The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).

NOTA: Este protocolo pode ser utilizado para várias aplicações, tais como a quantificação de fagocitose e actina de polimerização tal como utilizado no nosso trabalho previamente publicado 12. O protocolo presta-se a uma variedade de modificações, e tipos Tabela 1 apresenta a lista de células e partículas utilizado com sucesso em estudos anteriores. Uso padrão deste protocolo para a quantificação de fagocitose ou actina polimerização é ilustrado no diagrama 1. <img alt="Diagrama 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram1.jpg" width="600" /> Diagrama 1:. Diagrama de ensaio fluorométrico para a quantificação de fagocitose e a polimerização da actina Depois as células são plaqueadas, tratada, e deixou-se aderir, partículas marcadas com fluorescência verde (FITC) são adicionados às células para a fagocitose. A reacção é parada por tripano ou antibilavagem ótica (para eliminar partículas não interiorizado) e a fixação é realizada com 4% paraformaldeído. As células são posteriormente corados com etiqueta vermelha fluorescente actina (rhodamine phalloidin) e etiqueta fluorescente azul (DAPI). Os índices de fagocitose e a polimerização da actina são quantificadas como uma proporção de unidades de fluorescência relativa de verde / azul (FITC / DAPI) ou azul (rodamina / DAPI) fluorescência / vermelho. 1. chapeamento e tratamento de células NOTA: Antes de começar, execute os tratamentos com pelo menos 4 repetições técnicos, e incluem os seguintes controles no layout da placa: apenas células (imaculada, com DAPI sozinho ou rhodamine sozinho) e de partículas só. <ol><li> Conduzir todo adição de reagentes nos passos 1-4 em uma capa de cultura de células estéril, a fim de proteger as amostras de contaminação. </li><li> Placa de macrófagos (linha de células de murino J774) em uma placa de 96 cavidades, com 1-5 x 10 células em 4 ul (50 por poço)<html> suplementado meios de pré-aquecido. Pratos ideais para este método são negros placas de 96 poços com fundos transparentes ou pretos, consoante as capacidades de leitor. <ol><li> Por meio suplementado, utilizar 10% de FBS inactivado pelo calor a fim de evitar a interferência da cascata do complemento, e 1% de penicilina / estreptomicina (se não utilizar bactérias vivas para fagocitose). Se se trabalha com células aderentes permitir 1-2 h, para aderência, e para as células não aderentes, girar para baixo a placa com as células durante 10 min a 500 x g. </li></ol></li><li> Adicionar desejados agonistas / antagonistas ou controlo de veículo a uma concentração 2x (ressuspensas em PBS ou, mais preferivelmente, em meio suplementado) em 50 ul, para um volume final de 100 ul (1x) e incubar durante um período de tempo desejado. Pipeta multicanal e de reagente reservatórios irá facilitar o processamento mais rápido. </li></ol> 2. Opsonização de partículas fluorescentes ftp_upload / 52195 / 52195table1.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Tabela 1: Testado tipos de células e partículas fluorescentes em análise fluorométrico de fagocitose e a polimerização da actina Tabela 1 ilustra combinações de tipos de células (linhagens de células, e as células primárias) que o nosso grupo utilizados através do método fluorométrico.. Excepto olhando para a fagocitose e a polimerização da actina por células do tipo selvagem, que também têm utilizado algumas dessas partículas para exame de fagocitose por células transfectadas que expressam um GFP (proteína fluorescente verde). A fluorescência das células transfectadas com plasmídeos contendo repórteres fluorescentes também pode ser utilizado como um marcador celular, além de DAPI individualidades Tabela:. A - a polimerização da actina; P - fagocitose; PT - a fagocitose por células transfectadas GFP marcado; OPDex - opsonizado talão dextrano; HKOP - calor matou opsonizado. <ol><li> Certifique-se de que as partículas fluorescentes e etiquetas são protegidos da luz em todos os momentos, during processamento, lavar roupa, bem como durante a incubação, a fim de evitar a fotodegradação <ol><li> Para partículas secas, pesar mortos opsonizadas (HKOP) bactérias calor fluorescente (E2861: E. coli K-12 estirpe), por meio de especificações do fabricante. Tome cuidado para se certificar de que as contas de massa para 10: 