Este trabalho foi financiado pelas subvenções Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 e RU-1652 / 1-1. Agradecemos Doreen maio para assistência técnica excelente ea empresa DYOMICS GmbH, Jena por seu apoio tipo.

NOTA: Todos os procedimentos são aprovados pelo comitê de animais regional e de acordo com as diretrizes internacionais sobre o uso ético de animais. 1. Elaboração de Materiais e Instrumentos <ol><li> Preparação da dispersão vesicular formam-se espontaneamente (SFV) <ol><li> Dissolve-se e preparar-se soluções de reserva dos seguintes fosfolípidos: 214 mg / mL de fosfatidilcolina de ovo (EPC), 134 mg / ml de colesterol e 122 mg / ml de 1,2-distearoyl- sn-glicero-3-phosphoethanolamine- N - [metoxi (polietileno glicol) -2000] (sal de amónio) (mPEG 2000 -DSPE) e 2 mg / ml de 1,2-dioleoyl- sn-glicero-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 il) (sal de amônio) (NBD-DOPE) em clorofórmio e armazenar em frascos de vidro. </li><li> Fornecer cerca de 3 ml de clorofórmio, num balão de fundo redondo e transferir o volume apropriado de solução de estoque de fosfolípido para o balão de fundo redondo para preparar lipossomas compostos de EPC: Chol: mPEG 2000 -DSPE a uma razão molar de 6,5: 3: 0,5. Para a rotulagem de fluorescência dupla de lipossomas adicionar 0,3 mol% NBD-DOPE à solução lipídica. </li><li> Evapora-se o clorofórmio a partir da solução de fosfolípido orgânica sob pressão reduzida (300 mbar) a 55 ° C utilizando um evaporador rotativo. </li><li> Depois de uma película homogénea fosfolípido é formado, reduzir a pressão para 10 mbar durante 1-2 h para remover o depósito de clorofórmio residual. </li><li> Enquanto o clorofórmio é evaporação, dissolve-se DY-676-COOH (6.181 uM) em tampão Tris 10 mM pH 7,4 e encher um recipiente Dewar com azoto líquido. Ligar um banho de ultra-sons e é ajustado a 50 ° C. </li><li> Transferir um volume adequado (0,5-1 ml) de solução para o balão de fundo redondo para hidratar o filme de fosfolípido seco e vortex vigorosamente até que a vesícula formada espontaneamente (SFV) formas de dispersão DY-676-COOH (6.181 uM). Certifique-se de que todos os fosfolipídios são dispersas para evitar a perda de lipídios. </li><li> Cuidadosamente transfer o balão de fundo redondo contendo a dispersão de SFV em azoto líquido e congelar a dispersão durante 3-5 min. Colocar o balão de fundo redondo em um banho de ultra-sons a 50 ° C para descongelar a dispersão, em seguida, a dispersão vortex vigorosamente durante 1-2 min. Repetir este processo seis vezes, perfazendo um total de sete ciclos de congelamento e descongelamento. </li></ol></li><li> Extrusão de SFV para formar vesículas de lipossomas homogéneos <ol><li> Transferir a solução de SFV em uma seringa de 1 ml (uma seringa) e expulse a dispersão através de uma membrana de policarbonato de 100 nm, utilizando uma extrusora LiposoFast-básico em seringa-b. </li><li> Expulse a dispersão de seringa-b, de volta para a seringa-a, em seguida, repita o ciclo de dez vezes. Devido ao processo de extrusão, a solução em que as alterações de seringa de um aspecto turvo a uma dispersão límpida com o tempo. Depois de dez ciclos (vinte passos individuais de extrusão) remover seringa-b a partir do dispositivo de extrusão da dispersão e pela última vez a partir de uma seringa directamente para uma estéril1,5 ml dos tubos de reacção. </li></ol></li><li> A purificação do encapsulado em liposomas DY-676-COOH a partir de corante livre <ol><li> Prepara-se uma coluna de cromatografia em gel, utilizando G25 grânulos embebidos em 10 mM Tris pH 7,4 (coluna de comprimento 28 cm, diâmetro de 0,8 centímetros). </li><li> Transferir 0,5 ml de dispersão vesicular extrudido sobre a camada de gel e deixar o ralo amostra na matriz de gel. </li><li> Elui-se os lipossomas com tampão Tris 10 mM pH 7,4 (Figura 1A) e lava-se a coluna até os drenos de corantes completamente livres para fora da coluna. Se necessário, recolher e reciclar o corante livre por dessalinização e desidratação de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Concentra-se os lipossomas eluídas por ultracentrifugação (200.000 x g, 2 horas a 8 ° C), em seguida, dispersá-los em volume adequado de solução estéril de 10 mM de Tris, pH, 