This work was funded by a Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellowship to Y. F. 100104/Z/12/Z.
We would like to thank Dr. Carl Tucker and the team of the fish facility at the Queen&#8217;s Medical Research Institute, University of Edinburgh. We like to thank Michael Millar of the immunohistology and imaging facility of the MRC Centre for Reproductive Medicine, University of Edinburgh for support.
We thank Prof. Dr. Matthias Hammerschmidt and Dr. Heiko Loehr of the Institute of Developmental Biology, University of Cologne for providing the p5E-krt4 entry vector. We also would like to thank Dr. Dirk Sieger of the Centre of Neuroregeneration, Univerity of Edinburgh for providing the pDestTol2CG destination vector.

Os seguintes procedimentos experimentais foram realizados em estrita conformidade com os Animals Act 1986 (Procedimentos Científicos). 1. Preparação de ADN de plasmídeo para microinjecção <ol><li> Purifica-se o plasmídeo pTol2-krt4: KalTA4 ER-T2; cmlc2: eGFP com um kit de purificação de ADN de plasmídeo comercial de acordo com as instruções do fabricante e diluir o ADN plasmídico até uma concentração final de solução de estoque de 100 ng / mL. </li><li> Linearizar o plasmídeo transposase contendo pT3TS / Tol2 14 por digestão de restrição BamHI, seguindo o protocolo do fabricante. Este passo pode ser alargado durante a noite. Precipitar o DNA linearizado por uma extracção com fenol / clorofórmio, seguindo o protocolo padrão. </li><li> In vitro transcrever o ARNm da transposase do plasmídeo linearizado com um kit comercial para a transcrição de grandes quantidades de ARN tampado acordo com as instruções do fabricante, diluídos e a aliquotaa concentração da solução estoque final de 100 ng / mL em água livre de nuclease. Garantir a qualidade do ARN purificado com um nativo de 1-2% de TAE (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA 1 mM) a electroforese em gel de agarose (80-120 V). Armazenar o ARN a -80 ° C. </li></ol> 2. microinjeção de DNA plasmídeo para Transient Expression Gene <ol><li> Prepare uma placa de injeção agarose para manter os ovos fertilizados durante a injeção. Pour líquido 3% de agarose em uma placa de Petri de 90 mm. Deixe a arrefecer de agarose a 40-50 ° C e adicionar a molde em forma de cunha microinjecção TU-1 no topo do líquido de agarose. Após o endurecimento à temperatura ambiente, deixar o resto de agarose a 4 ° C durante 30 minutos antes de remover o molde. Moldes microinjeção armazenar a 4 ° C e reutilização. </li><li> Prepara-se uma alíquota da solução de injecção. Execute os seguintes passos no gelo. Pipetar 1 ul de DNA de plasmídeo (concentração final de 10 ng / ul), 2 ul de ARNm da transposase (concentração final de 20 ng / ul), 2ul de 10 mg / mL de isotiocianato de rodamina B-Dextrano, 2 uL de solução de 5x Danieau (NaCl 290 mM, KCl 3,5 mM, 2 mM de MgSO4, Ca 3 mM (NO 3) 2, 25 mM de HEPES, pH 7,6) para uma volume final de 10 uL em água isenta de nuclease. </li><li> Preparar a partir de agulhas capilares de vidro de borossilicato de 1 mm de diâmetro contendo um filamento interior puxando o capilar em direcções opostas com uma micropipeta extrator. Use o seguinte programa: aquecer 530, puxe 200, velocidade e tempo de 80 150. </li><li> Encha uma agulha com 2 mL da solução de injecção (mantidos em gelo). Evitar bolhas mediante a retirada cuidadosamente a ponta microloader enquanto liberta a solução para o capilar. Parta cuidadosamente a ponta da agulha com uma pinça. </li><li> Regule o tamanho de gota com uma bomba de pico pneumático. Meça o diâmetro da gota / volume (V = 4/3 πr 3) e ajuste o tamanho de gota com um micrômetro ocular sob um estereoscópio em dimetilpolisiloxano. Recomendamos100 mm, o que corresponde a 0,5 nl. Isto assegura a concentrações uniformes e reprodutíveis por cada embrião injectado. Titular da concentração injetada e ajustar para cada preparação de construção e plasmídeo. </li><li> Colocar os zigotos (Figura 1A) obtido a partir de um cruzamento de Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 15 com Tg (LysC: DsRed2) nz50Tg 16 para os moldes de injecção a placa por utilização de um 3 ml pastette. Enquanto