1 - 20: 1 bactérias: índice de célula (ou, pelo menos, uma proporção de 10: 1 - comumente usado na quantificação de fagocitose) 13,14. Número de partículas pode ser fornecida pelo fabricante ou determinados através couting diluições em série da solução de reserva de 1 mg / ml. </li><li> Ressuspender em 50 ul de PBS e em vórtice durante 1 minuto, a configuração mais elevada. Assegurar vórtex adequada (aqui e em todo o protocolo) que as partículas tendem a agregar o que pode afectar a eficácia de opsonização. </li><li> Para as partículas em suspensão tais como pérolas de dextrano marcados com fluorescência (esferas DEX), a solução estoque de vórtice durante 1 minuto, duração de 50 ul de suspensão ou, dependendo da concentração do volume do grânulo determine monte de contas para facilitar a 10: 1 talão: índice de célula. </li></ol></li><li> Adicionar um volume igual de reagente de opsonização de partículas e vortex vigorosamente por mais um minuto. </li><li> Incubam-se as partículas com opsonizantes reagente a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Após a incubação, as partículas centrifugar durante 5 minutos a 500 xg, e remover o sobrenadante contendo excesso de reagente opsonizante. Lavam-se as partículas através da adição de 100 ul de PBS, vortex para ressuspender o sedimento, e centrifugado durante 5 min a 500 x g. <ol><li> Repita essas etapas duas vezes para assegurar opsonization adequada e remoção do anticorpo não ligado. </li></ol></li><li> Preparar a solução de trabalho de partículas opsonizadas por ressuspensão em 5 ml de meio (suficiente para uma placa de 96 poços) e armazenar até ao abrigo da luz adição às células. </li></ol> 3. A fagocitose <ol><li> Coloque a solução de trabalho de partículas em um recipiente de reagente estéril. A partir daqui, adicionar 5056; l de partículas opsonizadas para as células preparadas na etapa 1 (para uma concentração final de 50 ng / ml) e permitir que a fagocitose ocorrer em condições de cultura de células padrão. São apresentados abaixo dois métodos de fagocitose que podem ser avaliadas através deste método (Esquema 2). </li></ol><img alt="Diagrama 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram2.jpg" width="600" /> Diagrama 2:. Comparação de fagocitose contínua versus fagocitose sincronizar contínua indica interiorização contínua de partículas ao longo do tempo à medida que lentamente atingir as células no fundo do poço. Um passo de sincronização contrastante (centrifugação) força as partículas de afundar para o fundo, aumentando o contacto de partícula com a célula, e que conduz à internalização imediato pelas células. Fagocitose sincronizado é um processo mais rápido que internaliza mais rapidamente parteicles devido ao aumento da célula: o contato de partículas. <ol><li><ol><li> Para o método de fagocitose contínua (Diagrama 2) que permitem que as células de fagocitar bactérias opsonizados continuamente à medida que lentamente afundam para o fundo e entrar em contacto com as células, utiliza intervalos de tempo mais longos para permitir que as bactérias para atingir o fundo do poço e em contato com as células. Se a realização de uma experiência timecourse, adicionar bactérias em intervalos de tempo diferentes e parar a totalidade da placa de reacções ao mesmo tempo para aumentar a velocidade de processamento. </li><li> Para o método sincronizado fagocitose (Diagrama 2) que aumenta a partícula: o contacto de células através de centrifugação, rotação para baixo toda a placa contendo as células e partículas (5 min a 500 xg), logo que as partículas são adicionadas, para facilitar a sincronização de todos os pontos de tempo e para acelerar a partícula: interação célula. <ol><li> Medir o curso de tempo começando logo após a conclusão do centripasso fugation. Se a realização de uma experiência ao longo do tempo, parar cada ponto de tempo, independentemente, em diferentes intervalos de tempo, como descrito abaixo. </li></ol></li></ol></li></ol> NOTA: O método fagocitose sincronizado é um pouco mais trabalhoso do anterior, mas fornece o índice fagocitário maior em menos tempo. 