7,4. </li></ol></li><li> Quantificação da concentração encapsulada DY-676-COOH <ol><li> Prepare uma curva de calibração, dissolvendo DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) em tampão Tris 10 mM, pH 7,4 contendo 0,1% de Triton X100. </li><li> Dissolve-se 2 ul (100 nmol de lípido final de 50 mmol / L de estoque) dos lipossomas durante 5 min à temperatura ambiente em tampão 100 ul de Tris contendo 1% de Triton X-100 para destruir as vesículas e libertar o corante encapsulado. Depois dilui-se as amostras com tampão Tris 10 mM, pH 7,4 para uma concentração final de Triton-X100 a 0,1% (v / v) fazendo um volume total de 1 ml. Preparar todas as amostras em duplicado. </li><li> Medir a absorção e emissão de todas as amostras (livre DY-676-COOH e Triton-X100 tratada lipossomas) a uma excitação λ = 645 nm e uma emissão λ = 700 nm. Estabelecer e utilizar uma curva de calibração do corante livre para determinar a concentração de corante encapsulado. </li></ol></li><li> Caracterização Liposome <ol><li> Determine o tamanho e potencial zeta de lipossomas por espalhamento dinâmico de luz. Diluir as amostras de lipossomas com filtro esterilizados (0,2 um) de tampão Tris 10 mM, pH 7,4 a aconcentration de 100-300 uM (lípido). Transferem-se as amostras diluídas numa cuvete descartável de baixo volume e medir a amostra de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Caracterizar os lipossomas por microscopia electrónica para substanciar o tamanho, a integridade e a homogeneidade de vesículas lipossomais de acordo com os protocolos normalizados. </li></ol></li></ol> 2. Validação de Fluorescência-têmpera e Ativação de lipossomas preparados <ol><li> Análise físico-química de extinção da fluorescência e ativação <ol><li> Preparar dois tubos de 1,5 ml para o Lip-Q e 2 tubos para a livre DY-676-COOH. Transferir 100 nmol lípidos totais (2,38 ul de uma solução de estoque / L Lip-Q 42 mmol, contendo 138 ug / ml do encapsulado DY-676-COOH) para os tubos correspondentes. Transferência livre equivalente DY-676-COOH ao teor de corante de Lip-Q (0,38 mg o que resulta, por exemplo, a partir de 138 mg / l 1.000 x 2,38 ul Lip-Q usado). Incubar uma banheirae de cada sonda, a 4 ° C e congelar o segundo tubo a -80 ° C durante a noite (16 h). </li><li> Aquece-se um bloco de aquecimento a 30 ° C. Encha uma caixa de arrefecimento com gelo moído e equilibrar-se uma alíquota de tampão 10 mM Tris pH 7,4 à temperatura ambiente. </li><li> Remover sondas de 4 ° C e equilibrar à temperatura ambiente (envolvido em folha de alumínio para proteger da luz) e descongelar rapidamente as sondas de -80 ° C a 30 ° C durante 5 min. Relaxar as sondas descongeladas em gelo durante 1 min antes de os transferir para a temperatura ambiente (também envolvido em folha de alumínio para proteger da luz). </li><li> Adicionar tampão Tris 10 mM (pH 7,4) a cada uma das sondas ao volume final de 100 uL e equilibrar todas as sondas à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Pipeta 80 mL de cada sonda em um volume baixo tina de vidro e medir a absorção de cada sonda 400-900 nm em um espectrômetro. Retorne a sonda para seus tubos correspondentes. </li><li> Transferir 80 mL de cada sonda em uma tina de vidro adequadoe medir a emissão de fluorescência em um espectrofluorómetro por excitantes as sondas a 674 nm, e medir a fluorescência de 694-800 nm. </li></ol></li><li> A absorção celular e a activação de fluorescência <ol><li> Obter e cultura as seguintes linhas de células no seu meio de cultura correspondente de acordo com condições padrão (37 ° C, 5% CO 2 e 95% de atmosfera humidificada). Aqui, o uso J774A.1 linha celular de macrófagos de murino (meio Dulbecco modificado de Eagle suplementado com 10% (v / v) de soro fetal de vitelo), a linha celular de glioblastoma humano, L-118 mg (MEM contendo vitaminas essenciais e 10% (v / v) de soro fetal de bezerro) e a linha de células de fibrossarcoma humano, HT-1080 (RPMI com 5% de FCS). </li><li> Casaco-8 bem lâminas de câmaras com poli-L-lisina (adicionar 100 ul 0,001% poli-L-lisina a cada poço e incubar a 37 ° C durante 10 min. Aspirar solução e deixar que as lâminas de câmara para secar-se durante pelo menos 4 h à temperatura ambiente sobre uma bancada de trabalho estéril. Lavar as