Agradecemos o apoio do NIH concede R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, a Fundação Oak eo Laboratório Hagey Pediátrica Medicina Regenerativa.

NOTA: Declaração de Ética: Toda pesquisa envolvendo animais vertebrados foi realizada em termos dos protocolos aprovados pelo Painel Administrativo Stanford em Laboratory Animal Care (APLAC). 1. Preparação <ol><li> Permitir 10 ml de disponíveis comercialmente meios de separação de gradiente de densidade celular (que contém polissacarose e diatrizoato de sódio, ajustada a uma densidade de 1,077 g / ml) de vir até à temperatura ambiente num tubo de 50 ml. </li><li> Prepare a citometria de fluxo (FACS) com tampão fosfato solução salina tamponada 1x (PBS) e 2% de soro fetal de vitelo (FCS). Tomar uma aliquota de 50 ml e manter esta aliquota à temperatura ambiente para uso durante o passo de gradiente de densidade media de separação de células. </li><li> Possui um balde de gelo pronto para manter o tecido isolado e em células durante o procedimento de isolamento. </li></ol> 2. Prepare Meios de Cultura <ol><li> Prepare meios basais: MEM (Meio Essencial Mínimo), sem vermelho de fenol (500 ml), glutamato (1x), FCS (10x), 10.000 unidades / ml penicillin (1x). </li><li> Filtre meio basal com um filtro de 0,22 um. </li><li> Prepare osso mídia indução de macrófagos de medula: <ol><li> Introduzir 50 ml de mídia basais preparada no passo 2.1. </li><li> Adicionar prostaglandina E2 (PGE2, Sr. 352,465 g / mol) a 10 -7 M de concentração final. </li><li> Adicionar Macrophage Colony-Stimulating Factor (M-CSF) a 10 ng / ml. </li><li> Não filtrar a solução final de macrófagos da medula óssea estimulando mídia. </li></ol></li><li> Prepare a mídia de indução de osteoclastos: <ol><li> Introduzir 50 ml de mídia basais preparada no passo 2.1. </li><li> Adicionar prostaglandina E2 (PGE2, Sr. 352,465 g / mol) a 10 -7 M concentração final </li><li> Adicionar Macrophage Colony-Stimulating Factor (M-CSF) a 10 ng / ml. </li><li> Adicionar RANKL a 10 ng / ml. </li><li> Não filtrar a solução final dos meios de comunicação de indução dos osteoclastos. </li></ol></li></ol> 3. Isolamento de Medula Óssea <ol><li> Euthanize um C57BL / 6 do mouseutilizando o método de inalação de dióxido de carbono, seguido por deslocação cervical. NOTA: Os roedores devem ser sacrificados por pessoal treinado usando técnica adequada, equipamentos e agentes. </li><li> Posicione e fixe o mouse em uma placa de dissecação e pulverize com álcool 70%. </li><li> Dissecar os fémures, tíbias, úmeros e coluna vertebral. <ol><li> Comece com o mouse na posição supina. Realizar uma incisão na vertical ao longo do membro inferior e começar por dissecação ao longo do comprimento do fémur e da tíbia dividindo anexos tecidos moles. Finalmente, deslocar ossos da articulação do joelho e do quadril para liberar ossos totalmente a partir do esqueleto. </li><li> Avance para fazer uma incisão ao longo do comprimento do membro superior para isolar o úmero. Deslocar o úmero no ombro e cotovelo dissecando fixação capsular tecidos moles. </li><li> Finalmente, vire o mouse sobre, para que o mouse se encontra propenso. Adicione uma incisão na pele ao longo do comprimento da coluna vertebral, na linha média. Observe a paravertebral suavetecido de cada lado da coluna vertebral e inciso ao longo da borda óssea da coluna vertebral, dissecando através da massa do tecido mole paravertebral. Utilizando uma tesoura, fazer um corte horizontal ao longo da coluna vertebral, na base do pescoço, e no final da coluna