4. A fagocitose Parando <ol><li> Para as células aderentes, remover o sobrenadante e adicionar 50 ul de azul de tripano diluída com PBS (diluição 1: 2), a fim de extinguir a fluorescência das bactérias não-internalizado. </li><li> No caso de células não-aderentes, girar para baixo a placa e remover o sobrenadante. Adicionar 50 ul de azul de tripano diluída. Assegurar a centrifugar a placa a (5-10 minutos a 500 xg) entre cada lavagem, a fim de minimizar a perda de células e permitir a lavagem adequada. </li><li> Após a incubação de tripano, lavar as células duas vezes com PBS, para remover qualquer resíduo de tripano (até o PBS removido do poço ficar transparente). Trypan foi mostrado para extinguir a fluorescência de 15,16 não internalizados marcado por fluorescência, mortas pelo calor, partículas de bactérias, mas não para as bactérias vivas ou grânulos OPDex. Para as bactérias vivos, incluem uma lavagem com antibióticos, como a penicilina, estreptomicina, gentamicina ou em vez da lavagem de tripano para evitar efeitos de confusão de fluorescência de partículas não-internalizado. </li><li> Fixar as células com 100 uL de paraformaldeído a 4%, e incubar durante 15 min à temperatura ambiente, em seguida lava-se com PBS (em 100 ul por poço para cada lavagem). Neste passo, salvar as células a 4 ° C durante até uma semana, ou prosseguir directamente para a coloração e quantificação. NOTA: Todos os passos subsequentes formar este ponto prefácio pode ser feito fora da capa de cultura de células. </li><li> Remover todo o líquido e adicionar 50 ul de DAPI a 5 ng / ml reconstituídos em PBS. Permitir 5 min para a coloração, e depois lave duas vezes com PBS. Após o passo de lavagem, adicionar 50 ul de PBS a cada poço e ficha fagocitose. </lEu&gt; </ol> 5. Actin Coloração NOTA: Para além da fagocitose, método fluorométrico irá permitir a quantificação de a polimerização da actina, medindo a intensidade de actina, que é reduzida durante a inibição da lamelipï¿½ios, pseudopodiae, e enrugamento da membrana, como resultado de tratamento com um inibidor (Figura 1A). Este é um passo opcional se interessado na quantificação da polimerização de actina em adição à fagocitose. Se a polimerização de actina é o objetivo final, utilizando partículas fluorescentes para a fagocitose é opcional. <ol><li> A seguir à fixação paraformaldeído (passo 4.3), lavar a placa duas vezes com PBS a 100 ul por poço para cada lavagem. Adicionar 50 ul de 0,1% de Triton X-100 em PBS durante a permeabilização e incubar durante -5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lave a 0,1% de Triton X-100 a 2 vezes com PBS (como acima), e bloquear com 1% de albumina de soro bovino (BSA) durante 20 minutos para evitar a ligação não específica do label. </li><li> Após o bloqueio, retire a solução BSA e adicione imediatamente rhodamine phalloidin. Para preparar a solução de trabalho de rodamina mancha, utilizar 100 ul de solução metanóico (fornecido pelo fabricante) em 5 ml de PBS (suficiente para uma placa). A partir da solução de trabalho adicionar 50 ul por cavidade e incubar durante 20 min à temperatura ambiente. NOTA: Seguindo os passos de lavagem e coloração DAPI como no passo 4.4 células estará pronto para a quantificação. </li></ol> 6. Quantificação <ol><li> Para quantificar a fagocitose usando um leitor de placas fluorescentes, ficha fluorescência verde usando filtro de excitação em λ = 488 nm e filtro de emissão de fluorescência em λ = 518 nm, e azul com filtro de excitação em λ = 355 nm e filtro de emissão em λ = 460 nm. </li><li> Para quantificar a polimerização de actina utilizando um leitor de placas fluorescentes, ficha azul fluorescência via λ = 355 nm e λ = 460 nm (como acima), e vermelho gripeorescence através de filtro de excitação a λ = 584 nm e filtro de emissão λ = 620 nm. NOTA: Orbital ou central de detecção é aceitável para a gravação. Alguns tipos de células para recolher mais a borda do poço do centro da cidade, caso em que a gravação orbital pode ser vantajosa. Em particular, a média de três pontos em torno da órbita também poderia ser usado para obter resultados mais precisos. </li><li> Dividir a RFU total de fluorescência verde ou vermelha por azul de leitura de fluorescência (a partir de DAPI), dependendo da etiqueta partícula ou fagocítica vs quantificação actina (Diagrama 1). Devido à alta variância placa-to-plate, use índices relativos (como em relação a T = 0 controle), para melhor ilustrar as tendências observadas e para facilitar a análise estatística mais confiável. </li></ol>

