The authors would like to acknowledge the effort of Sandro Lucchinetti (Schenkung Dapples, Z&#252;rich) for constructing the devices needed to guarantee progress in sample preparation.

1. técnicas de amostragem <ol><li> Amostragem Núcleo <ol><li> Para árvore amostragem caules, extrair pelo menos dois núcleos usando um corer incremento de cada haste para analisar o seu desenvolvimento crescimento. Varie a posição de amostragem sobre a tarefa de investigação, por exemplo, para as reconstruções climáticas comuns tomar a núcleos paralela à inclinação. Ao trabalhar com espécies tropicais, tome pelo menos três ou mais núcleos. </li><li> Usar uma sonda incremento afiada (5, 10 ou 12 mm de diâmetro) e colocar a sonda perpendicular ao eixo de crescimento do caule. NOTA: Para ter uma posição controlada e estável do corer, use um empurrador para evitar movimentos da corer diferente da sua rotação ao perfurar-lo na árvore. Perfuram a haste todo o caminho para dentro e através da medula. Para núcleo de madeira muito densa (ou seja, espécies tropicais), usam corpos especiais de motosserra reconfigurado com um adaptador de núcleos de incremento que permitem até mesmo núcleo denso bosque como Diospyrus ebenum (Ebony). &lt;/ Li&gt; <li> Usar um extractor e remover o núcleo resultante da árvore. Desenforme a corer e removê-lo a partir do tronco. </li><li> Adicionar uma identificação específica para o núcleo extraído usando um lápis macio por escrito numa fita, o qual é então colocado directamente sobre o núcleo. Repetir o procedimento no lado oposto da haste. </li><li> Guarde as duas amostras da árvore em tubos de plástico ou de papel ou caixas especiais para evitar qualquer dano. NOTA: canudos de papel são benéfico, especialmente em ambientes tropicais, pois evitam que os núcleos de moldagem. </li><li> Finalmente, montar os núcleos (direção das fibras verticais) sobre vigas de suporte de madeira. Use cola de madeira resistente à água fria e deixe-os secar. NOTA: Nunca montar os núcleos em suportes de madeira, se o objetivo do estudo inclui análise de densidade mais química, ou isótopo. Para estes fins, corrigir os núcleos em condutas abertas ou um único cartão canelado faced. </li></ol></li><li> Amostragem Micro-core <ol><li> Use um dispositivo de perfuração especialou agulha com uma abertura de 2 mm. Dependendo da espessura da casca utilizar um cinzel para remover uma parte necessária da casca. </li><li> Inserir o dispositivo perpendicular ao eixo crescente na haste, como descrito acima, e usar um martelo para penetrar no xilema da haste de cerca de 2 cm de profundidade. </li><li> Virar a quebra da agulha do núcleo micro resultante no interior da ferramenta e removê-la da haste. Armazene as micro núcleos em frascos de microcentrífuga e rotulá-los. </li></ol></li><li> Amostragem Disc <ol><li> Em casos especiais (e especialmente nos trópicos), por exemplo, quando a amostragem tocos e árvores caídas ou sempre que possível, levar discos (seções transversais perpendiculares ao eixo de crescimento) com uma serra elétrica. Simplesmente rotular os discos e armazená-los até uma análise mais aprofundada. NOTA: Este procedimento de amostragem é mais comumente aplicado para todo o material dry-morto, histórico, arqueológico e sub-fósseis, bem como madeiras muito densas que não permitem o uso de corers incremento. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Preparação de Amostra <ol><li> Lixar discos <ol><li> Coloque os discos em uma máquina de lixamento e moer a superfície usando uma seqüência de abrasivos cada vez mais finas, começando com uma lixa de 80 grit, seguido de 120, 220, 300-grit. Um polimento final com 400 grit é suficiente para a maioria das coníferas. Para madeiras e espécies tropicais, especialmente o uso de lixa grits até 1200 para distinguir os limites dos anéis de crescimento. </li></ol></li><li> Cortar superfícies planas em núcleos <ol><li> Corrigir os núcleos de incremento no suporte núcleo de um micrótomo núcleo recém-desenvolvido que permite cortar superfícies planas em núcleos em toda a sua extensão. NOTA: corrigir a orientação do núcleo dentro do portador para que o sentido das fibras da amostra na vertical, o qual está em ângulo recto com a faca de micrótomo. </li><li> Levante o núcleo até ligeiramente toca a lâmina. Puxar a lâmina, que está fixado na orientação rolamento de esferas ao longo da extensão do núcleo de cuT fora a primeira