lâminas de câmara 3vezes com solução salina 200 mL de Hank, em seguida, feche-os com parafina e folha de alumínio e armazenar a 4 ° C até necessário. </li><li> Enquanto as lâminas de câmara estão secando, filtro de esterilizar os lipossomas e solução de corante e armazenar a 4 ° C até necessário. </li><li> Para a análise de absorção da sonda com todo o corpo in vivo NIR sistema de imagiologia por fluorescência, preparar 5 pequenos frascos de cultura de cada uma das três linhas de células de ensaio (frascos de 15 no total). Semente de 2 x 10 6 J774A.1, L-118 mg e células HT-1080 por frasco de cultura com 5 mL do respectivo meio de cultura (em quíntuplos) e crescer durante 16-24 horas. Paralelas aos frascos de cultura, 30.000 células sementes de cada linha celular (J774A.1 e HT-1080) ou 20.000 células (L-118 mg) de 2 poços da corrediça câmara, respectivamente, e crescer em 500 ul de meio de cultura durante 16-24 hr . </li><li> No dia seguinte, adicionar 100 nmol (montante final lipídica) de Lip-Q para 2 frascos por linha celular e para um bem de cada linha celular no slide câmara.Transferir imediatamente um balão por linha de células a 4 ° C e o segundo frasco de volta para a incubadora. NOTA: O volume das sondas adicionado aos frascos e as lâminas de câmara são o mesmo, tornando a concentração em lâminas de câmara de 10 vezes maior (5 ml é de 500 ul de meio de cultura). Isto é necessário porque a detecção microscópica é menos sensível do que o sistema de imagiologia NIR de fluorescência em que os grânulos de células a partir de balões são gravadas. </li><li> Adicionar o livre DY-676-COOH em uma concentração equivalente ao conteúdo de corante Lip-Q para as células em 2 frascos por linha de células e a um poço de cada linha de células na câmara de corrediça, em seguida, imediatamente transferir um balão por linha de células a 4 ° C (depleção de energia) e o outro balão em conjunto com a lâmina de câmara de novo na incubadora. Incubar todas as células durante 24 horas nas condições correspondentes. As células no frasco sem sonda servir como controlo não tratado. </li></ol></li><li> Imagiologia NIRF e análise semi-quantitativa <ol><li> Após 24 h de incubação duração, colher as células em frascos por lavagem as células 2 vezes com solução salina tamponada de Hanks (HBSS), em seguida, raspar células em 500 ul de HBSS e pelete por centrifugação (5 min a 200 xg) em 500 ul tubos. </li><li> Colocar os tubos com os sedimentos celulares (e HBSS) em um imager NIRF e de imagem usando filtros para excitação (615-665 nm) e emissão (corte em&gt; 700 nm). </li><li> Deduzir autofluorescência e avaliar a intensidade do alvo contra autofluorescência de acordo com as instruções do fabricante. Isso dará aos níveis semi-quantitativas de intensidade de fluorescência como sinal médio (contagem escalados / s), o que representa níveis de contagem após a escala de tempo de exposição, o ganho de câmera, binning e profundidade de bits, de modo que as medições são comparáveis ​​entre si. </li></ol></li><li> Análise microscópica confocal <ol><li> Após 24 h de incubação, a colheita das células sobre lâminas de câmara por lavagem duas vezes com 500 uL de HBSS. </li><li> Fixar o cells com 200 ul de HBSS contendo 3,7% (v / v) de formaldeído, durante 30 min à TA. </li><li> Enquanto fixação está acontecendo, diluir a mancha DNA, Hoechst-33258 1:50 com solução de montagem. </li><li> Após a fixação, lavar as células duas vezes com HBSS, em seguida, separar as câmaras de lâminas de vidro. Adicionar a solução de montagem 50 ul contendo o ADN-mancha em cada mancha correspondente ao das cavidades das lâminas de câmara. Cubra as células com lamelas de vidro, selar bordas com transparente unha polonês e por 10 min de ar seco à temperatura ambiente (escuro). </li><li> Células imagem em um microscópio de fluorescência adequado ou microscópio confocal. Use as seguintes configurações de excitação e emissão para a visualização dos componentes correspondentes: núcleos (Hoechst-33258: excitação 405 nm, emissão 420-480 nm). NBD-DOPE (lipídico lipossómico: excitação 488 nm, emissão 530 nm). DY-676-COOH (corante fluorescente NIR: excitação 633-645 nm, emissão de 650-700 nm). NOTA: Certifique-se de que o microscópio de fluorescência