derivato prende la derivata prima dei dati sperimentali in ogni punto (pannello inferiore nella Figura 1A), e considera la temperatura di fusione di essere il punto di massima derivata prima. Il metodo derivato restituisce generalmente una temperatura di fusione più elevata di circa 2 - 3 ° C. La maggior parte delle proteine ​​torneranno una più coerenterisultato (ovvero, l&#39;errore standard della temperatura di fusione per esperimenti in triplo è inferiore) per uno dei due metodi. Questo è di solito intimamente legata alla forma precisa della proteina dispiegarsi curva, ed è necessario determinare empiricamente il metodo migliore in ciascun caso. Quando viene utilizzato il modello derivato, è anche importante considerare più eventi di fusione. Alcuni dati mostrano chiaramente le prove per più transizioni, e in questi casi i risultati sono suscettibili di essere più facile da interpretare, se questi eventi di fusione più sono modellati. Nel contesto di questo protocollo, è spesso il caso che l&#39;aggiunta del ligando può causare una proteina di passare da avere più transizioni di fusione di una singola transizione (ad esempio, stabilizzando il sottodominio più fragile termicamente), o viceversa. Vorremmo quindi sostenere che i dati grezzi vengono esaminati insieme prima di considerare quale approccio sarà meglio usare. Seguendo il modelling delle singole temperature di fusione, ulteriori problemi possono sorgere in raccordo questi per i modelli presentati nella sezione del protocollo. E &#39;indispensabile esaminare attentamente la misura di dissociazione equazione costante utilizzando una scala logaritmica, in quanto questa analisi evidenzia spesso discrepanze tra i dati osservati e il modello (es., Figura 3). Sebbene i risultati ottenuti sono generalmente robusti, cura nella interpretazione offre la possibilità di estrarre i risultati migliori, e più significato, dai dati. Un particolare problema sollevato da questi dati è l&#39;interpretazione che deve essere posizionato su proteine ​​che mostrano cooperatività, o più eventi vincolanti, in DSF. Abbiamo, ad oggi, solo osservato questo fenomeno in proteine ​​che sono tenuti ad avere più eventi di legame specifici (ad esempio, WCBM, una proteina il cui omologo migliore è un Multimer 26, e che agisce come un Multimer sulla dimensione cromatografia di esclusione [dati nonmostrato]). Non è affatto chiaro che la cooperatività negativa osservata in DSF denaturazione indica che l&#39;enzima mostrerà infine cooperatività negativa: anzi, questo può essere un indizio del legame complesso che deve essere esplorato più a fondo utilizzando una vasta gamma di metodi. Ciò suggerisce a noi, però, che più studi approfonditi di tali proteine ​​sono suscettibili di individuare gli effetti interessanti. I valori indicati per la costante di dissociazione con questo metodo sono generalmente dello stesso ordine di quelli forniti da altri metodi, come ad esempio Calorimetria isotermica di titolazione e risonanza plasmonica di superficie. Tuttavia, i valori assoluti osservati sono spesso superiori a quelli osservati con questi metodi. Questo è almeno in parte una conseguenza del fatto che la costante di dissociazione si osserva alla temperatura di fusione della proteina con ligando. Questo Kd è generalmente superiore a quella a temperature fisiologiche. Il dissociation costante è correlata alla temperatura della reazione dalle equazioni: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg" /> [1] <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg" /> [2] (Dove