parte do topo. </li><li> Empurrar para trás a faca atrás do núcleo, levantar o suporte de amostra com o núcleo de cerca de 10 um e repetir o procedimento de corte. Fazer isso até cerca de um terço do diâmetro do núcleo é cortado para baixo, resultando em uma superfície contínua plana. </li></ol></li><li> De se prepararem secções micro por adição de solução de amido de milho. <ol><li> Para a análise de imagem detalhada da estrutura anatômica, corrigir núcleos ou outras amostras separou discos do titular de um micrótomo. Posicionar a lâmina micrótomo, guiado por um rolamento de esferas orientação de um micrótomo trenó recentemente desenvolvida na extremidade superior da amostra e puxar sobre ele. </li><li> Empurrar para trás da lâmina para levantar a amostra em cerca de 20 a 30 um e puxar a lâmina ao longo da amostra novamente. Repetir este procedimento até que uma superfície contínua no topo da amostra é criado. </li><li> Cobrir a superfície resultante com uma solução de amido de milho (10 g de amido de milho, 8 ml de água, e 7 g de 100% glicerol) com uma escova comum. NOTA: Os grãos de amido encher as células abertas da amostra para estabilizar a estrutura para o corte subsequente das secções finas. </li><li> Levantar a amostra por 15 fim, colocar um pincel sobre a superfície da amostra e puxar a lâmina lentamente para a amostra de partida para cortar uma secção fina (inferior a escova). Durante o corte, a secção resultante desliza sobre a lâmina guiada pela escova. </li><li> Quando a seção inteira é cortada, remova a seção micro da lâmina com uma escova e água (para reduzir o atrito) e coloque a seção sobre uma lâmina de vidro para uma maior preparação. Para impedir que a secagem, cobri-los usando uma pequena quantidade de glicerol (33% = uma parte de glicerol a 100% e duas partes de água). </li></ol></li></ol> 3. Preparação MicroSlide <ol><li> Para a seguinte preparação de lâminas permanentes, primeiro lavar o glicerol para longe da secção de micro, com uma pipeta e água. </li><li> Cubra o wet secção com algumas gotas de safranina (1 g de pó de safranina + 100 ml de água) e azul de astra (0,5 g de pó de azul Astra + 2 ml de ácido acético a 100% + 100 ml de água) para distinguir entre lignificado e não lignificado estruturas, mas também para melhorar o contraste para a análise de imagem subsequente. </li><li> Deixe o resto seção por 5 min abrangidos pelo corante e depois lave-a com uma pipeta e água novamente. </li><li> Assim que o corante em excesso é removido, desidratar a secção com pipetas, lavando-as com uma sequência de 75% diluído, 96% e, finalmente, 100% de etanol. </li><li> Utilização pipetas para lavar as amostras sobre a placa de vidro em vez de colocar as amostras num banho de reduzir o tempo de processamento de cerca de dois a três minutos para todo o processo de desidratação. NOTA: A desidratação com etanol impede amostras frágeis de quebrar. </li><li> Em seguida lave a seção com 100% xilol. NOTA: O xileno é cancerígeno e ventilação é obrigatória no laboratório quando usá-lo. Outroprodutos existem substituindo xilol, mas se houver a intenção de armazenar as amostras ao longo de períodos mais longos de tempo (anos, décadas) para uma reanálise potencial, bálsamo do Canadá (passo 3.5.2), é a forma única incorporação que permanece claro, sem mudar de cor ao longo do tempo. Infelizmente bálsamo do Canadá tem de ser utilizado em combinação com xilol. </li><li> Enquanto o xilol transforma leitoso (esbranquiçada), repetir o processo de desidratação, uma vez que não é suficientemente desidratado. </li><li> Assim como o xilol permanece claro, cobrir a secção com uma gota de 100% bálsamo do Canadá e cobri-lo com uma tampa de vidro de, pelo menos, o tamanho da secção. NOTA: Lembre-se de retirar as bolhas de ar, pressionando suavemente o vidro da tampa para baixo. </li><li> Coloque o micro slides resultante entre duas tiras de plástico resistentes ao calor e colocá-lo em uma placa de metal. Coloque um peso (por exemplo, um íman) em cima do slide para pressioná-lo para baixo para manter a parte plana durante o seguinte processo de secagem. </li><li> Colocar as lâminas em um forno a60 ° C durante cerca de 12 horas. Depois de 12 horas, tome as lâminas de sair do forno e coloque-os em uma prateleira para deixá-los esfriar a RT (cerca de 20 ° C). Quando esfriar, retire o peso e a tira de plástico e limpe a lâmina utilizando lâminas de barbear