umvailable está equipado com filtros adequados que permitam a excitação e emissão de comprimentos de onda superior a 630 nm. </li></ol></li></ol> 3. Liposome baseada-In Vivo imagens de fluorescência de Inflamação <ol><li> Preparação dos animais e dos materiais <ol><li> Casa de 8-12 semanas de idade, ratinhos NMRI machos, pesando aproximadamente 36 g, em condições normalizadas, com alimentos e água ad libitum. </li><li> Sete dias antes do início das experiências, todos os ratinhos dar uma dieta baixa feoforbida a fim de reduzir a autofluorescência de tecidos. </li><li> Vinte e quatro horas antes do início de cada experiência, os ratos barbear na área desejada (por exemplo, toda a área de volta se a imagiologia do edema da perna posterior é desejado). </li><li> Pese os animais e calcular a quantidade de sonda a ser injetado por rato (Lip-Q e Lip-dQ a 10 nmol (concentração de lipídios) por kg de peso e livre DY-676-COOH (equivalente a tingir o conteúdo de Lip-Q usado) . </li><li> Imagem dos animais emum corpo inteiro NIR gerador de imagens de fluorescência com os mesmos parâmetros utilizados para as pelotas celulares. Esta medição fornece autofluorescência dos animais. </li><li> Dissolvem-se 10 mg de zimosan-A em 1 ml de solução salina isotónica e armazenar durante a noite a 4 ° C. </li></ol></li><li> A indução da inflamação in vivo e NIRF imagiologia <ol><li> Prepare 3 seringas por rato que contenham as seguintes soluções. Encher uma seringa com 50 ul zimosan-se uma solução (10 mg / mL) e a segunda seringa com 50 mL de solução salina isotónica. Encha a terceira seringa com as sondas, sendo que Lip-Q e Lip-DQ (10 mmol / kg de peso (lípidos)) são designados para animais de teste e livre DY-676-COOH (concentração como em Lip-Q) para animais de controle. Certifique-se que as sondas são diluídas com HBSS estéril a 150 volume final ul. </li><li> Aplique o creme de olho nos olhos dos animais para evitar a secura e anestesiar animais com 2% de isoflurano até que eles estão dormindo profundamente e não reagem quando tocado nas patas (isto leva de cerca de 2 min). </li><li> Posicione o mouse sobre um tapete quente (ainda sob anestesia) e injetar o zymosan-A via subcutânea solução na perna traseira direita e a solução salina sobre a perna esquerda. Injectar imediatamente a sonda intravenosa e imagem do animal, posteriormente, em seguida, tempo recorde de injeção / medição (como t = 0 h). Salve as imagens resultantes como cubos de imagem e repita os passos acima para todos os outros animais e respectivas sondas. </li><li> Imagem os animais todos os 2 hr para 10 horas após injecção e às 24 horas após a injecção, assegurando-se que a fase da câmara de medição está quente (por exemplo, pela colocação de uma esteira quente por baixo), a fim de evitar a hipotermia. Após cada medição, colocar os animais numa gaiola com comida e água ad libitum e colocar a gaiola numa câmara de animais temperado. Eutanásia os animais por primeira anestesia com isoflurano a 2%, até os animais já não reagem ao toque, então sacrificá com dióxido de carbono para 5-10 min, fazendoCertifique-se de que os animais parar de respirar completamente e rigor mortis ocorre. </li><li> Dissecar os ratos de acordo com protocolos padrão que podem ser avaliadas em linha (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) e imagem dos órgãos. </li><li> Avaliar os resultados da medição de acordo com as instruções do fabricante pela primeira dedução da fluorescência geral dos animais (desmistura), em seguida, as regiões atribuição de interesse para autofluorescência (esquerda perna com soro fisiológico) e alvo de fluorescência da área inflamada (pata traseira direita com zymosan-A). </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Uma vez que os lipossomas também podem servir como sistemas de entrega de corantes fluorescentes, que permitem imagiologia de doenças alvo. A encapsulação de concentrações elevadas de corantes fluorescentes, tais como o corante NIRF, DY676-COOH usado aqui, leva a um elevado nível de extinção de fluorescência do corante aprisionado. Extinção da fluorescência, um fenómeno observado com diversos fluoróforos em concentração elevada pode ser explorada em diversas aplicações em imagiologia in v...