c θ è la concentrazione di riferimento standard, Δ r G è la variazione di energia libera di Gibbs della reazione, R è la costante dei gas molare, Δ H è la variazione di entalpia nella reazione, e Δ S è la variazione di entropia nella reazione .) Reazioni con costanti di dissociazione nell&#39;intervallo misurabile di questo metodo generalmente hanno un negativo Δ r G, e quindi l&#39;effetto di un aumento della temperatura sulla equazione [1] saranno aumentare la costante di dissociazione. Entrambi i termini Δ H e Δ S che costituiscono l&#39;energia libera di Gibbs (equazione [2]) sono temperature 27 dipendenti, e l&#39;effetto sulla costante di dissociazione dipenderanno dalla grandezza e segno di queste dipendenze di temperatura, e saranno necessariamente interazione dipendente. Di conseguenza, non è inaspettato che le costanti di dissociazione determinate con questo metodo sono a volte superiori a quelli determinati con metodi che operano a RT. Dipendenza dalla temperatura è, naturalmente, anche un avvertimento di molti altri metodi, che tendono a fornire la costante di dissociazione a temperature inferiori alla temperatura fisiologica. Un altro avvertimento del metodo DSF è che è un metodo marcato, a differenza ITC. L&#39;etichetta fluorescente utilizzato (SYPRO arancione) è idrofobo, e così in alcuni casi può competere con il legame di ligandi idrofobici alle proteine. Di conseguenza, è probabile che in alcuni casi, la costante di dissociazione ottenuto sarà artificialmente elevato a causa della competizione con l&#39;etichetta. Tuttavia, per il confronto di diversi ligandi, (l&#39;uso primario diDSF), le differenze è improbabile che siano sufficientemente significativo ai fini della graduatoria di composti per affinità. Un potenziale svantaggio di questo metodo è il limite di rilevamento che può essere raggiunto. In linea di principio, non dovrebbe essere possibile misurare con precisione un valore per K d, che è inferiore al 50% della concentrazione di proteine, e anche i valori di questa gamma sono suscettibili di essere di dubbia precisione. Mentre il limite di rivelazione in questo fine dell&#39;intervallo può essere esteso un po riducendo le concentrazioni di proteine ​​e colorante, la sensibilità dello strumento impedirà un&#39;ulteriore riduzione della concentrazione proteica. Analogamente, l&#39;estremità superiore della sensibilità sarà determinata dalla solubilità del ligando. Per ottenere una stima matematicamente robusto per K d, è molto importante per ottenere dati con il 90% delle proteine ​​presenti nella forma ligando-bound, che richiede concentrazioni di ligando ad essere approssimativaly dieci volte K d (supponendo che non cooperatività). Il limite di rivelazione sarà quindi necessariamente essere un decimo della solubilità del ligando nel buffer pertinente. Ciò significa che i limiti di rivelazione del metodo in genere compresi tra 1 mM e tra 1 e 100 mm, a seconda della proteina e ligando. In conclusione, a scansione differenziale fluorimetria è una tecnica versatile applicabile ad una vasta gamma di proteine. Usando i metodi qui presentati, è possibile determinare rapidamente ed economico l&#39;affinità di una proteina per diversi ligandi. Questo ha un grande potenziale per l&#39;applicazione nella purificazione della proteina e la stabilizzazione, chiarendo la funzione o la specificità degli enzimi provenienti da metagenomi, e nella scoperta della droga, soprattutto nei piccoli laboratori.