<ol>
	<li>Murphy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology. , (2012).</li><li>Burke, D. W., O'Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromotion+of+cemented+and+uncemented+femoral+components.">Micromotion of cemented and uncemented femoral components.</a> The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).</li><li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+malaria+by+enhanced+phagocytosis+of+erythrocytes+in+LMP7-deficient+mice.">Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice.</a> PloS One. 8 (3), 59633 (2013).</li><li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes.">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PloS One. 7 (3), 32621 (2012).</li><li>Al-Bader, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+trehalose+biosynthesis+in+Aspergillus+fumigatus+development,+stress+response,+and+virulence.">Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence.</a> Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).</li><li>Acosta-Iborra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+oxygen+sensing+modulates+antigen+presentation+and+phagocytic+functions+involving+IFN-gamma+production+through+the+HIF-1+alpha+transcription+factor.">Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor.</a> Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).</li><li>Ojielo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+phagocytosis+and+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+lung+following+bone+marrow+transplantation.">Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation.</a> Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).</li><li>Neu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14-dependent+monocyte+isolation+enhances+phagocytosis+of+listeria+monocytogenes+by+proinflammatory,+GM-CSF-derived+macrophages.">CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages.</a> PloS One. 8 (6), 66898 (2013).</li><li>Sokolovska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+caspase-1+by+the+NLRP3+inflammasome+regulates+the+NADPH+oxidase+NOX2+to+control+phagosome+function.">Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function.</a> Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).</li><li>Janko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRP/anti-CRP+antibodies+assembly+on+the+surfaces+of+cell+remnants+switches+their+phagocytic+clearance+toward+inflammation.">CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 2 (2), 70 (2011).</li><li>Clatworthy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus-associated+defects+in+the+inhibitory+receptor+FcgammaRIIb+reduce+susceptibility+to+malaria.">Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).</li><li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+decreases+bacterial+phagocytosis+by+inhibiting+actin+polymerization+through+cAMP-,+Rac-1-,+and+p38+MAPK-dependent+mechanisms.">Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms.</a> The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).</li><li>Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemophagocytic+macrophages+harbor+Salmonella+enterica+during+persistent+infection.">Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 3 (12), 193 (2007).</li><li>Xue, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+gene+transfer+and+expression+in+cord+blood-derived+CD34++hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+by+a+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposon+system.">Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system.</a> Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).</li><li>Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+distinguishing+ingested+from+adhering+particles.+Methods+in+Enzymology.">Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology.</a> 132. , 198-204 (1986).</li><li>Scott, A. J., Woods, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+internalization+of+Histoplasma+capsulatum+by+mammalian+cell+lines+using+a+fluorometric+microplate+assay.">Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay.</a> Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