isso, de manter a ponta da agulha de injecção previamente preparada em dimetilpolissiloxano para evitar a solução e secando a partir de coagulação. </li><li> Injectar a gota pré-medida (100 um correspondendo a 0,5 nl) sob um microscópio estereoscópico através do cório na discoidal 17, antes da primeira clivagem (Figura 1A). Injecção no estádio de uma célula aumenta o potencial de uma distribuição uniforme do ADN de plasmídeo e de ARN na massa de células em desenvolvimento e a possibilidade de transmissão da linha germinativa. Éde notar que a expressão de construções mais frequentemente tende a ser mosaico. </li></ol> 3. Condicional Transformação celular Skin by 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) <ol><li> Transferir os embriões injectados em solução 0,3x Danieau e mantê-los a 28,5 ° C num incubador. Retire os ovos não fertilizados do prato em fase esfera 17. A co-injectado isotiocianato de rodamina B-dextrano pode ser utilizado como um controle de injecção sob um estereoscópio fluorescente. </li><li> Embriões tela em 24 hpf (hr após a fertilização) para a expressão cardíaca de eGFP. Continue a elevar CMLC: eGFP embriões de peixes-zebra positivos até 72 hpf. Monitorar cuidadosamente a qualidade da água (0,3x Danieau). </li><li> Retire o chorion desses embriões que não eclodiram com uma pinça em 72 hpf. Picar cuidadosamente o chorion com uma pinça e puxe-o para além, usando o outro. Selecionar embriões para LysC: expressão DsRed2 usando um estereoscópio fluorescentes. </li><li> Adicionar 10 ul de 10 mMestoque de (Z) -4-hidroxitamoxifeno a 20 ml de solução Danieau 0,3x (concentração final de 5 uM). Use a indução de uma solução de 4-OHT para uma placa de Petri padrão (90 mm) em um lote de 40-60 embriões. </li><li> Transferir os embriões em uma nova placa de Petri contendo 20 ml de recém-made solução de indução. 4-OHT tem de ser armazenado e manuseado no escuro. Os primeiros sinais de expressão pode ser detectado 2 horas após a indução de início. A indução de uma etapa pode ser alargado durante a noite, mantendo em mente que a célula hospedeira inicial: interacções de células pré-neoplásicas pode ocorrer já algumas horas após o tratamento. </li></ol> 4. Montagem e Imagens ao vivo de Zebrafish Larvas <ol><li> Prepara-se uma placa de Petri de 60 milímetros por introdução de um orifício com um diâmetro de 18-20 mm. Use massa de silicone de alto vácuo, para cobrir e selar o furo na parte inferior exterior da placa de Petri com uma tampa de vidro de 25 mm (Figura 1B). </li><li> Prepare 1% de baixo ponto de fusão (LMP) agarose. Manter um tubo de 1,5 mlde agarose LMP a 37 ° C num bloco de aquecimento. </li><li> Pré-seleção Tg (krt4: KalTA4-ER T2; UAS: eGFP-HRAS G12V; LysC: DsRed2) larvas de célula de pele verde fluorescente e DsRed2 expressão célula imune inata positivo, sob um estereoscópio fluorescente. Anestesiar larvas pela adição de 1 ml de 0,4% tricaina 18 à solução 20 ml de indução. </li><li> Transferir as larvas pré-seleccionada com um pastette em agarose LMP o líquido. Deixe as larvas afundar na LMP agarose e transferi-los para a tampa de vidro (Figura 1B). Orientar os embriões sob um estereoscópio. As larvas devem ser colocados directamente sobre o vidro, para reduzir a distância de trabalho (até 6 larvas). </li><li> Cubra a agarose LMP com a solução contendo tricaina indução após o endurecimento (Figura 1B seta). </li><li> Imagem larvas incorporado usando uma fluorescente invertida, laser de varrimento ou de disco rotativo microscópio confocal. Use um 40X ou 63Xobjetivo como objetivos com distâncias de trabalho longos permitem concentrando toda a larvas. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Durante a embriogénese e desenvolvimento das larvas, a pele de peixe-zebra embrionários é composto de duas camadas epiteliais, a camada superficial chamado periderme e uma camada de queratinócitos basais que estão ligadas à membrana basal subjacente 19 (Figura 1C, a). O protocolo aqui apresentado descreve um método simples para induzir a transformação em células condicionalmente prï¿½neoplï¿½ica na camada superficial da pele de larvas de peixe-zebra, e permite a análise subsequente interacção com células do sistema imune inato de imagens em tempo real. As metodologias base no nosso protocolo de seguir as técnicas bem estabelecidas de peixe-zebra 9-13, e nosso protocolo pode ser facilmente adaptado e modificado. O promotor utilizado aqui krt4 5 dirige-ER KalTA4 expressão T2 especificamente na camada mais externa da pele (Figura 1C, b). No entanto, o gateway modulares MultiSiteestratégia de clonagem, utilizado para gerar o krt4: KalTA4-ER T2 construção (Figura 1D, a), fornece a possibilidade de clonar qualquer promotor de interesse em frente de KalTA4-ER T2 num único passo de clonagem. Uma adaptação do método aqui apresentado é portanto possível para a maioria dos tecidos durante a embriogénese e estádios larvares. A disponibilidade de sequências de promotor é instituído o fator limitante. Além disso, quase qualquer gene de interesse clonado atrás de uma UAS pode ser condicionalmente superexpresso em diferentes estágios de desenvolvimento pela utilização da expressão KalTA4-ER T2 espacial e temporalmente controlada. Por isso, o nosso protocolo pode ser adaptado para realizar a expressão génica condicional em qualquer tecido de interesse em larvas do peixe, de um modo mosaico. Pode-se também otimizar a configuração, a fim de viver imagem tecidos mais profundos, como o fígado ou pâncreas microscópio. Nós descrevemos um aplicativo usando o protocolo queRe, da mesma forma, pode-se overexpress outros moduladores da inflamação usando esse protocolo para estudar a regulação das respostas inflamatórias, como se pode facilmente neutrófilos imagem ao vivo e mudanças comportamentais de macrófagos após a indução e parada na expressão de um modulador inflamatória candidato. Além disso, o protocolo adaptado também seria benéfico para aqueles que querem rastrear o movimento celular e mudança de comportamento durante as diferentes fases da morfogênese do tecido e formação de órgãos e, finalmente, imagem ao vivo da interação de interações entre células da imunidade inata com outras linhagens de células específicas que podem ser direcionados pelo KalTA4-ER sistema de expressão de T2 / UAS indutível. Utilizou-se o vector pDestTol2CG do Tol2kit zebrafish 20-23 que contém um cmlc2: eGFP-PA cassete (Figura 1D, a) que permite posterior seleção de embriões por corações positivos fluorescentes verdes como selection marcador 20, que simplifica o processo de triagem F0. Uma inserção estável do gene de interesse ladeado transposão no genoma é facilitada pela co-injecção do ADN de plasmídeo em conjunto com ARNm de transposase. A preparação de DNA de plasmídeo e o ARNm da transposase para microinjecção segue protocolos convencionais. No entanto, uma integração bem sucedida da construção no genoma depende da transposição baseadas Tol2-14. Isso destaca a atenção especial a ser pago para trabalhar no gelo em condições estéreis para evitar contaminações e degradações por RNases e DNases. Microinjeção em embriões em estágio de uma célula é uma técnica robusta e bem estabelecida para o ganho e perda de estudos da função em 9,10 peixe-zebra. Embora uma pessoa bem treinada pode facilmente injetar na gema de mais de 1.000 embriões em 1 hr, a injecção no blastodisc (Figura 1A, asterisco) requer mais experiência e formação. Critical durante este procedimento is o manuseamento da agulha. A agulha tem que ser muito fino para penetrar na célula sem danos e, portanto, tem de ser quebrado apenas em sua ponta. É importante para controlar regularmente e medir o tamanho de gota durante a injecção para garantir uma injecção uniforme em cada embrião. Manuseados com cuidado, a agulha pode ser usado para rodar o embrião. Isso é muitas vezes necessário para encontrar o blastodisc e o ângulo de penetração ideal. A concentração de ADN e ARNm de transposase utilizado para injecção quase certamente influencia a eficiência de expressão. Doses mais elevadas podem conduzir a um aumento da proporção de células que expressam o transgene, mas com concentrações mais altas de ADN (&gt; 50 ng / mL) e o ARNm da transposase (&gt; 100 ng / mL), também o potencial de efeitos tóxicos entre os embriões injectados se coloca. Nós favorecer a utilização de 10 ng / mL de ADN e 20 ng / ul transposase ARNm para injecção, o que corresponde a 50 pg de ADN plasmídico e 100 ug de ARN por emb injectadoRyo. 