vertebral, apenas proximal para a inserção da cauda, ​​libertando a coluna vertebral de fixação do tecido mole. </li></ol></li><li> Uma vez que os ossos são colhidas, mantê-los em tampão de FACS em gelo. </li><li> Use lenço de papel para limpar o músculo e tecido macio a partir dos ossos. </li><li> Colocar os ossos limpos em um pilão e almofariz com 3 ml de tampão de FACS. </li><li> Esmagar os ossos delicadamente no pilão. </li><li> Aspirar o fluido manchada de sangue e transferência para um tubo cónico de 50 ml fazendo passar a solução através de um filtro de células de 70 mm. </li><li> Adicionar 5 ml de tampão de FACS para o osso esmagado e esmagar ainda mais. Mais uma vez, remover o fluido, utilizando uma pipeta e transferir para o tubo de 50 ml através de uma peneira de 70? M. </li><li> Normalmente esmagar o twi ossosce a três vezes em tampão de SCAF fresco, utilizando um almofariz e pilão, cada vez que a adição de mais 5 ml de tampão FACS fresco, até que o fluido não mancha vermelha. </li><li> Centrifuga-se a solução de medula óssea a 200 xg durante 5 min a 4 ° C, para produzir um sedimento celular. </li></ol> 4. Separação Gradiente de Células da Medula Óssea <ol><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 10 ml de tampão FACS (mantido à temperatura ambiente). </li><li> Tirar o tubo de 50 ml contendo 10 ml de meios de comunicação disponíveis comercialmente separação de gradiente de densidade celular (RT). </li><li> A camada de solução de medula óssea para a mídia de separação celular gradiente de densidade. Faça isto lentamente usando uma pipeta elétrica. Ângulo a ponta da pipeta contra a superfície interior, perto da parte superior do tubo cónico e inclinar o tubo cónico de cerca de 30 °. Usando uma configuração de baixa velocidade na pipeta, expulsar suavemente a solução de medula óssea, de modo a não perturbar os meios de separação de células por gradiente de densidade. NOTA: Em última análise, haveráser uma definição clara entre as duas soluções (solução celular e solução de mídia de separação de células em gradiente de densidade). </li><li> Utilizando uma centrífuga RT, centrifugar os meios de separação de gradiente de densidade das células e solução de células em uma centrífuga equilibrada a 200 xg durante 15 min. Além disso, remover a aceleração e desaceleração na centrífuga para garantir a separação de fases adequada utilizando o gradiente de densidade de gradiente de meios de separação de células. </li><li> Após centrifugação, aspirar para fora da camada intermédia nebulosa que contém as células da medula óssea de interesse. </li><li> Transferir essas células para um novo tubo cónico. Adicionar 20 ml de tampão FACS adicional (mantidos em gelo) para lavar as células. </li><li> Centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C, para produzir um sedimento celular. </li><li> Ressuspender o sedimento final de células em 1 ml de macrófago estimulador meios de comunicação para permitir a contagem de células utilizando um hemocitómetro. </li></ol> Contando 5. celular <ol><li> Tomar 10 ul da solução de células e misturarcom 10 ul de azul de tripano. Carga de 10 ul da mistura resultante para um hemocitómetro e obter a contagem de células por ml de solução. </li></ol> A cultura 6. celular <ol><li> Coloque 2 ml de meio de estimulação de macrófagos em cada poço de uma placa de 24 poços. </li><li> Adicionar 200.000 células de cada poço. NOTA: Em nossa experiência, densidade de células-revestimento é um dos requisitos mais importantes para o adequado cultivo in