As principais limitações da técnica são fluorométrico de variação experimental, bem como a perda de células associadas com a lavagem e a utilização de células não-aderentes extensa. A variação é observada em grande parte devido à variação em partículas fluorescentes como pesagem e pipetagem durante a preparação da solução não é uma maneira exata de manutenção de números idênticos de partículas de experiência para experiência. Para resolver o problema da varia?...

Quantificação do sinal fluorescente tem sido amplamente utilizado em uma infinidade de métodos científicos que vão de PCR, citometria de fluxo, microscopia confocal, e se aflige análise multiplex ELISA. Imagens de fluorescência e quantificação tem uma ampla aplicação e pode ser uma ótima ferramenta para análise quantitativa de vários processos celulares. A utilização de marcadores fluorescentes e o seu sinal foi revolucionada na última década, e aparecimento de leitores de placas fluorescentes facilitou a elevada taxa de transferência de quantificação de fluorescência emitida durante processos celulares. Análise Fluorometric pode servir como uma grande ferramenta na quantificação de fagocitose. A fagocitose tem sido estudada desde a descoberta dos fagócitos por Metchnikoff em 1800 1. Ao longo dos anos, uma grande variedade de métodos têm sido utilizados para examinar este processo importante essenciais para a defesa imune inata contra a invasão bacteriana, virai, fúngica e parasitas patogénicos 2-5. Os métodos anteriores de microscopia de quantificação utilizados e técnicas de estereologia, a fim de visualizar as células que são fagocitando, que foram, então, quantificada por contagem de partículas internalizadas (manualmente ou com o uso de software) 6-8. Algumas desvantagens de usar microscopia sozinho para análise quantitativa são de que a contagem manual de bactérias é um trabalho intensivo e mais propenso a viés do observador. Outro método utilizado na quantificação da fagocitose é a técnica microbiológica de chapeamento de bactérias a partir de lisados ​​celulares (após fagocitose) em placas de cultura de bactérias, mas este método pode não têm em conta os mecanismos de bactericidas e presença de bactérias parcialmente internalizados. Este método é ainda mais trabalhosa em comparação com microscopia e demora vários dias a analisar. A citometria de fluxo parece ser a forma mais rápida e mais eficaz para quantificar a fagocitose e tem sido utilizado por vários grupos de 9-11, mas o custo elevado comumente associada com o nostrument necessários para a análise faz com que seja o método mais caros quando comparados com os ensaios mencionados anteriormente. O método fluorometric é uma boa alternativa para a citometria de fluxo para análise de partículas internalização uma vez que oferece quantificação imparcial de fluorescência usando equipamento que não é tão custo proibitivo. Outros benefícios adicionais de fluorometria são de alta eficiência, e recursos de alto rendimento para quantificar fluorescência emitida pelas partículas internalizados marcados. Benefícios de fluorometria pode ser extrapolada para a quantificação de outros processos de fagocitose. Por exemplo, a análise fluorométrico pode ser aplicada ao estudo de qualquer processo que conduza a alterações na expressão intracelular ou de receptores ligados a membranas, as alterações na permeabilidade celular / viabilidade, a eficácia de transfecção, e modulação em polimerização da actina. Uma desvantagem da técnica fluorométrico é que, dependendo das etiquetas utilizadas, pode haver um elevadoexperiência para experiência variabilidade que normalmente pode ser resolvido através da demonstração de dados por meio de quantificação relativa, como a mudança vezes ou por cento de aumento do controle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="820">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:131px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:315px;">1-&#956;m yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">F8852</td>
			<td style="width:255px;">combine 50&#956;l with 50&#956;l opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;">Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">E2861</td>
			<td style="width:255px;">reconstitute (5 mg) in 50&#956;l of PBS and combine with 50&#956;l opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Opsonizing reagent</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">E2870</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Rhodamine phalloidin</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">R415</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:315px;">RPMI Cell growth media&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fluorescent plate reader-Fluostar Omega</td>
			<td style="width:131px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td style="width:131px;">Fischer Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td style="width:255px;">dilute to 4% before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">96 well plates</td>
			<td style="width:131px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">655097</td>
			<td style="width:255px;">clear or black or clear bottom - black plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Multichannel pipette (8-12 channels)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Reagent reservoirs</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1x PBS</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microfuge tubes (0.6 ml)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">&#160;Conicles (10 ml)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization

O objectivo da análise fluorométrico é para servir como um custo eficaz, eficiente método de transferência, a análise de alta fagocitose e outros processos celulares. Esta técnica pode ser usada em uma variedade de tipos de células, tanto aderentes e não aderentes, para analisar uma variedade de propriedades celulares. Ao estudar a fagocitose, a técnica utiliza fluorométrico tipos de células fagocíticas, tais como macrófagos, e partículas opsonizadas marcados com fluorescência cuja fluorescência pode ser extinto na presença de azul de tripano. Após plaqueamento de macrófagos aderentes em placas de 96 poços, as partículas fluorescentes (verde ou vermelha) são administrados e células são deixadas a fagocitose por montantes variados de tempo. Após internalização de partículas fluorescentes, as células são lavadas com azul de tripano, a qual facilita a extinção do sinal de fluorescência a partir de bactérias que não são internalizadas, ou são apenas aderem à superfície da célula. Após a lavagem de tripano, as células são lavadas com PBS, fixadas, umand coradas com DAPI (marcador fluorescente azul nuclear), que serve para etiquetar os núcleos de células. Por uma quantificação fluorometric simples através de leitura de placas de nuclear (azul) ou partícula (verde / azul) fluorescência podemos examinar a proporção de unidades de fluorescência relativa de verde: azul e determinar um índice fagocitário indicativo de quantidade de bactérias fluorescentes internalizadas por célula. A duração do ensaio utilizando um método e multicanal 96 poços pipetas para a lavagem, a partir da extremidade de fagocitose ao fim de aquisição de dados, é inferior a 45 min. A citometria de fluxo pode ser usado de uma maneira semelhante mas a vantagem de fluorometria é o seu elevado rendimento, o método de avaliação rápida com o mínimo de manipulação de amostras rápida e quantificação da intensidade de fluorescência por célula. Estratégias similares podem ser aplicados para as células não aderentes, as bactérias marcadas vivo, a polimerização da actina, e essencialmente qualquer processo utilizando fluorescência. Portanto, fluorometria é um método promissor para o seu baixo custo, alta throughpcapacidades ut no estudo de processos celulares.