Os lipossomas têm sido intensivamente investigados e servir como um dos sistemas de fornecimento de drogas biomédicas mais biocompatíveis para aplicações clínicas 1,2. Eles são compostos principalmente de fosfolípidos e colesterol, ambos os quais são compostos que imitam biocompatíveis partes de membranas celulares naturais. Considerando que as substâncias hidrofílicas podem ser encapsulados no interior aquoso, agentes lipofilicos podem ser incorporados no interior da bicamada fosfolipídica lipossomal 3. A encapsulação de substâncias no interior aquoso dos lipossomas concede protecção contra a degradação in vivo e também evita que o sistema hospedeiro contra os efeitos tóxicos de fármacos citotóxicos utilizados para a terapia de doenças como, por exemplo, agentes quimioterapêuticos destinados a destruir as células tumorais. A modificação da superfície de lipossomas com polímeros como o polietilenoglicol (PEGuilação) estende-se ainda mais o tempo de circulação no sangue de lipossomas in vivo devido à estabilização estérico 4. Moreover, os lipossomas podem sequestrar concentrações elevadas de várias substâncias, tais como proteínas, substâncias hidrófilas 5,6 7,8 9 e enzimas. Eles, portanto, servir de instrumentos terapêuticos e diagnósticos clínicos como confiáveis ​​que merecem a sua aprovação para a entrega de medicamentos citotóxicos, como a doxorrubicina para terapia de câncer 4. Devido à sua flexibilidade, os lipossomas podem também ser carregadas com fluorocromos para fins cirúrgicos de diagnóstico e guiada por imagem. Imagens de fluorescência fornece uma relação custo-benefício e não-invasivo em ferramenta de diagnóstico vivo que, no entanto, exige alguns requisitos básicos. Pode ser demonstrado que fluorocromos que se adequar melhor para a imagem in vivo têm absorção característica e máximos de emissão na faixa onde a dispersão de luz e espalhando bem como autofluorescência de tecidos de origem a partir da água e hemoglobina é baixo. Assim, tais sondas têm a sua maxima abs / em entre 650 e 900 nm 10.<html> Além disso, a estabilidade de fluorocromos tanto in vitro como in vivo é crítico, como a opsonização rápida depuração e pode limitar muito a sua aplicação para a imagem in vivo 11. Outros efeitos como a má estabilidade e baixa sensibilidade ou efeitos citotóxicos em órgãos-alvo, como visto com indocianina verde (ICG) 12-16, não são desejadas e devem ser levados em consideração na concepção de sondas para a imagem in vivo. Estas observações conduziram ao desenvolvimento activo de vários fluorocromos NIR pré-clínicos, nanopartículas assim como novas técnicas de imagiologia in vivo de processos inflamatórios, cancro e para cirurgia guiada por imagens 17-20. Apesar de a estabilidade de mais (de fluorescência no infravermelho próximo) NIRF pré corantes in vitro, a sua perfusão rápida depuração e através do fígado e do rim impedir a sua utilização na imagiologia óptica in vivo de doenças e processos inflamatórios. ntent &quot;&gt; Por isso, apresentam um protocolo para a encapsulação de fluorocromos tais como o bem caracterizado no infravermelho próximo corante fluorescente DY-676-COOH, conhecida pela sua tendência para a auto-arrefecimento rápido em concentrações relativamente elevadas 21 em lipossomas. A altas concentrações de H- a formação de dímeros e / ou interações entre as moléculas de fluoróforo localizados dentro resultado do outro raio Förster em Förster transferência de energia de ressonância (FRET) entre as moléculas de fluorocromo. Em baixas concentrações no espaço entre as moléculas de fluoróforo aumenta, impedindo assim a interacção de empilhamento de pi-empilhamento pi formação e resultando na emissão de fluorescência elevada H-dímero. O interruptor de entre alta e baixa concentração e a extinção da fluorescência de acompanhamento e de activação é uma estratégia promissora, que pode ser explorada para a imagiologia óptica 22. A este respeito, a encapsulação de concentrações elevadas de corante NIRF DY-676-COOH no interior aquosa de lipossomas é mais fafavorá- para geração de imagens in vivo do que o corante livre. O desafio do método situa-se em primeiro lugar no encapsulamento correcta e em segundo lugar, na validação dos benefícios resultantes de elevadas concentrações de encapsulação do corante. Comparando as propriedades de imagem de lipossomas desactivada com o do corante livre e também com uma formulação de lipossomas não-temperada com baixas concentrações do corante é indispensável. Mostramos por um protocolo de hidratação do filme e extrusão simples, mas altamente eficaz combinado com congelamento e descongelamento ciclos alternados que o encapsulamento das concentrações de extinção de DY-676-COOH em lipossomas é viável. Outros métodos utilizados para preparar lipossomas, tais como o método de evaporação de fase inversa 23 bem como o método de injecção de etanol 24 permitir a preparação dos lipossomas com elevadas eficiências de encapsulação para muitas substâncias hidrófilas. No entanto, a natureza da substância a ser encapsulada pode influenciar a eficiência de encapsulação. Com efeito,o protocolo de hidratação do filme e extrusão aqui apresentados revelaram a maior eficiência para o encapsulamento de DY-676-COOH. Para ilustrar os benefícios de encapsulamento lipossomal de DY-676-COOH, um modelo de edema induzido pelo zimosano, que permite o estudo de processos inflamatórios no interior de algumas horas, foi usado. Aqui, demonstra-se que os lipossomas com concentrações elevadas do encapsulado DY-676-COOH são mais adequados para o corpo inteiro em imagiologia óptica vivo de processos inflamatórios do que a do corante livre ou a formulação lipossomal não-temperada com baixas concentrações de corantes. Assim, o protocolo subjacente proporciona um método simples e rápido para a produção de lipossomas fluorescentes temperados e a validação da sua activação e imagiologia potencial tanto in vitro como in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:267px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Materials and equipments for preparation of liposomes</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">egg phospahtidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880120P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:309px;">1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810145P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)</td>