100% dos embriões injectados com estas concentrações não se desenvolvem normalmente, entre 40-70% e mostra eGFP-HRAS expressão G12V, após a indução de 4-OHT, dependendo da eficiência injecção no única célula. Entre embriões positivos que normalmente encontrar cerca de 30% que têm 10/01 clones, 40% que têm 10-50 clones e 30% com mais de 50 clones. Devido aos nossos objetivos de pesquisa, somos a favor da utilização de embriões com poucos clones expressando eGFP-HRAS G12V. Nós selecionar embriões com 10-50 clones para nossos experimentos transitórios. Para a geração de peixe transgênico fundador, recomendamos que só selecionar embriões com tanto o marcador cardíaco positivo eGFP e um grande número de clones positivos eGFP-HRAS G12V em sua epiderme. (Z) -4-hidroxitamoxifeno sofre uma interconversão cis-trans (EZ) quando exposto à luz 24. Verificou-se que o isómero cis (E) é 100x menos anti-estrogénica do que a sua contraparte trans 25,26. Exposure à luz, por conseguinte, tem de ser evitado. A solução stock de 4-OHT dissolvido em etanol podem ser armazenadas a -20 ° C no escuro durante um período de tempo longo. Recomendamos o uso de uma caixa para proteger as placas de Petri da luz durante a indução do gene alvo dentro da incubadora e transporte. Embora a área da imagem é muito pequeno e de exposição de 4-OHT para luz UV é reduzida a um mínimo, uma troca constante de solução de indução a cada 2 horas enquanto a imagem ao longo de períodos de tempo mais longos é recomendado para manter os níveis máximos de expressão. 4-OHT permeabiliza efetivamente através do córion e as camadas mais externas da pele durante a embriogênese peixe-zebra, portanto, pode induzir a expressão do gene muito rapidamente. Nós podemos facilmente observar emissão eGFP após 2 horas de indução e foi relatado que os primeiros sinais de expressão do gene-alvo pode ser observada após 1 hora e 3 horas depois de patamar de tratamento 8. As diferenças podem ser devido ao diferente promotor utilizado no nosso estudo. Como tem sido previously informou que 4-OHT tratamento é dependente da dose 8,27, optamos por utilizar a maior concentração relatada de 5 mM para alcançar robustas e reproduzíveis níveis de expressão em nossa abordagem transitória. Isto deveria garantir que todas as células que transportam o transgene irá induzir a expressão do gene alvo. Tem que ser tido em conta que a abordagem transiente aqui apresentada poderia conduzir a diferentes níveis de expressão, devido à possibilidade de múltiplos eventos de inserção aleatória e genoma. Além disso, a utilização do ARNm da transposase no fundo transgénico Tol2 de Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 pode levar a possíveis transposições do transgene UAS que poderia resultar no silenciamento de genes ou perturbação. No entanto, como o método aqui apresentado representa uma abordagem transiente, a pré-selecção de embriões subsequentes à injecção é obrigatória. Muitos laboratórios descobriram que as sequências UAS tendem a ser silenciados na prole transgênica, portanto, emjecting o pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP construir em Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 embriões pode não ser tão eficiente quanto a injeção de um UAS construir em Tg (krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: GFP ) embriões. O uso da linhagem transgênica estável Tg (krt4: KalTA4-ER T2) cruzados com Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 permitirá um acompanhamento preciso das on / off cinética do tempo-dependente de dosagem ativação do gene 4-OHT . Um passo crítico durante a montagem das larvas é a transferência para a agarose LMP e sobre a tampa de vidro (Figura 1B). Existe apenas um curto espaço de tempo para LMP agarose de temperatura de líquido que permite a transferência segura e orientação das larvas pré-seleccionado sem prejudicar os peixes, quer por choque térmico ou o endurecimento do gel. As larvas devem ser orientados diretamente sobre a