We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Cura&#231;ao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.

NOTA: Reagentes para estar preparado para Face Serial Bloco de imagens de amostras de coral 1. Preinfiltration Wax <ol><li> Melt 3,6 g de flocos de estearina de uma proveta de vidro. Misture bem em uma placa quente (60-70 ° C). </li><li> Adicionar 400 mg de Sudan IV (para minimizar cera fluorescência de fundo). Misturar bem e esperar até que uma solução de vermelho translúcido é alcançado. </li><li> Adicionar 96 ml de parafina fundida a quente (100%) e misturar bem. </li></ol> 1.2) Embedding Wax <ol><li> Melt 7,2 g de flocos de estearina de uma proveta de vidro e misturar bem em uma placa quente (60-70 ° C). </li><li> Adicionar 0,8 g de Sudan IV. Misturar bem e esperar até que uma solução de vermelho translúcido é alcançado. </li><li> Adicionar grânulos de parafina (162 g) e misture até parafina derrete completamente. </li><li> Adicionar 30 g de branco granular Vybar e derreter completamente no mesmo copo; uma vez derretido, misturar. </li><li> Genericamente fechar o frasco de vidro com tampa. Coloque a garrafa de vidro em um 60 ° C convecção oven para manter os ingredientes no estado líquido. Realizar todas as infiltrações neste forno. </li><li> Dividir o volume total de 200 mL a cera vermelha em duas garrafas de vidro de 100 ml cada. Use uma alíquota para a infiltração e o outro para a incorporação final. </li></ol> 1.3) Incorporação de Coral Os tecidos para o Bloco de série cara Imagem <ol><li> Lave os pólipos de coral coletadas em campo (SI vídeo 1) e armazenados (3-6 meses em 4-5 ° C em paraformaldeído) em tampão fosfato (3x 5 min) e descalcificação quando estiver pronto para ser trabalhada. Descalcificação dos pólipos em solução Excal por 24 horas ou até que os pólipos são totalmente desprovidos de CaCO3. Incubar vários corais descalcificadas como um único bloco de uma série 25, 50, 75, e 100% de etanol, seguido por 1x substituto de xileno para desidratar as amostras. </li><li> Coloque os pólipos processados ​​em forno pré-aquecido a 65 ° C, contendo 100% substituto xileno. Incubar durante 30 minutos duas vezes por Changing a solução fresca. Orientar os pólipos de tal maneira que a parte superior dos pólipos está voltado para baixo e a superfície superior é tão plana quanto possível. </li><li> Adicione soluções de 2: 1, 1: 1 e 1: 2 e xileno substituto de cera preinfiltration (passo 1.1) em 50 mL de tubos Falcon. </li><li> Incubar os pólipos com estes três concentrações crescentes de cera preinfiltration, seguido por incubação em 3x 100% preinfiltration cera durante 30-60 min de cada vez. </li><li> Nota: Dependendo da espessura das amostras, os passos 1.3.1-1.3.5 pode ser aumentado com períodos mais longos de tempo. </li><li> Mova as amostras para a incorporação de cera (veja o passo 1.2.6) após incubação 3x em 100% preinfiltration cera. </li><li> Remover a cera incorporação após 30 min. Substituir com cera incorporação fresca e continuar a incubação durante um período mínimo de 4 horas a 65 ° C. </li></ol> 1.4) Incorporação em Red Wax <ol><li> Fotografe o bloco (a bandeja de aço inoxidável onde a cera branca é colocado e em cima do que o sample é colocado). Isto é necessário porque uma vez incorporado na cera, o local da amostra irá tornar-se invisível, como a cera é a incorporação de vermelho opaco. </li><li> Coloque pequenas gotas de cera ponto alto ponto de fusão em torno do novo aço inoxidável pré-aquecido molde a incorporação e deixe-o esfriar. Despeje uma pequena quantidade de cera derretida de embutir recém segundo recipiente como indicado no passo 1.2.6. </li><li> Posicionar o pólipo coral voltado para baixo rapidamente através da cera de ponto branco, em seguida, colocar num suporte de amostras de plástico no