Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.

O protocolo consiste em três etapas principais: o primeiro passo compreende a preparação de extracto de compósito em meios de cultura; a segunda diz respeito a Primary fibroblastos humanos gengivais (HGF) de cultura de células, o contato de células com os extratos compostos e coloração de células; a terceira etapa consiste de imagem confocal e análise de sinal fluorescente. Para tecidos gengivais tomar, o protocolo foi aprovado em conformidade com a legislação francesa, o consentimento informado eo comitê de ética local. 1. Composite Extratos Preparação Use meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) como meio de eluição. Assegure-se que a relação entre a área de superfície das amostras e o volume de meio de extracção é no nível mais baixo dos requisitos ISO 10993/12. O procedimento é descrito recentemente 11 e descritas resumidamente a seguir: <ol><li> Formar amostras esféricas do compósito dental não curado usando um porão sob medidaer. O tamanho titular é de 2 mm de raio, que está de acordo com a profundidade de cura geralmente recomendado no tratamento clínico oral. </li><li> Prepare-se poços de placas, cada uma contendo 1 ml de meio de cultura (DMEM), com uma mistura de 5% de penicilina / estreptomicina e 1% de anfotericina mas sem soro bovino fetal (FBS). </li><li> Amostras de cura dentro do meio DMEM contendo bem usando uma lâmpada de luz LED com um 1.070 mW cm -2 intensidade (λ = 465-475 nm) por 40 segundos. Assegure-se que a distância entre a ponta e as amostras de cura está na gama de 0,5 mm. Utilize este modo de cura para simular o contato temporário entre o dente eo compósito dental não curado. Em situação clínica, o contacto ocorre quando o compósito restaurador é colocada na cavidade oral. </li><li> Incubar as amostras (compósitos espécimes em meio DMEM) a 37 ° C sob atmosfera humidificada de 5% de CO 2 no ar. Incubar meio DMEM (sem amostras compostas) para células de controlo nas mesmas condições. </li></ol> 2. HGF Cultura de Células, Composite Extratos Testes e células marcadas <ol><li> O crescimento e manutenção de culturas de células Isolar fibroblastos gengivais humanos saudáveis ​​de biópsias de tecido gengival de pacientes tomadas durante extrações ortodônticas de rotina. <ol><li> Cultivar fibroblastos gengivais humanos em DMEM em presença de 10% de FBS, 5% de Penicilina / Estreptomicina e 1% de anfotericina B. Manter as células a 37 ° C na incubadora sob uma atmosfera humidificada de 5% de CO 2 no ar. </li><li> Médias trocado a cada 3 dias, e de passagem células a cada cinco dias. Depois de atingir a confluência, as células de colheita por tripsinização. </li><li> Centrifugar células a 90 xg durante 5 minutos e re-suspendê-las no meio de cultura. Contagem de células com um contador de células cetro de mão automático. </li><li> Suspensão de células de semente a uma densidade celular de 2,5 x 10 4 células / ml em um sistema de câmara de corrediça. Permitir que a incubação das células durante a noite a 37 ° C numa atmosfera de 5%. </li></ol></li><li> A adição de extractos de compostos para as células em cultura <ol><li> Substitua o material de dois poços da lâmina câmara por 1 ml dos extratos compostos testados (após 24 horas de incubação). </li><li> Manter as duas restantes poços de controlo (células) nas mesmas condições. </li><li> Incubar a lâmina câmara que contém os quatro poços a 37 ° C na incubadora, sob uma atmosfera humidificada de 5% de CO 2 no ar. </li></ol></li><li> Coloração fluorescente Use o Vivo mancha / citotoxicidade Morto por células eucarióticas de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: o kit fornece um teste de fluorescência rápida de duas cores para determinar a viabilidade de células em uma população com base na integridade da membrana plasmática e atividade esterase. A mancha distinguir vivo a partir de células danificadas por marcação simultaneamente com verde-fluorescente de Calceina-AM para indicar a actividade de esterase intracelular e vermelho fluorescentes homodímero de etídio-1 (EthD-1) para indicar a perda de Membrane integridade. <ol><li> Preparar uma