Duas formas principais de quantificar a fagocitose e a subsequente polimerização da actina, através da utilização deste protocolo é de observar fagocitose contínua ou sincronizada. A análise microscópica (Figura 1B) ilustra imagens fluorescentes comparáveis ​​ao que o fluorometer está gravando (veja também o Diagrama 1). Na Figura 1B são fluorescência vermelha de actina, verde 268 fluorescência de FITC etiquetas HKOP E...

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High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.5K visualizações.  University of Minnesota. Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Imunologia e Infecção

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Macrófago Colesterol Exaustão e seu efeito sobre a fagocitose de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

Bioquímico celular-free fluorométrica ensaio enzimático para medição do elevado-throughput de peroxidação lipídica em lipoproteína de alta densidade

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

Usando avançada proteína de fluorescência verde-expressando Escherichia Coli para avaliar a fagocitose de macrófagos peritoneais de Mouse

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

Alto Throughput em Vitro avaliação de latência invertendo agentes na transcrição de HIV e de emenda

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the removal of dead cells or foreign particles, and in the resolution of inflammatory responses and tissue remodeling, processes that are mediated by various surface receptors of the AMs. Here, we report methods for the analysis of the phagocytic function of AMs using in vitro and in vivo assays and experimental strategies to differentiate between the pattern recognition receptor-, complement receptor-, and Fc gamma receptor-mediated phagocytosis. Finally, we discuss a method to establish and characterize a P. aeruginosa pneumonia model in mice to assess bacterial clearance in vivo. These assays represent the most common methods to evaluate AM functions and can also be used to study macrophage function and bacterial clearance in other organs.

Here we report common methods to analyze the phagocytic function of murine alveolar macrophages and bacterial clearance from the lung. These methods study in vitro phagocytosis of fluorescein isothiocyanate beads and in vivo phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. We also describe a method for clearing P. aeruginosa in mice.

Fagocitose de macrófagos alveolares e apuramento de bactérias em ratos

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce pulmonary inflammation, but little is known regarding how exposure alters processes important to the resolution of inflammation. Efferocytosis is a resolution process, whereby macrophages phagocytize apoptotic cells. The purpose of this protocol is to measure alveolar macrophage efferocytosis following O3-induced lung injury and inflammation. Several methods have been described for measuring efferocytosis; however, most require ex vivo manipulations. Described in detail here is a protocol to measure in vivo alveolar macrophage efferocytosis 24 h after O3 exposure, which avoids ex vivo manipulation of macrophages and serves as a simple technique that can be used to accurately represent perturbations in this resolution process. The protocol is a technically non-intensive and relatively inexpensive method that involves whole-body O3 inhalation followed by oropharyngeal aspiration of apoptotic cells (i.e., Jurkat T cells) while under general anesthesia. Alveolar macrophage efferocytosis is then measured by light microscopy evaluation of macrophages collected from bronchoalveolar (BAL) lavage. Efferocytosis is finally measured by calculating an efferocytic index. Collectively, the outlined methods quantify efferocytic activity in the lung in vivo while also serving to analyze the negative health effects of O3 or other inhaled insults.

This manuscript describes a protocol for determining whether exposure to ozone, a criteria air pollutant, impairs alveolar macrophage efferocytosis in vivo. This protocol utilizes commonly used reagents and techniques and can be adapted to multiple models of pulmonary injury to determine effects on alveolar macrophage efferocytosis.

In vivo avaliação da Efferocitose de macrófago alveolar após exposição ao ozônio

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.