vitro dos osteoclastos. </li><li> Agitar suavemente a placa e colocar numa incubadora normal a 37 ° C. </li><li> Não altere os meios de comunicação durante 3 dias. </li><li> Após 3 dias em media macrófagos estimulante, mudar a mídia para mídia osteoclastos. </li><li> A partir de agora, alterar a mídia diariamente por 5-7 dias, altura em que, grande, osteoclastos multinucleados devem ser visíveis na placa de cultura. </li></ol> 7. A coloração com fosfatase ácida tartarato resistente (TRAP) <ol><li> Depois de 5-7 dias de in vitro cultura, aspirar a mídia da cultura também. </li><li> Lavar os poços cuidadosamente com 1x PBS três vezes. </li><li> Fixar as células por adição de solução de paraformaldeído a 4% e deixar durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Durante este tempo, preparar a mancha TRAP (que está comercialmente disponível) por pré-aquecimento a 37 ° C. </li><li> Depois de 1 hora em paraformaldeído, aspirar fora paraformaldeído e lavar cuidadosamente 3 vezes com PBS 1x. </li><li> Adicionar 1 ml de pré-aquecido mancha TRAP em cada poço da placa de serem coradas. </li><li> Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C durante 1 h, protegida da luz. </li><li> Depois de 1 hora, aspirar fora da mancha TRAP. </li><li> Lavar os poços três vezes com água desionizada pré-aquecida. </li><li> Contracorante o bem com hematoxilina de Gill (CUIDADO) para 1-2 min. </li><li> Osteoclastos imagem usando microscopia de campo claro. </li><li> Lavar os poços com água desionizada até uma intensidade de cor adequada da mancha é conseguida, normalmente aparecem quando núcleos blue. </li></ol> 8. Osteoclasto reabsorção Ensaio <ol><li> Usar um de 24 poços de poliestireno prato de cultura disponíveis comercialmente que é pré-revestido com qualquer substrato de osso ou um revestimento de fosfato de cálcio cristalino inorgânico. </li><li> Coloque 2 ml de meio de estimulação de macrófagos em cada poço. </li><li> Adicionar 200.000 células da medula óssea recentemente isolados obtidos no final da etapa 2 para cada poço. </li><li> Agitar suavemente a placa antes de colocá-lo em uma incubadora a 37 ° C durante 3 dias. </li><li> No dia 3, mudar a mídia para mídia diferenciação dos osteoclastos. </li><li> Realizar mudanças de mídia diários com mídia diferenciação dos osteoclastos por 5-7 dias. </li></ol> 9. Quantificação de reabsorção de osteoclastos de Actividade <ol><li> Após 5-7 dias de cultura in vitro em meios de diferenciação dos osteoclastos sobre um substrato mineralizada, analisar a superfície mineralizada, como descrito abaixo, para avaliar a capacidade dos osteoclastos para formar resorptiem poços, um indicador da atividade osteoclástica. </li><li> Aspirar a partir de meios de comunicação a placa de ensaio a reabsorção e adicionar 100 ul de solução de lixívia a 10% a cada poço. </li><li> Incubar as células com a solução de lixívia a 10% durante 15 min à TA. </li><li> Lavar os poços três vezes com água destilada. </li><li> Aspirar fora de todo o restante da água e sacuda o excesso de água da placa e deixar secar ao ar para 5/3 horas. </li><li> Contracoloração a placa com um kit de coloração de Von Kossa disponível comercialmente para permitir a fácil visualização do substrato reabsorvido-un. </li><li> Use microscopia de campo claro de tomar imagens de peças representativas da superfície reabsorvida. </li><li> Usando software de análise de imagem, calcule a percentagem da superfície reabsorvida para permitir a quantificação da atividade de reabsorção osteoclástica. </li></ol>