solução de trabalho dos dois reagentes mancha contendo 2 uM de Calceína AM e 4 uM EthD-1 (concentração final relatada como sendo adequados para a coloração de fibroblastos). Adicionar a mancha para as células aderentes cultivadas na presença ou na ausência dos extractos compostos seleccionados. </li><li> Observar diretamente e rapidamente as populações de células coradas no mínimo, 15 minutos após a coloração e através da imagem time-lapse. Não centrífuga e não fixe as células coradas. </li></ol></li></ol> 3. confocal Time Lapse Imagem e Análise de Sinais O sistema utilizado é equipado com um laser de diodo de quatro unidades e uma imagem multi-corados para até quatro corantes fluorescentes para cada espécime. O sistema pode realizar um mapeamento de imagem (ampliação de 10X), que dá uma visão geral da amostra de teste em que se pode mover-se para observar uma região de interesse (ampliação 600X). <ol><li> Time lapse imagem <ol><li> Coloque os specimens (o slide câmara contendo as amostras coradas) no quarto escuro da incubadora integrado confocal (37 ° C, 5% de CO 2 e atmosfera húmida). </li><li> Selecione os lasers correspondentes. Use as duas fontes de laser 473 nm (15 mW) e 559 nm (18 mW) para excitar Calcein e EthD-1. </li><li> Use um modo para dois seqüencial para adquirir imagens através de seqüências de linha sem interferência na imagem com os dois corantes fluorescentes usadas. </li><li> Usar um detector com um espectro recentemente desenvolvido para definir automaticamente as condições de acordo com o corante de fluorescência na unidade de digitalização. </li><li> Optimizar as larguras de banda de fluorescência detectada para cada canal para o máximo. Grave todas as aquisições sequencialmente para evitar potencial cross-talking. </li><li> Selecione as condições de imagem mais adequados com base na seleção corante fluorescente usando o software de aquisição. </li><li> Adquirir uma imagem do Mapa que é automaticamente criado a partir do centro em um padrão espiral,com a área de interesse a ser facilmente selecionados para uma análise mais aprofundada. </li><li> Selecione o modo de observação. Escolha até cinco tipos de modos de observação, incluindo time-lapse, Z-stack, e multi-área, conforme necessário. Use uma combinação de Z-stack e modos de lapso de tempo no presente estudo e concluir rapidamente a captura de imagem, </li><li> Mudar e mudar o corante fluorescente. Alternativamente, sobrepor a fluorescente e as imagens de contraste de luz com o outro. Observar imagens ao vivo usando o ponto selecionado na tela mapa da esquerda inferior. </li><li> Determine a área de imagem, utilizando o enquadramento e as funções de zoom. Opcionalmente, alternar entre as telas para cada tipo de corante fluorescente. NOTA: O microscópio utilizado neste protocolo tem a mesma funcionalidade que um alto confocal convencional em um design compacto. O microscópio é equipado com objetivos de imersão em água invertidos que são perfeitamente adaptados para estável de imagem time-lapse de células vivas com uma incubadora de built-in simplificado. </lEu&gt; </ol></li><li> Análise de sinais e quantificação <ol><li> Use o software de imagem para quantificar o sinal de fluorescência. Obter cinco imagens de mapas com o objetivo 10X tanto para controle de amostra e de células testadas. </li><li> Obtido 1024 × 1024 pixels imagens regulares, com um tamanho de 0,231 mm × 0,231 pixels? M. Armazenar imagens no formato Olympus Imagem (OIF) para a análise de sinais. Este formato permite armazenar vários ajustes de parâmetros e imagens juntos. Use diferentes ferramentas de análise (medição do perfil de intensidade, relação de intensidade entre os dois canais utilizados). </li><li> Armazene as imagens de projeção máximas como arquivos TIFF de 12 bits / pixel. </li><li> Preformas análises estatísticas utilizando o software R comandante. Analisar as diferenças por meio de análise unidirecional de variância (ANOVA) com um teste de repetição. Relate os resultados como média desvio padrão (± DP) e significância estatística de p &lt;0,05. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests, they have nothing to disclose.