tabuleiro de aço inoxidável e despeje cera mais de incorporação de modo a que a cera vem para a superfície do molde de plástico. </li><li> Leve toda a configuração de 65 ° C forno e deixe esfriar em um banco ou uma superfície fria até que a cera endurece completamente. </li><li> Isto pode demorar até 6 horas ou dois dias. Colocar o bloco dessecada no frigorífico a 4 ° C, protegida da luz, para o armazenamento a longo prazo. </li></ol> 1.5) Seccionamento da série de configuração do bloco de Rosto <ol><li> Trim o bloco e cortada 1 mM seções usando um micrótomo. Não coletar as seções como eles vão se tornar como pó. Lembre-se, nós estamos imaginando apenas o rosto bloco. A amostra é exibida quando a cera branca começa a desaparecer. </li><li> Captar imagens da face do bloco liso que contém a amostra de cada vez que uma secção é removida. Continue até que o pólipo coral desaparece como em SI Video 2. </li><li> Record / capturar as imagens com uma câmera monocromática utilizando um filtro fluorescente FITC para pegar a auto-fluorescência do cromatóforos / coral pólipo. Imagem 3-4 núcleos descalcificados de cada espécie. </li></ol> 2. de imagem Corais Sob Dois fótons de microscopia de fluorescência <ol><li> Corrigir núcleos de pólipos de coral, cada um contendo cerca de 10-12 pólipos cerca de uma polegada de diâmetro, em paraformaldeído a 4% no local de coleta (beira-mar), assim que eles são colhidos sob a água. </li><li> Manter as amostras a 4 ° C até à imagiologia. Núcleos lavados são colocados em poe mesma solução de cabeça para baixo em um prato fundo de vidro da tampa (0.17 mm de espessura). </li><li> Usando um laser de dois fótons em 780 nm de excitação, imagem 3-4 pólipos em duas ampliações diferentes (zoom digital) com um (NA 0.3) objetiva de 10X. A forma pólipo coral ea altura varia entre as amostras (geralmente 1-2 mm) e profundidade de imagem também é limitada pela distância de trabalho do objetivo da imagem. </li><li> Use o modo de digitalização telha de recolher cerca de 25-100 (5 x 5 ou 10 x 10 telhas) imagens por plano focal em xy e 50-100 imagens através do eixo z no intervalo de 10 ou 20 um, totalizando cerca de 5.000-10.000 images / pólipo coral. </li><li> Imagem 3-4 áreas de pólipos para representar um núcleo e coral espécie. NOTA: A imagem tempo de aquisição varia entre 2-5 horas / área de pólipo. </li><li> Armazenar todas as imagens no formato de dados brutos no disco rígido do sistema como LSM 5 de renderização 3D em uma análise de imagens 3D e software de renderização. </li></ol> Volume Rendering 3 3D e Visualization de SBFI e de dois fótons de fluorescência espectral de dados <ol><li> Cortar os dados 2D para reduzir o tamanho do arquivo, concentrando-se em um único pólipo usando a ferramenta de corte quadrado no programa e compilar em um único arquivo TIFF (reduzir o tamanho do arquivo também por salvar o arquivo no formato de 8 bits) no software de aquisição. </li><li> Abra os arquivos montados dos dados SBFI (recolhidas no passo 1.5.1) ou os azulejos vários z pilhas de secções ópticas de dois fótons (recolhidas no passo 2.1.4) no programa Imaris Ultrapasse módulo sob algoritmo volume. </li><li> Projetar os dados SBFI prestados em 3D usando uma projeção de sombra. Criar um modo isosuperfície onde os voxeis são limiarizados para criar um padrão de superfície sólida (SI vídeo 3). </li><li> Visualize as projeções em 3D usando um algoritmo de plano de corte em xy, xz e modos ortogonais yz para revelar estrutura 3D e forma dos corais. </li><li> Animar as projeções usando um módulo de chave quadro de animação no mesmo programa Imaris (SI Videos 3-7). </li><li> Gerar arquivos de vídeo em 5% de compressão e gerar um clips de vídeo em formato AVI com volumes (SI Vídeos 4 e 6), 3D e isosuperfície modalidades (SI Vídeos 5 e 7). </li></ol>

