Este protocolo é significativo porque é um método optogenético, ou ativado pela luz, para induzir a expressão genética, em um organismo intacto. No nosso caso, um embrião de zebrafish. A vantagem dessa técnica, é que ela usa a luz, como um agente indutor, o que permite um controle muito preciso, espaçacial e temporal da indução.
Este protocolo seria útil para qualquer situação em que a expressão genética indutível seria útil. Isso inclui coisas como rastreamento de linhagem, ensaios de ganho de função ou experimentos de resgate. Para começar, o painel LED em relação às placas de Petri contendo embriões para fornecer 1,5 miliwatts por centímetro quadrado de energia de luz para vários embriões ao mesmo tempo.
Para reduzir o risco de dano fotográfico ao Ativador Transcricional da Cauda, poste a luz em intervalos de uma hora de desconto usando um relé de temporizador, se iluminar por mais de três horas. Remova as tampas da placa de Petri para minimizar a dispersão de luz da condensação. Coloque placas de Petri contendo embriões de controle e uma caixa à prova de luz para controles escuros.
Remova os embriões da iluminação, após a duração desejada de ativação. Para extração total de RNA, use um kit de extração de RNA. Transfira os embriões para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro e remova o excesso de água dos ovos.
Após a adição de tampão de lise, homogeneize os embriões com o pilão plástico. Transfira o lysate para uma coluna fornecida pelo kit e siga as instruções do fabricante para purificar o RNA. Armazene o RNA purificado, a menos 20 a menos 80 graus Celsius, até que use ou síntese imediatamente de cDNA de um micrograma, RNA total usando o kit de síntese cDNA, seguindo as instruções do fabricante.
Adicione um micrograma de RNA em uma parede fina 0,2 mililitro, tubo PCR, contendo quatro microliters, de cinco vezes mistura mestre de reação cDNA, seguido pela adição de um microliter, de 20 vezes solução de enzima transcriptase reversa. Em seguida, compõem um volume final de 20 microliters, com água sem nuclease. Coloque o tubo em um ciclo termo programado para síntese de CDNA.
Armazene o cDNA sintetizado a menos 20 graus celsius até usar ou usar imediatamente para avaliação quantitativa. Configure as reações quantitativas do PCR contendo mistura mestre de enzimas de verde cibernético. Cinco vezes diluídos primers cDNA e GFP em 325 nanomolar concentração em triplicados e conduzir a reação em uma máquina PCR programada em tempo real.
Após a conclusão da reação, analise a curva de derretimento para determinar a especificidade da reação. Calcule a indução ativada pela luz como mudança de dobra em relação aos embriões de controle usando o método duplo de Tomografia Delta. E usar software estatístico para determinar o significado.
Após a remoção dos embriões da iluminação, imobilize embriões para imagem em 3%de metilcelulose contendo 0,01% Tricaine em lâminas de depressão de vidro. Adquira imagens de fluorescência e brightfield em um microscópio estéreo fluorescente conectado a uma câmera digital usando as configurações padrão do filtro GFP. Mescle imagens de brightfield e fluorescência após a aquisição com software de processamento de imagens.
A quantificação da expressão GFP indicou indução de expressão logo após 30 minutos após a exposição à luz azul. Os níveis de expressão GFP continuaram a aumentar até seis horas, após a ativação de forma constante. A indução de GFP também foi avaliada qualitativamente examinando a intensidade da fluorescência ao mesmo tempo em que os pontos pós-ativação.
A fluorescência GFP acima dos níveis de fundo foi observada pela primeira vez em três horas após a ativação e tornou-se visivelmente mais brilhante em seis horas após a ativação. Em contraste, os embriões de controle para todos os pontos de tempo, mantidos no escuro, não apresentaram, qualquer fluorescência GFP apreciável. A luz ativante deve estar na faixa azul do espectro de luz visível.
Tanto a luz do quarto quanto a luz solar contém alguma luz azul. Portanto, tome cuidado para proteger seus controles negativos de quaisquer fontes de luz ambiente. O sistema TAEL C120 é geneticamente codificado e modular e pode conduzir a expressão de qualquer gene de interesse.
Assim, combinado com outras técnicas, pode ser usado para responder a uma série de perguntas biológicas.