Comportamento do material biocompatibilidade é o parâmetro mais pré-requisito para ser avaliado antes de uso médico. As normas internacionais cobrir dispositivos médicos ISO 10993 33 e, especificamente, materiais dentários ISO 7405 34. A ausência de efeitos tóxicos para as células vizinhas é a norma fundamental na avaliação da biocompatibilidade desses materiais. É por isso que a análise da citotoxicidade tem tanta importância na avaliação de material odontológico biocompatibilidade 35-37. A ISO sugeriu métodos de ensaio pode ser baseada em atividade metabólica ou a integridade da membrana. Terminais seleccionados devem seguir as condições específicas para a classificação de efeitos adversos induzidos por um material de teste, a fim de minimizar o tempo e o custo dos ensaios de avaliação. O método atual de investigação (3D tempo confocal lapso de imagem) é a integridade da membrana baseado. A avaliação da citotoxicidade através deste parâmetro parece ser um marcador válido para biocompa celulartibilidade com materiais testados e é também ISO aprovado endpoint. Testes in vitro são projetados para determinar como uma amostra de material afeta um tipo particular de célula. O ensaio colorimétrico MTT foi originalmente descrito por Mossman (1983) como um método útil para a medição da citotoxicidade in vitro e a proliferação celular. O ensaio MTT baseia-se na conversão do sal de tetrazólio em cristais de formazano por células activas, que determina a actividade mitocondrial. Isso pode ser traduzido por taxa de viabilidade 38. Gupta e colaboradores relataram que o teste MTT é o método mais amplamente utilizado para medir a citotoxicidade das resinas compostas. Succínico desidrogenase e respostas de fosfatase alcalina também têm sido utilizados para o mesmo fim 39. No entanto, as células de destino não pode ser seguido para cima, uma vez que o ensaio MTT requer matando as células em cada ponto de tempo de medição. A fim de acompanhar mais de perto o comportamento das células coradas no estudo atual, diobservação rect de células vivas foi realizado, graças ao tempo de imagem lapso MCVL combinado com uma pequena mancha de protocolo, análise de imagem automatizada e quantificação sinal fluorescente. Compósitos odontológicos vêm em estreito contacto com os tecidos orais, especialmente células gengivais e pulpares. Fibroblastos seria o alvo dos componentes liberados a partir destes compósitos restauradores 40-41. Além disso, vários estudos têm relatado que as células imortalizadas e células primárias podem ter diferentes respostas celulares em contato com biomateriais. As células primárias foram encontrados para ser mais apropriado para avaliar os efeitos biomateriais 42. Isto explica o uso de células de fibroblastos gengivais humanos primários como modelo para a avaliação da citotoxicidade celular do compósito dentário testado no presente estudo. O potencial de toxicidade das substâncias liberadas de compósito dental tem sido amplamente estudada 43-44. A fim de avaliar tele potencial citotóxico de materiais, duas células modelo de contacto pode ser realizado. No sistema modelo de contacto directo do material é directamente colocado com células-alvo, enquanto no sistema de contacto indirecto, as células alvo estão em contacto com elui a partir