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The authors declare no conflict of interests.

Pesquisa recife de coral é um esforço de pesquisa altamente interdisciplinar, envolvendo análise da simultânea físicos, químicos e fenômenos biológicos que atuam no ambiente marinho. O estudo dos ecossistemas de recifes de coral complexos é, portanto, melhor concluída dentro de &quot;Powers of Ten&quot; quadro contextual (Figura 10). Este gráfico ilustra que a compilação do ecossistema coral abrange uma ampla gama de dimensões espaciais (10 -9 a 10 5 m). Além disso, ...

O aquecimento global e as mudanças ambientais que o acompanha estão afetando diretamente a saúde e distribuição de corais marinhos tropicais 1-4. Múltiplos impactos estão sendo observados, incluindo branqueamento de corais e do surgimento de doenças infecciosas 5-6. No entanto, a previsão mais precisa do futuro resposta coral a estas ameaças ambientais, é necessário que a &quot;linha de base&quot; histológico ser estabelecida, que define a morfologia do tecido e composição celular e distribuição de corais &quot;aparentemente saudáveis&quot;. Por sua vez, &quot;impactado&quot; corais podem então ser comparados quantitativamente. Além disso, deve ser estabelecido essa linha de base para os corais aparentemente saudáveis ​​sob uma variedade de condições ambientais, de modo que &quot;a resposta saudável&quot; também pode ser medido através de gradientes ambientais. Como passo inicial para estabelecer essa linha de base, um estudo 3D de alta resolução foi realizado de forma aparentemente saudável coral tecido pólipomorfologia e composição celular responde ao aumento da profundidade da água (WD), e diminuição de acompanhamento na luz solar irradiância. Os resultados podem então ser usados ​​para estabelecer um entendimento mecanicista mais abrangente de adaptação coral, bem como para obter insights sobre a evolução coral-simbionte ea melhoria da coleta de luz. Corais duros (Scleractinia) são animais invertebrados marinhos coloniais que abrigam um complexo conjunto de outros microrganismos, colectivamente referidos como o coral holobiont 7-10. A pesquisa realizada no presente estudo procura usar um conjunto de tecnologias de imagem de última geração para monitorar simultaneamente alterações com o aumento da profundidade da água nos tecidos e pigmentos zooxantelas simbióticas de corais hospedeiros aparentemente saudáveis. Isto irá estabelecer o tecido celular comparativa &quot;linha de base&quot; necessária através de um gradiente batimétrico para corais aparentemente saudáveis ​​e funcionam como indicadores de coral health 10. Pigmentos Coral, chamados cromatóforos, agir no sentido de absorver, refletir, dispersão, refração, difração, ou de outra forma interferir com a radiação solar incidente 11. A relação endosymbiotic zooxantelas-chromatophore permitiu a co-evolução de otimização decolheita estrategicamente vantajoso e estratégias de crescimento do esqueleto, bem como plasticidade trófica (estratégias de alimentação deslocando para trás e para a frente de autotrofia para heterotrofia) para o animal coral 12. A ilha caribenha de Curaçao sul (que fazia parte das Antilhas Holandesas) fica a cerca de 65 km ao norte da Venezuela dentro da tensão leste-oeste Aruba-La Blanquilla arquipélago (Figura 1A). A costa 70 quilômetros de comprimento sul de Curaçao contém um contínuo moderno e Mioceno-Plioceno-Pleistoceno-Holoceno antigo franjas recife de coral trato 13,14. SST média anual em Curaçao varia aproximadamente de 3 ° C anually, variando de um mínimo de 26 ° C no final de janeiro para um máximo de 29 ° C no início de setembro, com uma temperatura média anual de 27,5 ± 0,5 º C (NOAA SST conjuntos de dados, 2000-2010). O recife de coral em Playa Kalki (12 ° 22&#39;31.63 &quot;N, 69 ° 09&#39;29.62&quot; W), encontrando-se perto da ponta noroeste da Curaçao (Figura 1A), foi escolhida por amostragem, porque tem sido previamente bem estudado eo ecossistema marinho neste local é banhado em fresco nonpolluted 7,15-19 água do mar. . Duas espécies de coral escleractíneos intimamente relacionados, M. annularis e M faveolata, foram escolhidos para a experimentação e análise neste estudo, pois cada espécie: (1) as distribuições batimétricas exposições distintas e não sobrepostas sobre o trato recife no que diz respeito à quebra da plataforma e do ambientes de sedimentação de carbonato sedimentares associados (intervalo annularis M. = 0-10 m WD; M. faveolatagama = 10-20 m WD 20; Figuras 1B, 2A, e 2B); (2) é um coral comum construtor quadro recife ao longo do Mar do Caribe 21; e (3) tem bem estudado ecológica, fisiológica e relações evolutivas 22. Amostragem de campo para o presente estudo foi realizado utilizando técnicas de mergulho com cilindro padrão no mar de Playa Kalki em Curaçao. A batimétrica água rasa transecto-a-fundo foi estabelecido que correu pela prateleira, sobre a quebra da plataforma, e nos ambientes profundos recifes tona de água. Aparentemente corais saudáveis ​​foram identificados por amostragem ao longo do transecto batimétrico, incluindo: (1) três indivíduo ~ 1 m corais diâmetro de M. annularis, todos os quais foram a 5 m de profundidade de água (WD); e (2) três individuais ~ 1 m corais diâmetro de M. faveolata, todos os quais foram a 12 m WD. Radiação fotossinteticamente ativa (PAR) foi medido como 33-36% PAR a 5 m WD e 18-22% PAR 10 m WD. A amostragem foi realizada em janeiro, quando o SST foi de 26 ° C, nas profundidades de água de ambos os 5 m e 12 m. Cada uma dessas seis cabeças de coral foi coletada em triplicata em posições espaciais equivalentes (ie., Cerca de 45 ° N de latitude em cada um dos seis cabeças de coral hemisféricas). Cada amostra individual consistia em um 2,5 cm de diâmetro coral núcleo biópsia de tecido-esqueleto que foi coletado com arco soco limpo. Três biópsias de tecidos-esqueleto de coral foram amostrados em SCUBA padrão com as mãos enluvadas de cada uma das cabeças de coral (9 de M. annularis colônias em 5 m WD e 9 de M. faveolata a 12 m WD). Imediatamente após a recolha em profundidade, cada amostra de biópsia do núcleo foi colocado num tubo de centrífuga de 50 ml de polipropileno estéril, selado com tampa de rosca, e retornado para a superfície. A água do mar foi decantado a partir de cada tubo de centrifugação e cada biópsia foi então imerso, armazenados e transportados em paraformaldeído a 4%. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; imagem SBFI já foi realizado em uma grande variedade de amostras biológicas, incluindo todo o cérebro e tecidos humanos de coração inteiro, os embriões intactos rato, embriões de peixe zebra, e vários tipos de amostras de animais com ossos intactos 23-30. A maioria destes estudos utilizaram microscopia óptica / light ou com fluorescência ou técnicas de campo brilhantes. No entanto, estudos têm sido realizados no ultra-grandes ampliações utilizando eletrônica de varredura bloco de série rosto de imagem no passado 31. No presente estudo, um protocolo modificado SBFI foi desenvolvido e aplicado para a corais, pela primeira vez. Porque M. annularis e M. corais faveolata são de 1-2 mm de espessura, nenhuma das técnicas de microscopia de luz de rotina seria capaz de penetrar em toda a espessura do tecido de coral pólipo. Portanto, temos SBFI protocolo de preparação da amostra projetado especificamente para amostras de coral. Além disso, temos projetado um suporte estereoscópico, Que tem um motor para mover em ambas as direcções x e y. Este aparelho tem as imagens da face do bloco de amostra, em vez de recolher as secções utilizando um micrótomo regular em frente do microscópio. Nós também introduzido um outro de dois fotões técnica de microscopia óptica não-linear de imagem das mesmas os pólipos em toda a espessura dos tecidos de coral. Isto ultrapassa as limitações impostas pela SBFI em termos de descalcificação e a possibilidade de alterações na morfologia do tecido e volume (encolhimento) que podem ser induzidas, por uma preparação de amostra (desidratação) e protocolos de processamento. Além disso, os perfis de emissão dos corais foram espectralmente resolvido para identificar as suas emissões de pico e variações entre os cromatóforos e as zooxantelas fotossintética. Estes resultados foram avaliados no contexto do método utilizado e as suas vantagens em relação a cada tempo de aquisição, a análise do tempo, e a capacidade de resolver os detalhes estruturais finos sem comprometer structural integridade do tecido de coral.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coral Tissue Skeleton</td>
			<td>None</td>
			<td>None</td>
			<td>2.5 cm Biopsy from natural habitat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arch Punch Coring Device</td>
			<td>C.S. Osborne and Company</td>
			<td>No. 149</td>
			<td>For Coral biopsy collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15700</td>
			<td>16% Pre-diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear/Safeclear II</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 64111-04</td>
			<td>Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene and Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Richard Allen Scientific</td>
			<td>Type H REF 8338</td>
			<td>Infiltration solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybar</td>
			<td>The Candle Maker</td>
			<td>None</td>
			<td>Component of Red Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stearin</td>
			<td>The Candle Maker</td>
			<td>None</td>
			<td>Component of Red Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S667-25</td>
			<td>Red Wax-Opaque background</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin (WGA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>W32466</td>
			<td>For labeling&#160; Coral Mucus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36095</td>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro Dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD-35-100</td>
			<td>For two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Motor, Driver and Controller</td>
			<td>Lin Engineering</td>
			<td>211-13-01R0, R325, R256-RO</td>
			<td>XY Translational Movement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>DC-220</td>
			<td>Melting all wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convection Oven</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>DX-600</td>
			<td>Infiltration and Embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ASP 300</td>
			<td>Dehydration, Infiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2055</td>
			<td>Disposable knifes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stereolumar V 12</td>
			<td>1.5x (30 mm WD) Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope with ApoTome</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axiovert M 200, ApoTome I System</td>
			<td>Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiocam camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>MRm</td>
			<td>Monochrome camera 1388x1040 pixels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Version 4.8</td>
			<td>Image acquisition program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Photon Laser</td>
			<td>Spectraphysics</td>
			<td>Maitai eHP, pulsed laser (70 fs)</td>
			<td>With DeepSee module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 710 with Spectral Detector</td>
			<td>34 channel PMT detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>2010 or above</td>
			<td>for two-photon and spectral image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Suite Software</td>
			<td>Bitplane, Inc.,</td>
			<td>Version 7.0 or above</td>
			<td>3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal optical microscopy methods reveal polyp tissue morphology and structure in caribbean reef building corals

