Este protocolo facilita a identificação e isolamento de populações de células de coral vivos em um nível de descrição não possível anteriormente. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o acesso a um nível de especificidade celular que até agora tem sido quase inatingível. Demonstrando o procedimento estará a Dra.
Para configurar o citômetro de fluxo para classificação de células de coral ao vivo, abra um novo modelo de projeto no software do citrômetro de fluxo e selecione os lasers apropriados para a análise no painel laser. Em seguida, crie um gráfico de dispersão lateral versus dispersão para a frente nas parcelas apropriadas para configurar a estratégia de gating e análise. Para análise citométrica de fluxo e triagem das células de coral vivos, carregue a amostra celular não manchada de controle na câmara amostral do cítômetro e inicie o processo de leitura.
Como as células de coral são particularmente frágeis, mantenha a pressão do cítômetro baixa para evitar a lise celular. No gráfico de dispersão, ajuste a tensão multiplicadora de fotos para centralizar os pontos e comece a registrar os eventos. No gráfico de dispersão dianteira versus lateral, crie um portão ao redor das células em torno da marca 10 até a 4ª marca no eixo x de dispersão dianteira.
Substitua a amostra de controle pela primeira amostra de células manchadas e registou aproximadamente 10.000 células antes de fazer uma pausa. Em seguida, portão os eventos que são exclusivos para o grupo amostral manchado. Para classificar as células de coral vivas, depois de selecionar a população celular de interesse no software do citómetro de fluxo, coloque um tubo de microcentrifusagem contendo 250 a 500 microliters da solução de coleta apropriada na câmara de coleta de cítmetros para cada população classificar.
Uma vez que uma quantidade apropriada de tempo tenha passado para eliminar os detritos, comece a classificar a população desejada para coletar entre 10.000 e vários milhões de células. Cada vez que uma nova mancha, espécie ou classificador é usado, classifique pelo menos 20.000 células de interesse em 500 microliters de meio de coloração para permitir que uma verificação de pureza seja realizada na população de interesse e reanalisar as células classificadas para confirmar que os eventos estão sendo lidos dentro do portão usado para a triagem inicial. Para estudos in vitro, armazene as células classificadas no gelo até que sejam transferidas para uma incubadora ou ambiente esterilizado.
Para trazer outras partículas não celulares que não compartilham a mesma forma ou granularidade que as células de coral podem ser removidas da análise criando uma seleção de portão em um gráfico de dispersão para frente e lateral. As células mortas podem ser excluídas comparando o sinal DAPI das suspensões celulares não manchadas e manchadas usando um histograma e gating as células altas expressas por DAPI. Em paralelo, as células que hospedam a simbiodeneasia de autofluorescência podem ser removidas gating contra células com o sinal alto no canal vermelho distante.
Após esse processo de gating iterativo, as células remanescentes representam as populações de células de coral vivas intactas que carecem de simbiodeneasia. Essas células podem então ser classificadas em diferentes subpopulações celulares por coloração para características como atividade reativa de espécies de oxigênio e/ou conteúdo líssomo. É fundamental lembrar que algumas células são mais frágeis do que outras e executar esse processo com o mais cuidado possível.
Uma vez que células específicas tenham sido isoladas, elas podem ser usadas para ensaios funcionais x-vivo, como estabelecer culturas celulares e criar perfis transcriômicos.