de meios biológicos. Em aplicações clínicas e de procedimentos restauradores, composto dental são colocados em contato indireto com os tecidos gengivais. Por este motivo, o protocolo experimental corrente foi focada no sistema de contacto indirecto com fibroblastos gengivais humanos (células na presença dos compostos testados extractos). Como relatado anteriormente por Dahl e colaboradores, as respostas de citotoxicidade foram classificados como graves (&lt;30%), moderado (30-60%), ligeiro (60-90%) ou não-citotóxico (&gt; 90%) com base na actividade relativa aos Os valores obtidos para os controles 45. Portanto, de acordo com este ranking, e à luz dos resultados obtidos (Tabela 1), composto ELS extra baixa retração poderia ser classificado como very ligeiramente citotóxico e apresentaram comportamento comparável às células de controlo durante todo o período do lapso de tempo. Usando o mesmo método de investigação precisamente, os resultados deste estudo podem ser comparados com os de um estudo recentemente publicado. O ELS adicional composta baixo encolhimento demonstraram biocompatibilidade superior em comparação com os dois compostos testados previamente utilizados para a mesma aplicação clínica, que é a restauração direta 11. Mais estudos ainda são necessários para estabelecer a comparação mais completa. Ao decidir qual ensaio de citotoxicidade para aprovar uma avaliação terminal específico, é importante entender as vantagens e as limitações de cada ensaio. A principal finalidade da imagem confocal é alcançar uma arquitectura 3-D de células e órgãos. A técnica é capaz de revelar não só a superfície de um espécime, mas também a sua subsuperficial. O protocolo aqui descrito sublinha a utilização de MCVL 3D lapso de tempo de imagiologia confocal, como um sensitiva método para avaliar o comportamento de biocompatibilidade in vitro de um compósito dentário. No entanto, a fim de evitar as limitações encontradas neste trabalho, estações de trabalho de anti-vibração podia ser utilizado, a fim de permitir mais estável e mais longo lapso de tempo de imagem; o tampo da mesa pode isolar o sistema confocal usado contra os efeitos prejudiciais que as vibrações no laboratório pode causar. Além disso, os materiais a serem utilizados na cavidade oral, devem, idealmente, ser inofensivo para os tecidos gengivais e não deve conter substâncias que poderiam causar toxicidade sistémica. Em conformidade com a metodologia utilizada e os resultados obtidos a partir do estudo de corrente pode concluir-se que o composto testado (ELS extra de baixo encolhimento) não é citotóxico nas presentes condições experimentais. Como o método CLSM pode dar sensivelmente a taxa inicial de células viáveis, outras possibilidades poderia ser prevista para avaliar mais pontos finais. Em particular, como tem sido relatado recentemente que os monómeros compostos afectam células thrOugh espécies reativas de oxigênio (ROS) 46- 48, é necessária uma investigação mais aprofundada para avaliar se algum correlações entre a citotoxicidade sinalização redes e produção de ROS. O protocolo de futuro poderia ser projetado para avaliar simultaneamente a produção de ROS (H 2 O 2 e / ou O 2 - coloração) e taxa de citotoxicidade (coloração Live / morto) usando lapso de tempo MCVL imagem.