			<td>Sartorius AG</td>
			<td>Research RC 210 P</td>
			<td>used for weighing the phospholipids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Rotavapor</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>R-114</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Waterbath</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>R-481</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Vacuum Controller</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>B-720</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Vacobox</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>B-177</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Circulation Chiller</td>
			<td style="width:179px;">LAUDA DR. R. WOBSER 
			GMBH &#38; CO. KG</td>
			<td>WKL 230</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DY-676-COOH</td>
			<td>Dyomics GmbH</td>
			<td>676-00</td>
			<td>Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1086</td>
			<td>buffer 10 mM, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichlormethan</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>Y015.2</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicator</td>
			<td>Merck Eurolab GmbH</td>
			<td>USR 170 H</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)</td>
			<td>Scientific Industries Inc.</td>
			<td>SI-0256</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sephadex G25 medium&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Europe GmbH</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td>used for liposome purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X100</td>
			<td>Ferak Berlin GmbH</td>
			<td>505002</td>
			<td>used to destruct liposomes&#160; for dye quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LiposoFast-Basic</td>
			<td>Avestin Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the extrusion of liposomes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluostar Optima</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for dye quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the determination of liposome size and zetapotential</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Beckmann Coulter GmbH</td>
			<td style="width:119px;">XL 80</td>
			<td>used for concentration of the samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Rotor</td>
			<td style="width:179px;">Beckmann Coulter GmbH</td>
			<td style="width:119px;">SW 55 TI</td>
			<td>used for concentration of the samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:309px;">Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z4250-250MG</td>
			<td>used for induction of inflammation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isotonic Saline (0.9)</td>
			<td style="width:179px;">Fresenius GmbH</td>
			<td style="width:119px;">PZN-2159621</td>
			<td>used for the dilution of Zymosan-A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Ohmeda Isotec 4</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for anesthesizing animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isoflurane</td>
			<td>Actavis GmbH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PZN-7253744</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Mat Pro 20 W</td>
			<td style="width:179px;">Lucky Reptile</td>
			<td style="width:119px;">61202-HTP-20</td>
			<td>used to keep animals warm during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Omnican-F (1 ml injection)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">PZN-3115465</td>
			<td>used for subcutaneous and intravenous application of probes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Panthenol eye cream</td>
			<td style="width:179px;">Jenapharm</td>
			<td style="width:119px;">PZN-3524531</td>
			<td>used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Hanks buffered saline solution</td>
			<td style="width:179px;">PAA Laboratories /Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">L2045</td>
			<td>w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">8-Well chamber slides</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354108</td>
			<td>used for cell culture followed by microscopy&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Cell culture flasks</td>
			<td style="width:179px;">Greiner BioOne</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture media</td>
			<td colspan="2">Gibco (life technologies GmbH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal calf serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-Lysine solution (0,01% - 50&#160;ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4832</td>
			<td>used to coat cell culture chamber slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mountant Permafluor</td>
			<td>ThermoScientific&#160;</td>
			<td>S21022-3</td>
			<td>Mounting solution for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hoechst-33258</td>
			<td style="width:179px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA stain for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hera-Safe</td>
			<td>Heraeus Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile work bench used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HERA cell</td>
			<td>Heraeus Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Incubator used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">LSM510-Meta</td>
			<td style="width:179px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system</td>
			<td style="width:179px;">CRi, Woburn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for whole body fluorescence imaging of small animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV)</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for measurement of absorption</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)</td>
			<td style="width:179px;">Jasco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for measurement of fluorescence emission</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Animals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NMRI mice (8-12 weeks old, male)</td>
			<td style="width:179px;">Elevage Janvier, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for inflammation trials</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-quenching of a liposomal-encapsulated near-infrared fluorophore as a tool for in vivo optical imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