Tutte le proteine ​​si legano, con affinità diverse, ad una vasta gamma di altre molecole di ioni semplici ad altre grandi macromolecole. In molti casi, le proteine ​​si legano a molecole piccole parti come parte della loro normale funzionamento (ad esempio, una chinasi legame ATP). Altre interazioni possono essere estranei alla funzione, ma sono sperimentalmente utili come strumenti (ad esempio, piccole molecole che stabilizzano le proteine ​​per migliorare il successo di cristallizzazione, o aiutare a mantenere le proteine ​​in soluzione); mentre piccole molecole che si legano ai siti attivi e siti allosterici di proteine ​​può agire come inibitori, e quindi modulare l&#39;attività degli enzimi. Vi è un&#39;ampia gamma di tecniche che possono essere utilizzate per determinare l&#39;affinità di proteine ​​per molecole partner. Calorimetria isotermica di titolazione 1 è ampiamente considerato come un &quot;gold-standard&quot;, in quanto fornisce informazioni sulle reazioni ricco, è l&#39;etichetta libera, e ha limitato le opportunità per unrtifacts dell&#39;esperimento. Tuttavia, nonostante i recenti miglioramenti nella sensibilità della strumentazione e automazione del set-up sperimentale, è ancora relativamente costoso in termini di fabbisogno proteico, ha al massimo un rendimento basso-medio, ed è più adatto alle interazioni con moderata a affinità alta (10 Nm a 100 mM K d) 2. Altra etichetta metodi gratuiti come risonanza plasmonica di superficie o doppio strato interferometria 3 offerta throughput più elevati, e hanno raggiunto la sensibilità per rilevare molecole più piccole a partire da 100 bis. Tuttavia, gli strumenti high throughput per questi metodi sono relativamente costosi, sono giustificati solo se ci sarà un continuo rendimento di progetti rilevanti, e quindi sono suscettibili di essere inaccessibile a molti laboratori universitari. Fluorimetria differenziale a scansione (DSF, o thermofluor) è stato descritto nel 2001 4 come metodo per la scoperta di nuovi farmaci. In questo metod, proteine ​​vengono incubati con un colorante fluorescente (stati usati coloranti inizialmente naftalen-solfonico), che ne modifica la fluorescenza dopo il legame alle regioni idrofobiche delle proteine. Il campione di proteina-colorante viene poi riscaldata, e la fluorescenza monitorato come aumenta il calore. Il dispiegamento della proteina, e l&#39;esposizione di parti idrofobiche della proteina, dà luogo ad un pattern caratteristico della fluorescenza in funzione della temperatura (Figura 1A). L&#39;esperimento può essere eseguita in piccoli volumi in qualsiasi strumento commerciale quantitativa PCR, e quindi in un singolo esperimento, un gran numero di campioni può essere simultaneamente testati (solitamente 48, 96 o 384 campioni, a seconda del modello di strumento). Esperimenti di solito può essere eseguita in circa un ora, fornendo la possibilità di alto rendimento analisi dei campioni 5. Ulteriori miglioramenti della metodologia hanno visto l&#39;adozione di coloranti con migliori proprietà spettrali 6,7 </sup&gt;, strumenti generici per l&#39;analisi dei dati, e suggerito protocolli per lo screening iniziale di 8,9. La gamma di applicazioni del metodo è stato esteso, con un focus particolare sulla creazione di condizioni ottimali per la preparazione e la conservazione delle proteine ​​10, e sull&#39;identificazione di potenziali partner di legame per aiutare la cristallizzazione 11. Il relativamente alto rendimento del metodo, costo relativamente basso contenuto di proteine ​​(~ 2 mg per reazione), e l&#39;applicabilità di studiare molecole leganti deboli ha fatto DSF uno strumento prezioso per frammento basato progettazione di farmaci, soprattutto in un contesto accademico 12-14. Nonostante l&#39;ampia applicazione di DSF per studiare le interazioni proteina-ligando, pochi studi hanno descritto determinazione delle costanti di dissociazione da questi studi. Tuttavia, questi hanno la tendenza a produrre equazioni dettagliate che descrivono lo svolgersi della proteina, con molti parametri che devono essere installati i dati sparsi o in alcuni casi estimated 7,15-17. Questi metodi sono di particolare rilevanza nei casi difficili, come ad esempio i composti strettamente vincolanti, o proteine ​​che mostrano le transizioni insolite. Tuttavia, per molti laboratori, queste analisi dettagliate sono troppo ingombranti per l&#39;uso di routine. Proponiamo quindi trattamenti alternativi per diversi scenari, e dimostrare come questi possono essere usati per adattare i dati risultanti dalle diverse interazioni proteina-ligando. Il nostro metodo utilizza lo strumento StepOne qPCR, per la quale software di analisi dei dati su misura è disponibile; mentre questo accelera l&#39;analisi dei dati, i risultati da altri strumenti possono essere elaborati con i metodi precedentemente pubblicati 9, e la stessa analisi a valle possono essere eseguite.