Um conjunto integrado de técnicas de imagem foi aplicada para determinar a morfologia tridimensional (3D) e estrutura celular dos tecidos dos pólipos que compreende os corais construtores de recifes do Caribe Montastraea annularis e M. faveolata. Estas abordagens incluem a microscopia de fluorescência (FM), bloco de série rosto de imagem (SBFI), e microscopia de dois fótons de varredura a laser confocal (TPLSM). SBFI fornece imagens de tecidos profundos após a secção física; detalha o tecido da superfície de textura e visualização 3D em profundidades de tecido de mais de 2 mm. FM Complementar e rendimento TPLSM imagens de resolução ultra-alta de tecido estrutura celular. Os resultados: (1) identificar previamente não declarada morfologias tecido lobulados na parede externa de pólipos de corais individuais e (2) criou os primeiros mapas de superfície da distribuição 3D e tecido densidade de cromatóforos e endossimbiontes dinoflagellate zooxanthellae algas-like. Spectral ervilha absorçãoks de 500 nm e 675 nm, respectivamente, sugerem que M. annularis e M. faveolata conter tipos semelhantes de clorofila e cromatóforos. No entanto, M. annularis e M. faveolata apresentam diferenças significativas na densidade do tecido e 3D distribuição destes componentes celulares principais. Este estudo sobre métodos de imagem indica que SBFI é extremamente útil para a análise de amostras de grandes mm escala de tecidos corais descalcificadas. FM e TPLSM cortesia revelar mudanças de escala submillimeter sutis na distribuição celular e densidade em amostras de tecido coral nondecalcified. A técnica TPLSM proporciona: (1) preparação minimamente invasivo da amostra, (2) capacidade de corte óptico superior, e (3) a absorção de luz e dispersão mínima, enquanto continua a permitir imagiologia dos tecidos profundos.