Uma das principais normas citadas nas recomendações ISO para definir biocompatibilidade é a ausência de material de toxicidade para as células. À base de resina compósitos odontológicos podem liberar componentes da matriz resinosa, que poderia ser inicialmente devido a polimerização parcial, e / ou mais tarde devido a processos de degradação ao longo do tempo 1-4. Esses componentes liberados entrar em contacto com os tecidos orais e pode ter vários inconvenientes, como urticária e reações da mucosa 5, o desenvolvimento de alergias e reacções de hipersensibilidade em pacientes 6, modificações de fibroblastos gengivais morfologia e redução de colágeno tipo I de proteína 7, imunossupressão ou imunoestimulação em mitógeno -driven proliferação de linfócitos T purificados e células do baço 8 e danos no DNA de fibroblastos gengivais humanos primários, o que sublinha o seu potencial genotóxico 9. Muitos parâmetros podem afetar a toxicidade composta dental, como a sombra da composite, a cura pela luz, a composição química do monómero de resina, o material de enchimento e do grau de conversão de 10- 13. Desde in vitro potencial tóxico de materiais pode prever em situações in vivo e poderia ser comparado a situações clínicas pelo estudo de alguns parâmetros pertinentes. A citotoxicidade dos compósitos e os seus componentes foram amplamente avaliados utilizando sistemas de cultura de células 14- 16. Estes sistemas in vitro têm sido desenvolvidos para avaliar a biocompatibilidade de compósitos dentários em termos de: o crescimento celular e a apoptose de células THP-1monocytes utilizando como células 17, citotoxicidade em fibroblastos gengivais humanos 18, potencial inflamatório em queratinócitos HaCaT 2, como as células da funcionalidade das células odontoblast- como MDPC-23 células 19, redução dos níveis de RNA total, e aumento significativo na indução de apoptose em gengival humano queratinócitos 20 eDanos no DNA em fibroblastos gengivais e polpa células 21. Diferentes metodologias são sugeridas para investigar a biocompatibilidade dos compósitos odontológicos. Ensaios colorimétricos, que envolvem corantes específicos e medidas de adsorção de luz, continuam a ser o mais utilizado, devido à sua relativa simplicidade e baixo custo de 22 a 26. Análise de microscopia por contraste de luz com frequência consome mais tempo e incorre em custos mais elevados. No entanto, estas técnicas de microscopia tem algumas vantagens importantes. A observação da estrutura celular dá informações estendidas sobre efeitos tóxicos experientes, fornecendo assim dados mais relevantes e sensíveis. Em particular, a introdução de microscopia confocal 27 permitiu a observação de estruturas biológicas com a melhoria da resolução axial em relação a todo o campo microscópios de fluorescência imagiologia tradicionais. Assim, imagem confocal tornou-se um poderoso instrumento de investigação em diferentes áreas depesquisas médicas e científicas. Em contraste com as técnicas de microscopia electrónica, microscopia confocal de varrimento oferece a capacidade de visualizar os componentes distintos de células por incorporação de marcadores fluorescentes específicos. A maioria destes marcadores específicos são estáveis ​​em um ambiente aquoso, de forma sensata mensurável, barato e não tóxico 28, permitindo a sua utilização em clínica, bem como estudos de investigação de laboratório. Além disso, a secagem e a fixação da amostra necessária para a análise de microscopia electrónica convencional, não é necessário para lapso de tempo de imagiologia confocal, aquisição, assim, dependente do tempo, também é possível em amostras. Em comparação com a imagem bidimensional, o princípio de imagem confocal permite uma visualização exemplar do subsolo e reconstrução da estrutura tridimensional das diferentes imagens de profundidade obtidos; detalhes que resultam em, mais precisos e mais estruturais 29, 30. O estudo de vídeo atual é um exemplo do uso de tridimensional Time-Lapse Confocal Laser Scanning Microscopy (3D-MCVL) combinado com uma rotulagem Vivo / Dead fluorescente e quantificação de sinais como um método inovador. A técnica apresentada neste trabalho tem a vantagem de permitir a avaliação e time-lapse de imagens sensíveis de células vivas, sem alterar a estrutura celular avaliado. Não há etapas de preparação são necessários antes da análise confocal. Anteriormente, a mesma coloração foi utilizada para avaliar a viabilidade da cultura núcleos de osso esponjoso 31, mas sem confocal time-lapse seguinte. Da mesma forma o mesmo procedimento de lapso de tempo confocal foi utilizado para avaliar a eritromicina atividade tempo de morte em bactérias de lodo ativado de acordo com o seu tipo Gram 32 usando uma bactéria específicos Viva / coloração mortos. Estes métodos foram recentemente adaptado e utilizado para comparar a toxicidade de compósitos dentários baseados em monómeros de metacrilato de 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Olympus Fluoview FV10i&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O2/Co2 Incubator</td>
			<td style="width:71px;">Pnasonic</td>
			<td style="width:119px;">MCO 5M</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Live/Dead&#174; Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MP 03224</td>
			<td>Stain&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ELS extra low shrinkage&#174;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Saremco&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Dental composite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D 6046</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1426</td>
			<td>harvesting cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chamber slide system&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">14220040X</td>
			<td>Culture chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">P11-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">P11-001</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">A11-101</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">00110230TP1</td>
			<td>Cell counting&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal time lapse imaging as an efficient method for the cytocompatibility evaluation of dental composites