<table><tbody><tr><td>StepOne real time PCR instrument</td><td>Life Technologies</td><td>4376357</td><td>DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis.</td></tr><tr><td>Protein thermal shift software v1.0</td><td>Life Technologies</td><td>4466037</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast optical 48-well plates&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4375816</td><td></td></tr><tr><td>Optical sealing tape&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4375323</td><td>Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier</td></tr><tr><td>U-bottomed 96-well plates</td><td>Fisher</td><td>11521943</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td>Life Technologies</td><td>S6650</td><td>For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692</td></tr><tr><td>SPSS statistics version 20</td><td>IBM</td><td></td><td>Other statistics packages will provide similar functionality</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.02</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Other statistics packages will provide similar functionality</td></tr><tr><td>Hand applicator (PA1)</td><td>3M</td><td>75-3454-4264-6</td><td></td></tr><tr><td>Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher scientific</td><td>10141520</td><td></td></tr></tbody></table>

determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry

Una vasta gamma di metodi attualmente disponibili per determinare la costante di dissociazione tra una proteina e interagendo piccole molecole. Tuttavia, la maggior parte di questi richiedono l&#39;accesso alle attrezzature specialistiche, e spesso richiedono un certo grado di esperienza per stabilire efficacemente esperimenti affidabili e analizzare i dati. Fluorimetria a scansione differenziale (DSF) viene sempre più utilizzato come metodo affidabile per lo screening iniziale delle proteine ​​per interagire piccole molecole, sia per identificare i partner fisiologiche o per la scoperta colpo. Questa tecnica ha il vantaggio che richiede solo una macchina PCR adatti per PCR quantitativa, e quindi idonea strumentazione è disponibile nella maggior parte delle istituzioni; un&#39;eccellente gamma di protocolli sono già disponibili; e vi sono forti precedenti nella letteratura per molteplici utilizzi del metodo. Lavoro passato ha proposto diverse modalità di calcolo costanti di dissociazione dai dati DSF, ma questi sono matematicamente esigente. Qui, abbiamo DEMstrare un metodo per stimare le costanti di dissociazione da una moderata quantità di DSF dati sperimentali. Questi dati possono generalmente essere raccolti e analizzati in un solo giorno. Dimostriamo come i diversi modelli possono essere utilizzati per adattare i dati raccolti da semplici eventi vincolanti, e dove sono presenti siti di legame di cooperazione o indipendenti vincolante. Infine, presentiamo un esempio di analisi dei dati nel caso in cui non si applicano modelli standard. Questi metodi sono illustrati con i dati raccolti sulle proteine ​​di controllo disponibili in commercio, e due proteine ​​del nostro programma di ricerca. Nel complesso, il nostro metodo fornisce un modo semplice per i ricercatori di acquisire rapidamente una visione più interazioni proteina-ligando con DSF.

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Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

61.5K Views.  University of Exeter. Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

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Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Ricerca

Biochimica

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the case of protein samples, DSC profiles provide information about thermal stability, and to some extent serves as a structural &#8220;fingerprint&#8221; that can be used to assess structural conformation. It is performed using a differential scanning calorimeter that measures the thermal transition temperature (melting temperature; Tm) and the energy required to disrupt the interactions stabilizing the tertiary structure (enthalpy; &#8710;H) of proteins. Comparisons are made between formulations as well as production lots, and differences in derived values indicate differences in thermal stability and structural conformation. Data illustrating the use of DSC in an industrial setting for stability studies as well as monitoring key manufacturing steps are provided as proof of the effectiveness of this protocol. In comparison to other methods for assessing the thermal stability of protein conformations, DSC is cost-effective, requires few sample preparation steps, and also provides a complete thermodynamic profile of the protein unfolding process.

Differential scanning calorimetry measures the thermal transition temperature(s) and total heat energy required to denature a protein. Results obtained are used to assess the thermal stability of protein antigens in vaccine formulations.