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Nenhum dos autores tem divulgação ou conflito de interesses a declarar.

Uma habilidade para isolar facilmente e cultivar um grande número de osteoclastos in vitro tem sido responsável por ajudar a avançar na compreensão da biologia óssea e doenças mediadas por osteoclastos. Foi a identificação de RANKL que levam a este, quando foi recentemente identificado como o principal regulador da formação de osteoclastos, diferenciação e sobrevivência de 16-18. Tem sido nossa experiência que o cultivo in vitro de osteoclastos de m...

A remodelação óssea é dinâmico e envolve o acoplamento de formação óssea com reabsorção óssea 1. Este processo fortemente regulado é responsável por manter o esqueleto durante a homeostase normal, e em resposta a lesões e doenças. Os osteoclastos são células únicas, multinucleadas, que são capazes de reabsorção ambas as matrizes orgânicos e inorgânicos dos ossos. Os osteoclastos são derivadas da linhagem monócito / macrófago de medula óssea 2-5. As anormalidades na função ou a formação de osteoclastos pode resultar numa variedade de patologias, incluindo condições clínicas comuns, como a osteoporose. A capacidade de gerar osteoclastos in vitro tem permitido avanços significativos em nossa compreensão da biologia óssea 6. Como resultado, os novos agentes terapêuticos estão a emergir para tratar doenças relacionadas com osteoclastos que são responsáveis ​​pela morbilidades e mortalidades significativas 7 </sacima&gt;. Manutenção homeostática da massa óssea e força exige a acção concertada dos osteoblastos da formação óssea e osteoclastos de reabsorção óssea 8,9. Homeostase óssea é modificado de uma série de doenças, incluindo a osteoporose pós-menopausa, em que o aumento da actividade de osteoclastos levando à perda de massa óssea patogénico e densidade de 10. Com o aumento da disponibilidade de modelos murinos transgénicos de doença humana, há mais oportunidade para decifrar o papel dos osteoclastos na doença óssea humana 11-13. Inúmeros protocolos para técnicas de cultura de osteoclastos aparecem na literatura, com muitas variações descritas 9,12,14. Xing e colegas descrevem uma metodologia semelhante para o protocolo descrito abaixo, na descrição de ensaios osteoclastogênicos a partir de células de medula óssea de murino. No entanto, para libertar as células de medula óssea seguintes colheita de osso longo, Xing et al. Lave a cavidade da medula com α-MEM meio completo14. Catalfamo examina o efeito da hiperglicemia em função dos osteoclastos e descreve um método em que todas as células mobilizadas pela lavagem da medula óssea são cultivadas durante 24 horas, altura em que as células não-aderentes são descartados 12, uma técnica também usada por Boyle et ai . 9 Estes protocolos previamente publicados exigem a prática de lavagem da medula óssea, uma prática tedioso, que também introduz o risco de um ferimento por picada de agulha e perda de medula óssea valiosa, pois é necessário cortar ambas as extremidades do osso. O protocolo, que descrevemos, implementa a utilização de um almofariz e pilão para isolar os osteoclastos, que é semelhante ao processo de isolamento descrito por macrófagos Weischenfeldt et al 15. A nossa experiência, contudo, é que o isolamento dos osteoclastos e da cultura in vitro usando técnicas de resultados anteriormente publicados nos resultados variáveis ​​em termos de produção de osteoclastos, muitas vezes resultandona impossibilidade de cultivar osteoclastos. Por conseguinte, temos desenvolvido um protocolo que permite o isolamento consistente de medula óssea de ratinho para produzir um grande número de osteoclastos in vitro, multinucleadas, com um rendimento aproximado de 70-80% das células plaqueadas inicialmente formando macrófagos e, subsequentemente, osteoclastos, na presença de meio de indução de osteoclastos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1017">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:503px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:165px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-CSF, recombinant mouse</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMC2044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>462-TEC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostaglandin E2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3987</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html> Os osteoclastos são células altamente especializadas que são derivados a partir da linhagem monócito / macrófago de medula óssea. A sua capacidade única para reabsorver tanto as matrizes orgânicas e inorgânicas de osso significa que eles desempenham um papel fundamental na regulação da remodelação esquelética. Juntos, osteoblastos e osteoclastos são responsáveis ​​pelo processo de acoplamento dinâmico que envolve tanto a reabsorção óssea e formação óssea agindo em conjunto para manter o esqueleto normal durante a saúde e na doença. À medida que a célula de reabsorção óssea principais no corpo, alterações na diferenciação de osteoclastos ou a função pode resultar em efeitos profundos no corpo. Doenças associadas com a função dos osteoclastos alterada pode variar em gravidade de doença neonatal letal devido a falha para formar um espaço de medula para a hematopoiese, a patologias como a osteoporose, na qual excessiva reabsorção óssea osteoclástica predispõe à fratura formação mais comumente observada. ent &quot;&gt; A capacidade de isolar os osteoclastos em números elevados in vitro tem permitido avanços significativos na compreensão do ciclo de remodelação óssea e abriu o caminho para a descoberta de novas estratégias terapêuticas que combatam essas doenças. Aqui, nós descrevemos um protocolo para isolar e cultivar osteoclastos da medula óssea do rato que irá produzir um grande número de osteoclastos.