Aceita-se geralmente que a interacção no material celular in vitro é um critério útil na avaliação da biocompatibilidade de material dentário. O objetivo deste estudo foi utilizar MCVL 3D lapso de tempo confocal de imagem para avaliar a biocompatibilidade in vitro de compósitos odontológicos. Este método fornece uma indicação precisa e sensível da taxa de células viáveis ​​em contacto com extractos de compósitos dentários. O ELS extra baixa retração, um compósito odontológico usado para restauração direta, tem sido tomado como exemplo. Avaliação in vitro foi realizado em células humanas em cultura primária de fibroblastos gengivais usando coloração Live / Morto. As imagens foram obtidas com o sistema biológico FV10i confocal invertido e analisados ​​com o software 3.1 FV10-ASW. A análise da imagem mostrou uma citotoxicidade muito ligeira na presença do composto testado depois de 5 horas de tempo decorrido. Uma ligeira diminuição da viabilidade celular foi mostrado em contacto com o composto testado extractos compared com células de controlo. As descobertas destacou o uso de MCVL 3D lapso de tempo de imagem como um método sensível para avaliar qualitativa e quantitativamente o comportamento biocompatibilidade dos compósitos odontológicos.

Figura 1 mostrou uma visão geral das células coradas vivo / morto em imagens de mapeamento obtidos (objetiva de 10x), tanto para o controle e as células expostas aos extratos compostos testados (ELS extra baixa encolhimento). A estrutura das células tridimensional pode ser visualizado na ampliação 600X. A visualização das células recolhidas na câmara de controlo e de células recolhidas na câmara na presença dos extractos compostos testados é apresentado na Figura 2. A projecção máxima (60x objectivo) mostra o destino de populações de células seleccionadas no início do lapso de tempo (15 min) e no fim do período de tempo decorrido (em 5 h). Cinqüenta e sete pilhas de imagens (xyzt varredura mod, 39 imagens por pilhas, voxel de profundidade 1,00 mm) foram obtidos durante este período. Uma ligeira diminuição do sinal de fluorescência verde e muito ligeira variação na fluorescência vermelha foram obtidas nas células expostas. Não foi observada variação significativa para o controlecélulas. Células extratos expostos Composite assumiu morfologia do fuso semelhante para controlar as células; morfologia não foi alterada nestas condições experimentais (não obstante o decréscimo do sinal verde e o aumento de sinal vermelho, na presença do composto testado). A análise de imagem foi realizada em cinco pilhas de imagens diferentes seleccionados correspondentes às diferentes populações de células a partir das imagens obtidas para o composto testado, em comparação com células de controlo negativo, tanto para o sinal vermelho e verde. O perfil de intensidade de células coradas é ilustrada na Figura 3; a evolução do sinal verde e vermelho das células em contacto com o composto testado foi comparável à das células de controlo. Calceína e EthD-1 intensidades de emissão de fluorescência foram medidos em células de controlo e nas células expostas compostas. A medição foi feita em intervalos de uma hora durante até cinco horas. A relação de verde / vermelho de fluorescência (baseado em intensidades integradas do verde 495-515 nm e 620-650 nm sinais vermelhos) Foi calculada durante o período de time-lapse. Os rácios de viabilidade para controlo e células expostas a ELS extractos extra de baixo encolhimento são apresentados na T abela 1. Na presença do composto testado, a percentagem de células vivas foi encontrada para diminuir ligeiramente a partir de 100% para 93,9% depois de 1 hora contato. Foi observada diferença significativa entre o composto testado e controle negativo (células sem quaisquer extratos compósitos) após 5 horas do período de lapso de tempo indicado. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig1highres.jpg" /> Figura 1: Visão geral de mapeamento de imagem mostraram células na objectiva 10X, (A) células de controlo e células (B) corado na presença de extractos compósitos (ELS extra de baixo encolhimento) no início do período do lapso de tempo (t = 15 min). As áreas verdes são células vivas e áreas vermelhas são as células danificadas. Nestecondições do experimento, não houve variação (tanto para a fluorescência verde e vermelho) foi observada para compósitos expostos células em comparação com células de controlo negativo. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig2highres.jpg" /> Figura 2: as imagens CLSM na objectiva 60X de uma população de células a partir de (A) e da câmara de controlo (B) extractos de compósitos câmara no início e no fim do período de exposição de lapso de tempo (I: 15 min e II: 5 h, respectivamente ). As áreas verdes são células vivas e áreas vermelhas são as células danificadas. O painel das imagens demonstrou ligeira mudança no sinal de intensidade (ligeira diminuição no sinal verde e muito ligeiro aumento no vermelho). Não há alterações na morfologia celular foram observados na presença dos extratos de compósitos; expor as células mantiveram a sua morfologia em forma de fuso e de fibroblastos como células de controlo. Figura 3: Perfil de linha de células observadas em microscopia de lapso de tempo de células (A) Controlo (B) extractos de células compostas expostas, (I) em 15 min e (II) em 5 h.. Nenhuma variação visível na evolução do sinal verde na presença de composto testado independentemente do tempo de contato. No entanto, foi observado ligeiro aumento do sinal vermelho na presença de compósito após 5 hr de contacto. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Tempo de contato (horas) </td><td colspan="5"> Viabilidade celular (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> As células de controlo </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 &lt;/ Td&gt; <td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> ELS extra de baixo encolhimento ® </td><td> 93,9 ± 7 </td><td> 91,3 ± 5 * </td><td> 89,5 ± 3 * </td><td> 87,6 ± 2 * </td><td> 87,7 ± 3 * </td></tr></tbody></table> Tabela 1:. Taxa de HGF vivo evolução células após 1, 2, 3, 4 e 5 hr de contacto com extractos compósitos A viabilidade celular foi ensaiada através de coloração utilizando o kit de citotoxicidade Live / Morto. Os dados mostram valores médios ± DP de cinco imagens empilha análise. Os valores são significativamente diferentes das células de controlo a p &lt;0,05.

