O objetivo geral deste procedimento é acompanhar em tempo real a formação de proplatelet a partir de megacariócitos de camundongos, que amadureceram em seu ambiente nativo. Este método tem a vantagem de ser simples, reproduzível e rápido. Pode-se analisar muitos megacaiócitos e visualizar a formação de proplatelets em apenas seis horas, em vez de esperar pelo primeiro dia de cultura quanto aos megacaiócitos de rato in vitro.
Uma aplicação interessante deste método é a possibilidade de estudar o efeito do tratamento farmacêutico ou da mutação genética, especificamente na etapa de extensão proplatelet. Aqui não há interferência no processo de diferenciação, como no caso da cultura in vitro. Este vídeo ajuda a garantir esses passos-chave de descarga e corte da medula óssea.
Também é explicado como classificar a morfologia e os megacaiócitos, o que é realmente útil para a caracterização de defeitos na doença trombofílica. Para começar, aqueça o tampão de Tyrode a 37 graus Celsius, e ligue a câmara de aquecimento do microscópio para levar a temperatura a 37 graus Celsius. Prepare todas as ferramentas necessárias, como um temporizador, câmaras de incubação, cinco seringas de calibre 21 mililitro, fórceps, uma lâmina de barbear, pipetas Pasteur, lâminas de vidro e tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Lave a medula óssea com dois mililitros do tampão de Tyrode introduzindo uma agulha de calibre 21 na abertura do fêmur no lado do joelho, e pressione lentamente o êmbolo para recuperar um cilindro de medula intacto. Use uma pipeta de plástico de três minutos para transferir cuidadosamente e suavemente a medula óssea intacta para uma lâmina de vidro. Corte as extremidades da medula que podem ter sido compactadas no momento da descarga.
Em seguida, corte seções transversais finas de 0,5 milímetros de espessura usando uma lâmina afiada para evitar danificar os megacaiócitos. Usando uma pipeta de plástico, colete 10 seções em um tubo de um mililitro contendo o tampão de Tyrode. Transfira cuidadosamente as seções para uma câmara de incubação com um diâmetro de 13 milímetros.
Aspire o buffer e ajuste o volume para 30 microliters do buffer de Tyrode complementados com 5% de soro do mouse. Posicione as seções à distância. Sele a câmara autoadesiva com um deslizamento de cobertura de 22 por 55 milímetros, inclinando o deslizamento de cobertura para evitar a formação de bolhas de ar.
Coloque a câmara na câmara de aquecimento a 37 graus Celsius. Inicie o cronômetro e execute o experimento por seis horas a 37 graus Celsius, faça vídeos para registrar a transformação dos megacaiócitos. Após 30 minutos, as células de medula migram gradualmente para a periferia da explanta formando uma camada mono.
Após uma hora de incubação, megacariócitos podem ser identificados pelo seu grande tamanho e núcleos polilobulados. O número de megacaiócitos aumenta após três horas de incubação, e alguns têm extensões longas. Desenhe um mapa para localizar cada seção na câmara de incubação.
Após uma hora, identifique os megacaiócitos visíveis, que são células polilobuladas gigantes na periferia de cada seção, e plote suas posições no desenho. Repita este procedimento após três e seis horas. Os megacariócitos são contados manualmente e classificados de acordo com sua morfologia em três e seis horas após a vedação da câmara de incubação.
Eles são classificados como pequenos, grandes com intenção grossa, e proplatelet estendendo. Com a ajuda do mapeamento, sua evolução pode ser seguida ao longo do tempo. Os resultados são expressos em uma porcentagem de cada classe em cada momento de observação.
Clássicamente, metade dos megacaiócitos visíveis na periferia estendem proplatelets em seis horas para medula óssea de camundongos de tipo selvagem. O destino dos megacaiócitos redondos foi seguido pela captura de imagens sequenciais ao longo do tempo para imaginar como eles formam proplatelets. Uma coisa importante a se lembrar ao tentar este procedimento é manter as explantas a 37 graus Celsius durante a duração do experimento.
Uma temperatura diferente pode mudar os resultados. Curiosamente, o protocolo de explant pode ser usado após experimentos de microscopia introvertidos. No final, os megacaiócitos nas explantas de medula óssea serão naturalmente fluorescentes, e seu comportamento pode ser facilmente investigado.
Isso possibilita combinar tratamento diferente nos mesmos animais e, assim, reduzir o número de camundongos. Em conclusão, o método de explant é rápido, simples e fornece muitas informações sobre a capacidade de megacaiócitos naturais para proplatelets externos. O achado qualitativo e quantitativo resultante é fundamental para nossa compreensão da doença trombofílica.
em um contexto fisiológico ou patológico.