Calorimetria a scansione differenziale - Un metodo per la valutazione della stabilità termica e la conformazione della proteina dell&#39;antigene

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding interactions. This information is critical in the design of new pharmaceutical compounds. However, many pharmaceutically relevant ligands are chemically unstable at the high temperatures used in DSC analyses. Thus, measuring binding interactions is challenging because the concentrations of ligands and thermally-converted products are constantly changing within the calorimeter cell. Here, we present a protocol using thermolabile ligands and DSC for rapidly obtaining thermodynamic and kinetic information on the folding, binding, and ligand conversion processes. We have applied our method to the DNA aptamer MN4 that binds to the thermolabile ligand cocaine. Using a new global fitting analysis that accounts for thermolabile ligand conversion, the complete set of folding and binding parameters are obtained from a pair of DSC experiments. In addition, we show that the rate constant for thermolabile ligand conversion may be obtained with only one supplementary DSC dataset. The guidelines for identifying and analyzing data from several more complicated scenarios are presented, including irreversible aggregation of the biomolecule, slow folding, slow binding, and rapid depletion of the thermolabile ligand.

We present a protocol for rapid characterization of biomolecular folding and binding interactions with thermolabile ligands using differential scanning calorimetry.

Misurazione di profili biomolecolari DSC con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contrasto di fase e interferenza differenziale contrasto (DIC) Microscopia

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Biologia

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Una rapida e quantitativa metodo fluorimetrico per lo screening di stupefacenti piccole molecole di proteine ​​Targeting

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Bioingegneria

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer composition). The utility of TSA, and specifically of nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), has been established over the years, both for finding conditions that help stabilize a specific protein and for looking at ligand binding by monitoring changes in the apparent Tm. This paper presents an efficient screening of the Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragment library (768 compounds) by the use of nano-DSF, monitoring Tm to identify potential fragment binding. The prerequisites regarding protein quality and concentration for performing nano-DSF experiments are briefly outlined followed by a step-by-step protocol that uses a nano-liter robotic dispenser commonly used in structural biology laboratories for preparing the required samples in 96-well plates. The protocol describes how the reagent mixtures are transferred to the capillaries needed for nano-DSF measurements. In addition, this paper provides protocols to measure thermal denaturation (monitoring intrinsic tryptophan fluorescence) and aggregation (monitoring light back-scattering) and the subsequent steps for data transfer and analysis. Finally, screening experiments with three different protein targets are discussed to illustrate the use of this procedure in the context of lead discovery campaigns. The overall principle of the method described can be easily transferred to other fragment libraries or adapted to other instruments.

Monitoring changes in the melting temperature of a target protein (i.e., thermal shift assay, TSA) is an efficient method for screening fragment libraries of a few hundred compounds. We present a TSA protocol implementing robotics-assisted nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) for monitoring intrinsic tryptophan fluorescence and light back-scattering for fragment screening.

Fluorimetria a scansione nano-differenziale per lo screening nella scoperta di piombo basata su frammenti

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

Rilevamento ad alta sensibilità del legame composto-proteina mediante fluorescenza

Detection of CD40 Protein-Umbelliferone Interaction via Differential Scanning Fluorescence

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. Umbelliferone, an active ingredient in Tibetan medicine Vicatia thibetica, exhibits an immunomodulatory effect with an unknown mechanism. The CD40 protein is a key target in the immune response. Therefore, this study employs the principle of differential scanning fluorescence technology to analyze the interactions between CD40 protein and umbelliferone using fluorescent enzyme markers. Initially, the stability of the protein fluorescent orange dye was experimentally verified, and the optimal dilution ratio of 1:500 was determined. Subsequently, it was observed that the temperature melting (Tm) value of CD40 protein tended to decrease with an increase in concentration. Interestingly, the interaction between CD40 protein and umbelliferone was found to enhance the thermal stability of CD40 protein. This study represents the first attempt to detect the binding potential of small molecule compounds and proteins using fluorescence microplates and fluorescent dyes. The technique is characterized by high sensitivity and accuracy, promising advancements in the fields of protein stability, protein structure, and protein-ligand interactions, thus facilitating further research and exploration.

Autore in primo piano: Semplificazione dei metodi PCR per una maggiore accessibilità ed efficienza

This protocol describes a unique method for detecting the binding between compounds and protein molecules, offering the advantages of minimal protein sample loss and high data accuracy.

Rilevamento dell'interazione proteina-umbelliferone CD40 tramite fluorescenza a scansione differenziale

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. ...

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

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