tampa de vidro para reduzir a distância de trabalho para a Analy microscópico subsequentesis. Como isso pode ser um fator limitante durante microscopia a escolha dos objectivos adequados é obrigatória. Uma vez montada, a larva possa ser mantida de horas a dias. A condicionalidade do sistema modelo aqui apresentado permite a transformação repetida por ativação 4-OHT do transgene. O sistema de expressão depende da presença de 4-OHT e, portanto, a expressão KalTA4 controlada de um gene de interesse é reversível (Figura 1D, b). Em contraste com o sistema Cre-ER T2 / Lox, o que facilita um evento de recombinação irreversível genómico 28, KalTA4 ER-T2 / UAS pode ser activada e desactivada por adição ou remoção de 4-OHT e este potencial para indução repetida é uma vantagem de a técnica sobre o sistema T2 / Lox Cre-ER. No entanto, o requisito de níveis constantes de 4-OHT é uma limitação, desde que a experiência tem que ser prolongado de dias a semanas.

O crescimento de uma progênie de células pré-neoplásicas dentro de uma folha epitelial de outra maneira normal depende fortemente de uma interação com seu microambiente. A interação com o seu tecido hospedeiro é provável que seja o principal determinante de saber se uma célula pré-neoplásica é capaz de estabelecer um nicho clonal para desenvolver ainda mais em um câncer desenvolvido. Apesar de sua importância no desenvolvimento, esta fase inicial de progressão do câncer é inacessível em sistemas modelo mais comumente usados, in vivo. O peixe-zebra, Danio rerio, é um organismo modelo bem estabelecido para estudos de imagem ao vivo por causa de sua transparência ao longo do desenvolvimento, a possibilidade de manipulação genética, e acessibilidade para os medicamentos solúveis em água. Estudos recentes, utilizando um modelo de larvas de peixe-zebra, que sobre-expressam o oncogene humano HRAS G12V para transformar células epiteliais, mostraram que sinais da célula hospedeira derivada, em especial H 2 O 2 a chumboo recrutamento de células imunitárias inatas. Interessantemente, as células imunes recrutadas, neutrófilos e macrófagos, mostraram ter um papel trófico no apoio a proliferação de células pré-neoplásicas 2,3. A fim de compreender os primeiros eventos de início e progressão do tumor, bem como a contribuição de uma resposta inflamatória, é necessário ser capaz de imagem estes eventos desde o ponto de tempo mais curto em diante. Por isso, é necessário controlar as transformações celulares de uma forma específica de tecido e temporais. Nós utilizamos o sistema / UAS de Gal4 que foi adaptado com sucesso a partir de Drosophila 4 de expressar condicionalmente o oncogene humano HRAS G12V sob o controlo do promotor específico de queratina da pele 4 (krt4) 5. A versão modificada do activador da transcrição Gal4, nomeadamente KalTA4 6, permite a expressão de HRAS G12V sob o controle da sequência activadora a montante (UAS). Para induzir a expressão condicionalmente activador transcricional, KalTA4 foi fundido com o domínio de ligação ao ligando mutante das α do receptor de estrogénio humano (ER T2) 7, que se liga especificamente 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) 1. Na ausência de 4-OHT T2 RE está ligado no citoplasma por proteínas de choque térmico. Após 4-OHT obrigatório o choque térmico proteínas dissociar, permitindo a translocação nuclear de KalTA4-ER T2 e consequente ativação dos UAS gene de interesse 8 controlados (Figura 1C, b). Como este sistema de expressão depende da presença de 4-OHT, a expressão KalTA4 controlada de um gene de interesse é reversível. Em contraste com o sistema Cre-ER T2 / Lox, o que leva a um evento de recombinação irreversível, a indução da activação transcricional pela KalTA4 ER-T2 é reversível pela adição ou remoção de 4-OHT. O seguinte protocolo de alo<html> ws uma transformação condicional de células da pele em larvas do peixe e um posterior acompanhamento da interação com as células imunitárias inatas por expressão da proteína fluorescente. As metodologias básicas empregadas neste protocolo são semelhantes a algumas técnicas comumente utilizadas na Comunidade peixe-zebra 9-13. A geração e uso combinatória