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Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

O aspecto mais estudado da biocompatibilidade dos compósitos é sua citotoxicidade MCVL 3D de imagens de lapso de tempo combinado com quantificação sinal fluorescente permite uma avaliação sensível do destino das células ao longo do tempo. Utilizando este método pode ser uma ferramenta eficiente para avaliar a citocompatibilidade de compósitos odontológicos.

Confocal Time Lapse de imagem como um método eficiente para a Avaliação citocompatibilidade of Dental Composites

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

confocal-time-lapse-imaging-as-an-efficient-method-for

Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K visualizações.  UMR CNRS 5615, Université Lyon1.  O aspecto mais estudado da biocompatibilidade dos compósitos é sua citotoxicidade MCVL 3D de imagens de lapso de tempo combinado com quantificação sinal fluorescente permite uma avaliação sensível do destino das células ao longo do tempo. Utilizando este método pode ser uma ferramenta eficiente para avaliar a citocompatibilidade de compósitos odontológicos. 

Vídeo: Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Avaliação de Captação de nanopartículas em tumores em tempo real usando imagens intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Medicina

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

o<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick Corioalantóide membrana (CAM) como um Ensaio Xenoenxerto modelo eficiente de carcinoma hepatocelular

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

Um método melhorado para rápida de intubação da traqueia em Ratos

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle screws after spinal surgery, which is a serious concern. To address this problem, diverse types of pedicle screws have been examined to identify those with good fixation strength and osseointegration in spine bone. The porcine spine is a good alternative for the human spine in the evaluation of pedicle screws due to the anatomical size, mechanical characteristics, and cost. Although several studies have reported that pedicle screws are efficient in the porcine model, no study has described detailed protocols for the evaluation of a pedicle screw using the porcine model. Here, we describe a detailed method for evaluating transpedicular screws using an in vivo porcine lumbar spine model. The technical details for anesthesia, spine surgery, and harvest provided here will facilitate with the evaluation of the transpedicular screw fixation model.

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Here, we introduce a method to evaluate transpedicular screws by using an in vivo porcine lumbar spine model.

