O objetivo geral deste ensaio é preparar macrófagos e glóbulos vermelhos opssonizados para a visualização da Faagocytose por microscopia de lapso de tempo tridimensional. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da imunologia, como como os fagocitos capturam e ingerem partículas. Esta técnica permite a visualização da absorção de partículas em tempo real, ao contrário de ensaios mais tradicionais de ponto final que só permitem a avaliação de se, mas não como, uma partícula foi ingerida.
Geralmente, indivíduos novos nesse método podem lutar até se acostumarem com os procedimentos de isolamento celular. Primeiro tivemos a ideia desse método quando percebemos as vantagens de girar esta microscopia confocal para imagens de lapso de tempo 3D de Faagocytose. Para isolar macrófagos peritoneais, coloque um cateter plástico de 24 bitola no peritônio de um rato de três a quatro meses de idade, e use uma seringa de cinco mililitros de plástico para lavar a cavidade duas vezes com 4,5 mililitros de HBSS gelado sem cálcio e magnésio por lava.
Transferindo a suspensão aspirada para um tubo inferior redondo de polipropileno de 14 mililitros à medida que é coletado. Quando ambas as amostras foram colhidas, centrifugar o aspirado e resuspensar as células peritoneais em um mililitro de biocarbonato completo livre RPMI 1640 médio para alcançar cerca de seis vezes 10 a sexta células por concentração de mililitro. Em seguida, para pré-encher slides adicione um mililitro de hepes completo complementado médio a um reservatório de um slide de canal revestido de fibronectina, e incline o slide para permitir que o meio seja aspirado do reservatório a jusante.
Para remover bolhas de ar indesejadas, adicione um a dois mililitros de meio fresco a um dos dois reservatórios, e aplique firmemente uma tampa de reservatório. Em seguida, aplique pressão rítmica do polegar na tampa para bombear qualquer ar para fora do slide, inclinando o slide conforme necessário. Quando todo o ar for expelido, incline o deslizamento em direção ao reservatório contendo meio sem tampa e remova a tampa para evitar que o ar seja sugado de volta para o canal.
Agora pipete a solução celular algumas vezes para reduzir a aglomeração, e adicionar 100 microliters das células em um canal do slide para uma incubação de duas horas em uma câmara úmida a 37 graus celsius na ausência de dióxido de carbono. No final da incubação substitua o HEPES contendo meio em cada slide por meio completo de bicarbonato suplementado como apenas demonstrado. Em seguida, coloque as células em uma incubadora úmida de 37 graus celsius com 5% de dióxido de carbono para sua cultura noturna.
Na manhã seguinte, transfira um mililitro de sangue doador saudável recém-obtido em um tubo de microcentrifuge de fundo redondo de dois mililitros. Em seguida, centrifugar a amostra. Remova o plasma e o casaco buffy contendo supernaspeuta.
E transfira cuidadosamente 100 microliters dos glóbulos vermelhos sedimentados em um tubo mircocentrifuge de dois mililitros contendo 100 microliters de meio completo suplementado hepes. Rotule o tubo 1:1 e transfira quatro microlitadores dos glóbulos vermelhos diluídos em um novo tubo de microcentrífuga de dois mililitros contendo dois mililitros de meio completo suplementado hepes. Em seguida, rotule este tubo 4:2000 e coloque ambos tubos de amostra de glóbulos vermelhos diluídos no gelo.
Para rotular os macrófagos peritoneal substituem o meio bicarbonato em cada lâmina de canal por meios completos complementados com HEPES. Em seguida, incline o slide para permitir que 100 microliters do anticorpo específico do macrófago do rato marcado fluorescentemente sejam adicionados em termos de queda à abertura do canal de 100 microlitres do slide. Aspire o meio que flui para o reservatório a jusante, e incuba as células por 20 minutos em uma câmara úmida a 37 graus celsius na ausência de dióxido de carbono.
Enquanto as células peritoneais estão sendo rotuladas suavemente misturam 4:2000 glóbulos vermelhos e transferem 400 microliters das células para um novo tubo de microcentrífuga de dois mililitros, em um bloco de alumínio aquecido dentro de um capô de fluxo laminar por cerca de cinco a oito minutos. Quando as células tiverem aquecido a 37 graus celsius misture 0,4 microliters de uma mancha de membrana de plasma fluorescente vermelha apropriada com as células. Em seguida, coloque as células de volta no bloco de calor.
Após cinco minutos lave as células adicionando 1,6 mililitros de HEPES fresco suplementado meio completo e centrífuga. Gire o tubo para identificar a pelota de glóbulos vermelhos. Usando uma ponta de pipeta de um a 1,5 mililitro, remova cuidadosamente o supernascer em dois volumes sem perturbar a pelota e misture 2000 microliters de HEPES fresco suplementado meio completo com as células.
Centrifugar e suspender a pelota em 400 microliters de médio. Em seguida, rotule o TPM do tubo para mancha de membrana de plasma. No final da incubação de rotulagem de células peritoneal de 20 minutos, lave o slide com um mililitro de meio hepes completo fresco.
Para opsonizar os glóbulos vermelhos adicione um microliter de camundongos IGG2B monoclonal anti humano anticorpo CD235A ao tubo de amostra de TPM. Após oito minutos a 37 graus celsius com a mistura uma vez por minuto, transfira 100 microliters da membrana plasmática manchada IGG operou glóbulos vermelhos humanos para o macrófago peritoneal contendo slide de canal. Assim que os glóbulos vermelhos humanos tiverem sido adicionados, monte o slide em um microscópio confocal de disco giratório.
Com a incubadora de estágio situada a 37 graus celsius e imediatamente comece a fotografar as células. A imagem 3D de macrófagos fluorescentes verdes apresentados com glóbulos vermelhos vermelhos fluorescentes vermelhos fluorescentes permite a visualização de eventos fagocíticos de partículas únicas. Por exemplo, a captura de um rato IGG opsonized glóbulo vermelho humano por um filopodium macrófago pode ser observada.
Assim como o esprememento de um glóbulo vermelho humano durante a formação de copos fagocíticos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar macrófagos peritoneal residentes em camundongos, células fluorescentes rotuladas e partículas opssonizadas.