Um aparelho de SBFI personalizados (fabricado especificamente para o presente estudo, a Figura 3) produziu os primeiros detalhadas em 3D de mapas digitais de elevação (MDEs) da textura da superfície exterior e morfologia do M. annularis e M. pólipos de coral faveolature (Figura 4 e SI Vídeos 1-2). Isto produziu imagens de lóbulos empilhados previamente undescribed de tecido de coral concentricamente irradiando para fora a partir do centr...

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Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Um conjunto integrado de técnicas de imagem foi aplicada para determinar a morfologia do pólipo e estrutura do tecido no corais do Caribe Montastraea annularis e M. faveolata. Fluorescência, rosto bloco de série, e microscopia de varredura a laser confocal de dois fótons identificaram estrutura lobate, paredes de pólipos, e chromatophore estimado e densidades zooxanthellae e distribuições.

Multimodal ópticos métodos de microscopia Revelar Polyp Tissue Morfologia e Estrutura em Caribe Reef construção Corais

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

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Research

JoVE Journal

Environment

12.2K visualizações.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  Um conjunto integrado de técnicas de imagem foi aplicada para determinar a morfologia do pólipo e estrutura do tecido no corais do Caribe Montastraea annularis e M. faveolata. Fluorescência, rosto bloco de série, e microscopia de varredura a laser confocal de dois fótons identificaram estrutura lobate, paredes de pólipos, e chromatophore estimado e densidades zooxanthellae e distribuições. 

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Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of natural proteins have a molecular mass between 40 - 200 kDa1,2, a robust and high-throughput method with a nanometer resolution capability is needed. Negative staining (NS) electron microscopy (EM) is an easy, rapid, and qualitative approach which has frequently been used in research laboratories to examine protein structure and protein-protein interactions. Unfortunately, conventional NS protocols often generate structural artifacts on proteins, especially with lipoproteins that usually form presenting rouleaux artifacts. By using images of lipoproteins from cryo-electron microscopy (cryo-EM) as a standard, the key parameters in NS specimen preparation conditions were recently screened and reported as the optimized NS protocol (OpNS), a modified conventional NS protocol 3 . Artifacts like rouleaux can be greatly limited by OpNS, additionally providing high contrast along with reasonably high&#8208;resolution (near 1 nm) images of small and asymmetric proteins. These high-resolution and high contrast images are even favorable for an individual protein (a single object, no average) 3D reconstruction, such as a 160 kDa antibody, through the method of electron tomography4,5. Moreover, OpNS can be a high&#8208;throughput tool to examine hundreds of samples of small proteins. For example, the previously published mechanism of 53 kDa cholesteryl ester transfer protein (CETP) involved the screening and imaging of hundreds of samples 6. Considering cryo-EM rarely successfully images proteins less than 200 kDa has yet to publish any study involving screening over one hundred sample conditions, it is fair to call OpNS a high-throughput method for studying small proteins. Hopefully the OpNS protocol presented here can be a useful tool to push the boundaries of EM and accelerate EM studies into small protein structure, dynamics and mechanisms.

More than half of proteins are small proteins (molecular mass &#60;200 kDa) that are challenging for both electron microscope imaging and three-dimensional reconstructions. Optimized negative staining is a robust and high-throughput protocol to obtain high contrast and relatively high resolution (~1 nm) images of small asymmetric proteins or complexes under different physiological conditions.

Optimizado coloração negativa: um protocolo de alta capacidade para Examinando pequeno e assimétrico Estrutura de proteínas por microscopia eletrônica

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Ambiente

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental changes. Repeated sampling to monitor these changes in forest soils is a relatively new practice that is not well documented in the literature and has only recently been broadly embraced by the scientific community. The objective of this protocol is therefore to synthesize the latest information on methods of soil resampling in a format that can be used to design and implement a soil monitoring program. Successful monitoring of forest soils requires that a study unit be defined within an area of forested land that can be characterized with replicate sampling locations. A resampling interval of 5 years is recommended, but if monitoring is done to evaluate a specific environmental driver, the rate of change expected in that driver should be taken into consideration. Here, we show that the sampling of the profile can be done by horizon where boundaries can be clearly identified and horizons are sufficiently thick to remove soil without contamination from horizons above or below. Otherwise, sampling can be done by depth interval. Archiving of sample for future reanalysis is a key step in avoiding analytical bias and providing the opportunity for additional analyses as new questions arise.

Repeated soil sampling has recently been shown to be an effective way to monitor forest soil change over years and decades. To support its use, a protocol is presented that synthesizes the latest information on soil resampling methods to aid in the design and implementation of successful soil monitoring programs.