Método de anestesia, cirurgia e colheita para avaliação de parafusos transpediculares usando um In Vivo Modelo de espinha lombar porcina

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy include photochemical cross-linking and tissue cross-linking (TXL) methods. Such methods for inducing mechanical tissue property changes are being employed to the cornea in corneal thinning (mechanically weakened) disorders such as keratoconus as well as the sclera in progressive myopia, where thinning and weakening of the posterior sclera occurs and likely contributes to axial elongation. The primary target proteins for such tissue strengthening are fibrillar collagens which constitute the great majority of dry weight proteins in the cornea and sclera. Fortuitously, fibrillar collagens are the main source of second harmonic generation signals in the tissue extracellular space. Therefore, modifications of the collagen proteins, such as those induced through cross-linking therapies, could potentially be detected and quantitated through the use of second harmonic generation microscopy (SHGM). Monitoring SHGM signals through the use of a laser scanning microscopy system coupled with an infrared excitation light source is an exciting modern imaging method that is enjoying widespread usage in the biomedical sciences. Thus, the present study was undertaken in order to evaluate the use of SHGM microscopy as a means to measure induced cross-linking effects in ex vivo rabbit sclera, following an injection of a chemical cross-linking agent into the sub-Tenon&#39;s space (sT), an injection approach that is standard practice for causing ocular anesthesia during ophthalmologic clinical procedures. The chemical cross-linking agent, sodium hydroxymethylglycinate (SMG), is from a class of cosmetic preservatives known as formaldehyde releasing agents (FARs). Scleral changes following reaction with SMG resulted in increases in SHG signals and correlated with shifts in thermal denaturation temperature, a standard method for evaluating induced tissue cross-linking effects.

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

This protocol describes techniques for evaluating chemical cross-linking of the rabbit sclera using&#160;second harmonic generation imaging and differential scanning calorimetry.

Segunda geração harmônica sinais na esclera coelho como uma ferramenta para avaliação do tecido terapêutico do cross-linking (TXL) para miopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful compared to other more aggressive methods such as retro-orbital plexus sample collection. However, this blood collection method is sometimes limited by an unsatisfactory success rate. Here, we introduce a method for blood collection through the subclavian vein puncture. The subclavian vein is located just under the clavicle and this vein is large enough to fulfill the volume requirements of blood collection. Our results show that this method is safe and applicable for blood collection sampling with the required blood volume. Blood collection through the subclavian vein puncture could serve as an alternative blood collection method in case of failed tail vein blood sampling in rats.

Here, we present a protocol to collect blood samples from the rat subclavian vein.

Punção da veia subclávia como um método alternativo de coleta de amostra de sangue em ratos

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

Imagens de células vivas in vitro para explorar a migração celular em direção ao órgão de Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Guided Endodontics: Three-Dimensional Planning and Template-Aided Preparation of Endodontic Access Cavities

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, pulpitis or apical periodontitis may develop in the long term. Root canal treatment of teeth with severe PCO and pulpal or periapical pathosis is challenging for general practitioners and even for well-equipped endodontic specialists. To ensure detection of the calcified root canal and avoid excessive loss of tooth structure or root perforation, static navigation using templates ("Guided Endodontics") was introduced a few years ago. The general workflow includes three-dimensional imaging using cone-beam computed tomography (CBCT), a digital surface scan, and superimposition of both in a planning software. This is followed by virtual planning of the access cavity and the design of a template that will guide the drill to the desired target point. To do this, a true-to-scale virtual image of the drill must be placed in a way that the tip of the drill reaches the orifice of the calcified root canal. Once the template has been fabricated using computer-aided design and computer-aided manufacturing (CAD/CAM) or a 3D printer, guided preparation of the access cavity can be performed clinically. For research purposes, a postoperative CBCT image can be used to quantify the accuracy of the access cavity performed. This work aims to present the technique of static guided endodontics from imaging to clinical implementation.

Guided endodontics describes a template-aided approach for access cavity preparation. The procedure requires cone-beam computed tomography and a surface scan to produce a template. An incorporated sleeve guides the drill to the target point. This allows the preparation of minimally invasive endodontic access cavities in calcified teeth.

Endodontia Guiada: Planejamento Tridimensional e Preparação Auxiliada por Modelos de Cavidades de Acesso Endodôntico

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, ...