A encapsulação de concentrações elevadas de corantes fluorescentes, tais como o corante NIRF DY676-COOH utilizado aqui no interior aquoso dos lipossomas leva a um elevado nível de extinção de fluorescência. Supressão de fluorescência, um fenômeno visto com muitos fluorophores em alta concentração, pode ser explorada em vários em aplicações de imagem in vivo, onde a alta sensibilidade e detecção confiável da área-alvo são exigidas. O uso de lipossomas também fornece protecção do ...

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Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para<em&gt; In Vivo</em&gt; Imageamento óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

fluorescence-quenching-liposomal-encapsulated-near-infrared

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

16.1K visualizações.  Jena University Hospital. The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity. 

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bioengenharia

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

A Cre-Lox Abordagem Recombinação P para Detecção de fusão celular In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Nanopartículas virais para<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Tumor

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

Imagiologia desnaturadas colágeno Vertentes<em&gt; In vivo</em&gt; E<em&gt; Ex vivo</em&gt; Via foto desencadeada Hibridização do Caged Colágeno mimético Peptídeos

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Eliminação celular seletiva de Cultura 3D Mixed usando uma técnica de infravermelho próximo Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

A Síntese de hidrogéis RGD-funcionalizado como uma ferramenta para aplicações terapêuticas

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Targeted Plasma Membrane entrega de um hidrofóbica Carga encapsulado em um cristal líquido nanopartículas Transportador

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

Nanotubos de DNA como uma ferramenta versátil para estudar semiflexível polímeros

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.