Métodos de Reamostragem do solo para monitorar as mudanças nas concentrações químicas de Solos Florestais

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Building Double-decker Traps for Early Detection of Emerald Ash Borer

Emerald ash borer (EAB) (Agrilus planipennis Fairmaire), the most destructive forest insect to have invaded North America, has killed hundreds of millions of forest and landscape ash (Fraxinus spp.) trees. Several artificial trap designs to attract and capture EAB beetles have been developed to detect, delineate, and monitor infestations. Double-decker (DD) traps consist of two corrugated plastic prisms, one green and one purple, attached to a 3 m tall polyvinyl chloride (PVC) pipe supported by a t-post. The green prism at the top of the PVC pipe is baited with cis-3-hexenol, a compound produced by ash foliage. Surfaces of both prisms are coated with sticky insect glue to capture adult EAB beetles. Double-decker traps should be placed near ash trees but in open areas, exposed to sun. Double-decker trap construction and placement are presented here, along with a summary of field experiments demonstrating the efficacy of DD traps in capturing EAB beetles. In a recent study in sites with relatively low EAB densities, double-decker traps captured significantly more EAB than green or purple prism traps or green funnel traps, all of which are designed to be suspended from a branch in the canopy of ash trees. A greater percentage of double decker traps were positive, i.e., captured at least one EAB, than the prism traps or funnel traps that were hung in ash tree canopies.

Effective traps to attract and capture the emerald ash borer (EAB) are a key element of detecting and managing this invasive pest. Double-decker traps, placed in full sun near ash trees, incorporate visual and olfactory cues and were more likely to capture EAB than other trap designs in field trials.

Construção de dois andares armadilhas para detecção precoce de cinzas Esmeralda Borer

Emerald ash borer (EAB) (Agrilus planipennis Fairmaire), the most destructive forest insect to have invaded North America, has killed hundreds of millions ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol for performing in situ juvenile exposure tests within oligotrophic river catchments over one-month and three-month periods. Two methods (in both modifications) are presented to evaluate the juvenile growth and survival rate. The methods and modifications differ in value for the locality bioindication and each has its benefits as well as limitations. The sandy cage method works with a large set of individuals, but only some of the individuals are measured and the results are evaluated in bulk. In the mesh cage method, the individuals are kept and measured separately, but a low individual number is evaluated. The open water exposure modification is relatively easy to apply; it shows the juvenile growth potential of sites and can also be effective for water toxicity testing. The within-bed exposure modification needs a high workload but is closer to the conditions of a natural juvenile environment and it is better for reporting the real suitability of localities. On the other hand, more replications are needed in this modification due to its high-hyporheic environment variability.

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

In situ bioindications enable determination of the suitability of an environment for endangered mussel species. We describe two methods based on the juvenile exposure of freshwater pearl mussels in cages to oligotrophic river habitats. Both methods are implemented in variants for open water and hyporheic water environments.

Bioindicação teste de adequação de ambiente de fluxo para jovens de água doce da pérola mexilhões usando métodos de exposição em Situ

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular substrates offer key advantages over cell-based aAPC, including precise control of signal presentation parameters and physical properties of the aAPC surface to modulate its interactions with T cells. aAPC constructed from anisotropic particles, particularly ellipsoidal particles, have been shown to be more effective than their spherical counterparts at stimulating T cells due to increased binding and larger surface area available for T cell contact, as well as reduced nonspecific uptake and enhanced pharmacokinetic properties. Despite increased interest in anisotropic particles, even widely accepted methods of generating anisotropic particles such as thin-film stretching can be challenging to implement and use reproducibly.
To this end, we describe a protocol for the rapid, standardized fabrication of biodegradable anisotropic particle-based aAPC with tunable size, shape, and signal presentation for T cell expansion ex vivo or in vivo, along with methods to characterize their size, morphology, and surface protein content, and to assess their functionality. This approach to fabricating anisotropic aAPC is scalable and reproducible, making it ideal for generating aAPC for &#34;off-the-shelf&#34; immunotherapies.

Here, we present a protocol to quickly and reproducibly generate biologically inspired, biodegradable articifical antigen presenting cells (aAPC) with tunable size, shape, and surface protein presentation for T cell expansion ex vivo or in vivo.

Fabricação de anisotrópica poliméricas Artificial células apresentadoras para ativação de células T CD8 +

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales

Biofilms are a most successful microbial lifestyle and prevail in a multitude of environmental and engineered settings. Understanding biofilm morphogenesis, that is the structural diversification of biofilms during community assembly, represents a remarkable challenge across spatial and temporal scales. Here, we present an automated biofilm imaging system based on optical coherence tomography (OCT). OCT is an emerging imaging technique in biofilm research. However, the amount of data that currently can be acquired and processed hampers the statistical inference of large scale patterns in biofilm morphology. The automated OCT imaging system allows covering large spatial and extended temporal scales of biofilm growth. It combines a commercially available OCT system with a robotic positioning platform and a suite of software solutions to control the positioning of the OCT scanning probe, as well as the acquisition and processing of 3D biofilm imaging datasets. This setup allows the in situ and non-invasive automated&#160;monitoring of biofilm development and may be further developed to couple OCT imaging with macrophotography and microsensor profiling.