de linhagens transgênicas em conjunto com a microinjeção de construções transgênicas possibilita uma abordagem transitória para apenas transformar células individuais de uma forma de mosaico. A permeabilidade ao oxigênio da pele do peixe-zebra embrionário e larval levanta a possibilidade de time-lapse estudos de imagens ao vivo através de microscopia de alta resolução de horas a dias. Além disso, a sua acessibilidade aos medicamentos solúveis em água vai permitir que futuros estudos sobre os mecanismos e o acompanhamento dos celulares eventos biológicos in vivo que poderiam levar a uma melhor compreensão dos estágios iniciais do desenvolvimento do câncer. _content &quot;&gt; Este protocolo pode ser adaptado para realizar a expressão génica condicional em qualquer tecido de interesse em larvas do peixe, de um modo mosaico. Pode-se também optimizar a configuração, a fim de viver imagem outros tecidos mais profundos do que a pele microscópio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1104">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:197px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:467px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(Z)-4-Hydroxytamoxifen&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H7904</td>
			<td>dilute in ethanol and store in the dark at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>20x/0,5 Ph2 &#8734;/0,17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>40x/1,2W Korr &#8734;/0,14-0,18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">63x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>63x/1.4 Oil Ph3 &#8734;/0,17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 510 META</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0171</td>
			<td>Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DMPSV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dow Corning high-vacuum silicone grease&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MKBL4135V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Program: heat 530, pull 200, velocity 80 and time 150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent stereoscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>M205 FA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjection mold TU-1</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microloader tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axiovert 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE mMACHINE Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic pico pump</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>PV820&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic pico pump</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-90A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B isothiocyanate-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8881</td>
			<td>10mg/&#956;l in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>M80</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BMC developmental biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PloS one 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine/MS-222</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Low Melting Point Agarose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td>25:24:1, v/v</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of innate immune and preneoplastic cell interactions using an inducible gal4/uas expression system in larval zebrafish skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Zigotos de um cruzamento entre Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 e Tg (LysC: DsRed2) nz50Tg foram recolhidos 10-15 minutos após a fertilização (Figura 1A) para obter uma embriões em estágio de célula. Após a injecção os embriões foram criadas até 3 dpf, antes da indução com 4-OHT e montagem para imagens em tempo real (Figura 1B). 