<html> O objectivo deste método foi isolar facilmente um grande número de osteoclastos in vitro, tipicamente em uma semana. Isolamento bem sucedido de um grande número de osteoclastos foi confirmada utilizando a coloração da fosfatase ácida resistente ao tartarato (Figura 1A). Grandes osteoclastos são visualizados como grandes células roxas com múltiplos núcleos (tipicamente ≥ 3 núcleos). Usando este protocolo, é comum para isolar osteoclastos com até 30 núcleos por osteoclastos ...

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Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Os osteoclastos são as células de reabsorção óssea principais no corpo. Uma capacidade de isolar os osteoclastos em grandes números resultou em avanços significativos na compreensão da biologia dos osteoclastos. Neste protocolo, nós descrevemos um método para o isolamento, cultivo e quantificar a actividade dos osteoclastos in vitro.

Osteoclastos Derivação do mouse Medula Óssea

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

osteoclast-derivation-from-mouse-bone-marrow

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24.0K visualizações.  Stanford University School of Medicine.  Os osteoclastos são as células de reabsorção óssea principais no corpo. Uma capacidade de isolar os osteoclastos em grandes números resultou em avanços significativos na compreensão da biologia dos osteoclastos. Neste protocolo, nós descrevemos um método para o isolamento, cultivo e quantificar a actividade dos osteoclastos in vitro. 

Vídeo: Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Biologia

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

Homing das células hematopoiéticas da medula óssea

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Derivação de células-tronco do rato trofoblasto de blastocistos

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Isolamento, purificação e diferenciação de precursores de osteoclast da medula óssea de ratos

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the proplatelet formation using in vitro-differentiated megakaryocytes; however, there is an increasing evidence that conventional culture systems do not faithfully recapitulate the differentiation/maturation process that takes places inside the bone marrow. In this manuscript, we present an explant method initially described in 1956 by Thi&#233;ry and Bessis to visualize megakaryocytes which have matured in their native environment, thus circumventing potential artifacts and misinterpretations. Fresh bone marrows are collected by flushing the femurs of mice, sliced into 0.5 mm cross sections, and placed in an incubation chamber at 37 &#176;C containing a physiological buffer. Megakaryocytes become gradually visible at the explant periphery and are observed up to 6 hours under an inverted microscope coupled to a video camera. Over time, megakaryocytes change their shape, with some cells having a spherical form and others developing thick extensions or extending many thin proplatelets with extensive branching. Both qualitative and quantitative investigations are carried out. This method has the advantage of being simple, reproducible, and fast as numerous megakaryocytes are present, and classically half of them form proplatelets in 6 hours compared to 4 days for cultured mouse megakaryocytes. In addition to the study of mutant mice, an interesting application of this method is the straightforward evaluation of the pharmacological agents on the proplatelet extension process, without interfering with the differentiation process that may occur in cultures.

Here, we detail the bone marrow explant method, from sample preparation to microscopic slide analysis, to evaluate the ability of megakaryocytes which have differentiated in their physiological environment to form proplatelets.

Dinâmica de formação de propulato de plantas de medula óssea fresca

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

In Vivo Imagem de dois fótons de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...