Microbial biofilms form complex architectures at interphases and develop into highly scale-dependent spatial patterns. Here, we introduce an experimental system (hard- and software) for the automated acquisition of 3D optical coherence tomography (OCT) datasets. This toolset allows the non-invasive and multi-scale characterization of biofilm morphogenesis in space and time.

Tomografia de coerência óptica 3D automatizada para elucidar a morfogênese do biofilme sobre grandes escalas espaciais

Biofilms are a most successful microbial lifestyle and prevail in a multitude of environmental and engineered settings. Understanding biofilm ...

Split Point Analysis and Uncertainty Quantification of Thermal-Optical Organic/Elemental Carbon Measurements

Researchers from myriad fields frequently seek to quantify and classify concentrations of carbonaceous aerosols as organic carbon (OC) or elemental carbon (EC). This is commonly accomplished using thermal-optical OC/EC analyzers (TOAs), which enable measurement via controlled thermal pyrolysis and oxidation under specific temperature protocols and within constrained atmospheres. Several commercial TOAs exist, including a semi-continuous instrument that enables on-line analyses in the field. This instrument employs an in-test calibration procedure that requires relatively frequent calibration. This article details a calibration protocol for this semi-continuous TOA and presents an open-source software tool for data analysis and rigorous Monte Carlo quantification of uncertainties. Notably, the software tool includes novel means to correct for instrument drift and identify and quantify the uncertainty in the OC/EC split point. This is a significant improvement on the uncertainty estimation in the manufacturer&#8217;s software, which ignores split point uncertainty and otherwise uses fixed equations for relative and absolute errors (generally leading to under-estimated uncertainties and often yielding non-physical results as demonstrated in several example data sets). The demonstrated calibration protocol and new software tool enabling accurate quantification of combined uncertainties from calibration, repeatability, and OC/EC split point are shared with the intent of assisting other researchers in achieving better measurements of OC, EC, and total carbon mass in aerosol samples.

This article presents a protocol and software tool for the quantification of uncertainties in the calibration and data analysis of a semi-continuous thermal-optical organic/elemental carbon analyzer.

Análise de ponto dividido e quantificação de incerteza de medições de carbono orgânico/Elemental de óptica térmica

Researchers from myriad fields frequently seek to quantify and classify concentrations of carbonaceous aerosols as organic carbon (OC) or elemental carbon ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Estimativa do índice de área foliar usando três métodos distintos em stands deciduous puros

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

Bactérias rotuladas fluorescently como um Tracer para revelar novas vias de fluxo de carbono orgânico em ecossistemas aquáticos

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, or proteostasis. Caenorhabditis elegans occupies a unique and powerful niche for HSR research because the HSR can be assessed at the molecular, cellular, and organismal levels. Therefore, changes at the molecular level can be visualized at the cellular level and their impacts on physiology can be quantitated at the organismal level. While assays for measuring the HSR are straightforward, variations in the timing, temperature, and methodology described in the literature make it challenging to compare results across studies. Furthermore, these issues act as a barrier for anyone seeking to incorporate HSR analysis into their research. Here, a series of protocols is&#160;presented for measuring induction of the HSR in a robust and reproducible manner with RT-qPCR, fluorescent reporters, and an organismal thermorecovery assay. Additionally, we show that a widely used thermotolerance assay is not dependent on the well-established master regulator of the HSR, HSF-1, and therefore should not be used for HSR research. Finally, variations in these assays found in the literature are discussed and best practices are proposed to help standardize results across the field, ultimately facilitating neurodegenerative disease, aging, and HSR research.

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Here, standardized protocols are presented to assess induction of the heat shock response (HSR) in Caenorhabditis elegans using RT-qPCR at the molecular level, fluorescent reporters at the cellular level, and thermorecovery at the organismal level.

Métodos padronizados para medir a indução da resposta de choque térmico em elegans caenorhabditis

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...