2-6 horas pós indução as embriões foram montadas colocado quer sob um microscópio de fluorescência invertido (Figura 2A) ou um microscópio invertido confocal (Figura 2B-C) e fotografada por 2-3 h com 1,5 minutos de intervalo. As células pré-neoplásicas da pele superficiais podem ser identificados pela sua morfologia mais arredondada em comparação com os queratinócitos normais, bem como a emissão fluorescente verde da membrana localizada eGFP-HRAS G12V. Áreas de imagem foram selecionados para co-localização das células da pele e células pré-neoplásicas da imunidade inata (Figura 2A cabeça de seta). Devido ao rápido migprocesso de ração dos neutrófilos nos intervalos de lapso de tempo foram escolhidos para estar entre 1-1,5 min com pilha Z tamanhos de passo de 0,7-1,7 mm para obter projeções máximos de intensidade (Figura 2, Video 1). Existe uma vasta gama de comportamentos que podem ser observados enquanto imagens ao vivo: neutrófilos migram ao lado e sob as células pré-neoplásicas (Figura 2C, Vídeo 1), formam contactos directos para as células (Figura 2B e C), remova restos de células pré-neoplásicas que se submetem apoptose (Vídeo 1), ou activamente engolir partes de células pré-neoplásicas (não mostrado). Para capturar o espectro completo de interações, é aconselhável seguir os seus comportamentos por time-lapse imagens ao vivo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" width="700px" /> Figura 1: Esquema para a transformação de células da pele condicional em larvas do peixe. (A) Uma imagem de um zigoto de TG (UAS: eGFP-HRAS G12V; LysC: DsRed2) zebrafish em 10 min após a fertilização (MPF). O ovo fertilizado é cercado pelo chorion (seta). O local para a injecção é a discoidal (asterisco), formada por correntes citoplasmáticos da gema (seta) que define o polo animal do embrião. (B) de montagem de larvas de peixe-zebra. Placa de 60 mm de Petri com um orifício de 18-20 mm (ponta de seta) que é selada por uma tampa de vidro de 25 mm. As larvas do peixe-zebra são imobilizados e montado na tampa de vidro de 1% agarose LMP. Solução 0,3x Danieau (seta) contendo 5 uM 4-OHT é utilizado para cobrir a agarose LMP. (C) 4-OHT transformações de células superficiais da pele. (A) de perfil transversal esquemático de pele induzida larval. A pele embrionário e larval é composto de duas camadas de células epiteliais, uma camada superficial de células e uma camada basal de células de queratinócitos que estão ligadas à membrana basal subjacente (BM). (B) A expressão transiente do sistema tPara induzir um clone de células pré-neoplásicas entre as células superficiais da pele. KalTA4 ER-T2 é expresso exclusivamente na camada mais externa da pele dirigido pelo promotor krt4 (amarelo). Mosaico de expressão KalTA4-ER T2 activa UAS controlada (azul) eGFP-HRAS G12V expressão em células superficiais, levando a um clone de células pré-neoplásicas (verde). (D) esquemática do sistema de expressão transiente. (A) da cassete Tol2 pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP vector expressão utilizada transitoriamente (b) indução da expressão condicional ativador da transcrição.. KalTA4 é fundido com o domínio de ligação ao ligando do receptor mutante α estrogénio humano (ER T2) que se liga especificamente 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT). Na ausência de 4-OHT T2 RE está ligado no citoplasma por proteínas de choque térmico (Hsp90). Após a ligação de 4-OHT Hsp90 dissocia-se, permitindo que uma translocação nuclear de KalTA4-ERT2 e consequente ativação dos UAS expressão eGFP-HRAS G12V controladas. Barra de escala A = 500 mm. <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" width="700px" /> Figura 2: Imagens ao vivo da interação célula imunológica inata e pré-neoplásica. (AC) Imagens de um 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; LysC: DsRed2) embrião, que foi injetado com pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP e mRNA transposase em um estágio de célula. As imagens foram recolhidas após 6 horas de indução de 4-OHT (A) vista lateral da região da tailfin às 6 horas após o tratamento, que mostra porções de eGFP-HRAS G12V que expressam as células da pele (seta), e LysC:. DsRed2 + neutrófilos (ponta de seta). (BC) Imagens representativas taken a partir de um filme de lapso de tempo confocal, mostrando neutrófilos (vermelho) interacções com eGFP-HRAS G12V que expressam as células da pele (verde). (B) Uma célula prï¿½neoplï¿½ica forma uma extensão curta filopodial com o contacto de neutrófilos (ponta de seta). (C) Os neutrófilos (vermelho) está em contacto estreito com um clone de células da pele pré-neoplásicas (verde). Barra de escala em A = 100 mm; B / C = 50 mm. <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52107/Video_1.mov" target="_blank">Vídeo 1</a> : Time-lapse imagens ao vivo de interação célula imunológica inata e pré-neoplásica. Time-lapse de um 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; LysC: DsRed2) embrião, injetado com pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP e mRNA transposase em um estágio de célula. Confocal filme de lapso de tempo 6-9 hoUrs depois de 4-OHT indução mostrando LysC: DsRed2 + neutrófilos (vermelho) interações com eGFP-HRAS G12V expressando células da pele (verde). Os neutrófilos migram ao lado e sob as células pré-neoplásicas e remover restos de um celular pré-neoplásica que sofre apoptose. Intervalos de lapso de tempo de 1,5 minutos durante 3 horas com a pilha Z tamanhos de passo de 1,3 mm.

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Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin | Developmental Biology | Video

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Estudar os primeiros eventos de progressão de células pré-neoplásicas e interação célula imune inato é fundamental para compreender e tratar o câncer. Aqui nós descrevemos um método para induzir condicionalmente transformações de células epiteliais e do subsequente imagens ao vivo de interação célula imune inato com HRAS G12V expressando células da pele em larvas do peixe.

Imagens ao vivo da imunológica inata e pré-neoplásicas Interações de células utilizando um / UAS Expression System Inducible Gal4 em larvas de peixe-zebra da pele

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

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Vídeo: Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Biologia do Desenvolvimento

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Ovule cultivo para viver-pilha de imagem do zigoto polarização e padronização do embrião em Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Estabelecimento de Zebrafish Larval como um modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidade In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

Quantificando o tamanho do fígado em zebrafish larval usando microscopia de campo brilhante

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Preparação de Drosophila Larval e Pupal Testes para Análise de Divisão Celular em Tecido Vivo e Intacto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control over gene expression timing, location, and amplitude using light as the inducing agent. In this protocol, an optogenetic expression system is used to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos. This system relies on an engineered transcription factor called TAEL based on a naturally occurring light-activated transcription factor from the bacterium E. litoralis. When illuminated with blue light, TAEL dimerizes, binds to its cognate regulatory element called C120, and activates transcription. This protocol uses transgenic zebrafish embryos that express the TAEL transcription factor under the control of the ubiquitous ubb promoter. At the same time, the C120 regulatory element drives the expression of a fluorescent reporter gene (GFP). Using a simple LED panel to deliver activating blue light, induction of GFP expression can first be detected after 30 min of illumination and reaches a peak of more than 130-fold induction after 3 h of light treatment. Expression induction can be assessed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and by fluorescence microscopy. This method is a versatile and easy-to-use approach for optogenetic gene expression.

Optogenetics is a powerful tool with wide-ranging applications. This protocol demonstrates how to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos using the blue light-responsive TAEL/C120 system.

Expressão GFP induzida pela luz em embriões de zebrafish usando o sistema OPtogenético TAEL/C120

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...