para remover o excesso de bálsamo do Canadá. </li></ol> 4. A visualização de conteúdo da célula <ol><li> Preparar a solução Nawashin 25. <ol><li> Prepara-se uma solução de (A) com 5 g de ácido crómico, 50 ml de ácido acético a 96%, e 320 ml de água desionizada. Prepare uma outra solução (B) com 200 ml de formalina, com 175 ml de água desionizada. </li><li> Misturar a solução A e solução B, em uma proporção de 1: 1 para criar a solução Nawashin. </li></ol></li><li> Para visualizar o conteúdo da célula, fixar a amostra com solução Nawashin por 10 min para parar todos os processos de degradação no interior da célula. NOTA: A fixação preserva o núcleo das células, permitindo uma estimativa de longevidade celular (a longevidade das células = núcleos presentes / núcleos ausente; a presença or ausência do núcleo indica se a célula viva ou morta). </li><li> Após a fixação, lavar as seções com água para remover totalmente a solução Nawashin antes manchando-os com safranina-azul de Astra e antes, adicionalmente, manchando-as com azul picric-anilina (1 parte saturada anilin solúvel em água azul + 4 partes de ácido pícrico 10%) . </li><li> Aquecer cuidadosamente a amostra a cerca de 80 ° C (em qualquer caso abaixo do ponto de ebulição), para acelerar o processo de coloração. Para a desidratação e incorporação das amostras de seguir o protocolo passos 3,4-3,8. </li></ol> 5. Preparação de Imagens Digitais de características anatômicas <ol><li> Criar imagens digitais de superfícies do núcleo para análise navio. <ol><li> Corte o plano da superfície do núcleo usando o microtome núcleo e manchar o preto superfície resultante simplesmente usando um marcador de feltro. </li><li> Assim que o corante é seco, esfregar a superfície do núcleo com giz branco. Pressione a giz nas células, simplesmente esfregando a giz sobre osuperfície utilizando um dedo. Também remova o excesso de giz por este procedimento. NOTA: Como resultado, as paredes celulares são pretos e as partes luz dos vasos são brancos. Esse contraste é uma pré-condição para uma análise automática de imagem. </li><li> Coloque o núcleo preparada abaixo de um microscópio binocular equipado com uma câmera digital. Tomar uma sequência de sobrepondo ligeiramente (aprox. 10%) de imagens a partir de um lado do núcleo até que toda a superfície é capturado. Costurar as imagens individuais para criar uma imagem completa da superfície do núcleo. </li></ol></li><li> Criar imagens digitais de micro lâminas <ol><li> Coloque as micro lâminas limpas sob um microscópio e tomar sobrepor imagens de toda a seção. </li><li> Definir uma ampliação específica dependendo das estruturas a serem analisadas, variando entre 40X e ampliação 1000X. </li><li> Costure as imagens individuais para criar uma imagem completa da seção. Para evitar possíveis distorções durante o processo de costura, use &quot;; Plano &quot;-tipo lentes objetivas com o microscópio. </li></ol></li></ol> 6. Características Quantificação anatômicas <ol><li> Para detectar células borda do anel e utilizando a ferramenta de análise de imagem ROXAS18 ou similar, carregar uma imagem completa de uma secção de micro e a calibração espacial associado para obter resultados quantitativos em unidades métricas. Calcula-se a calibração espacial através da medição do número de pixels entre as escalas de imagens de um micrómetro de estágio tomadas com a mesma ampliação e dividindo o valor obtido pelo espaçamento escala em unidades métricas (por exemplo 1,000 mm). </li><li> Selecione na lista fornecida (fornecido no software) uma configuração adequada antes de iniciar a parte automática da análise. Observação: Uma configuração é um conjunto previamente optimizado de configurações do programa que, por exemplo, leva em conta a coloração cor da amostra e o tamanho e forma do intervalo de células a ser detectado. Configurações personalizadas, assim,permitem produzir resultados de reconhecimento ideais para diferentes espécies e qualidades de imagem. <ol><li> Selecione outras opções, tais como o uso de regiões na imagem que devem ser incluídos ou excluídos para evitar, por exemplo, as margens de imagem em branco ou fissuras na amostra, se for necessário. </li></ol></li><li> Iniciar a análise, pressionando o botão Analisar. Se optou, definir regiões da imagem que devem ser incluídas ou excluídas usando a ferramenta polígono, retângulo ou círculo. A análise automática seguinte utiliza algoritmos flexíveis para corrigir algumas deficiências de imagem (por exemplo, sem contraste) e melhorar o contraste com base na qualidade da imagem. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Os desafios de uma integração bem sucedida e sustentável da anatomia da madeira em pesquisa dendroecologia são, além de problemas analíticos múltiplas, principalmente devido a aspectos técnicos. Estes desafios vão desde princípio de amostragem abordagens para a criação de micro seções de alta qualidade e sua posterior análise 19. À primeira vista, a amostragem de núcleos ou até mesmo discos é um procedimento simples que tem sido conhecido por muitos anos agora. Há muitas coisas que podem ser feitas errado e uma pequena imprecisão na amostragem pode resultar em problemas graves durante as fases de preparação e posterior análise. As pequenas imprecisões como descaroçamento que não é exactamente perpendicular ao eixo da haste, ou usando uma sonda imperfeitamente aguçada não são um problema se o objectivo do estudo é restrito ao anel de largura de medições. No entanto, quando se aponta para a análise microscópica das amostras, uma direco de amostragem incorrecta pode resultar em distorções ópticas deparedes das células, enquanto que o uso de rombos corers resultados em micro fissuras dentro do núcleo. Como resultado, ao tentar cortar micro seções destes núcleos, as seções finas apenas desmoronar e uma preparação eficiente não é mais garantida. O mesmo é verdade para a amostragem de micro-núcleo. A ponta romba irá resultar em pressão alta quando o perfurador é martelado em madeira do tronco. Por conseguinte, a camada cambial será comprimido. As células do câmbio (Figura 5) são, consequentemente, espremida e não pode ser analisado. Disco de amostragem é de fato a melhor estratégia quando se analisa as variações de crescimento para relacioná-los às mudanças ambientais. Infelizmente, é simplesmente impossível tomar discos de todas as árvores destinadas a serem amostrados para análises posteriores. No entanto, especialmente no caso de dendrochronology tropical, uma certa quantidade de discos tronco é necessário em combinação com núcleos de incremento. Os discos são usados ​​como base para definir os limites de anel e, por esta para apoiar o boundaries definido com base na análise de núcleos de incremento 12,27,28. Os prós e contras de lixar contra corte são frequentemente discutidos 1,11,21. Como mencionado acima, o melhor procedimento depende sempre da questão de pesquisa e os parâmetros a serem analisados ​​(macroscópica ou microscópica). Se as análises isotópicas ou químicos são projetadas em um passo de trabalho adicional, é de extrema importância que o pó abrasivo criado por lixar que podem preencher em Lumina celular ao longo de toda a amostra, é cuidadosamente removido por aspiração ou ar pressão. Cortar seções micro é para todos microscópica analisa a forma mais adequada de preparação de amostras para análises posteriores. Em primeiro lugar, a secção é cortada da amostra, que então pode ser mantido sem qualquer contaminação potencial para análises posteriores. Segundo essas seções permitem medições de alta resolução de parâmetros de célula única. Além disso, evitar a incorporação demoradotécnica, utilizando uma solução de amido de milho 26 para estabilizar as células é uma grande vantagem em micro corte. A desvantagem de micro corte ainda é o tamanho da amostra limitada, resultando em longos tempos de preparação. Para as análises de séries temporais reais voltar no tempo ao longo de séculos ou mesmo milênios, há uma necessidade de desenvolver dispositivos existentes corte 17,19, mas também análise e processamento de imagem 18. Um primeiro passo neste sentido é o desenvolvimento de micrótomo do núcleo 21, inicialmente fabricado para cortar superfícies planas sobre os núcleos (Figura 1). Testes recentes revelaram a capacidade de corte de micro-secções de núcleos inteiros com este dispositivo (Figura 1). Seções micro alta qualidade fornecem o princípio básico para uma análise de imagem eficaz. Tomando as imagens sob um microscópio é um procedimento comum de 19, mas a sua análise eficaz ainda é uma tarefa que precisacontinuar a ser desenvolvidos 17. Todos os sistemas de análise de imagem existentes são semi-automática, ou seja, eles precisam ser mais ou menos intensamente controlado pelo técnico. Em muitos casos, as imagens precisam ser corrigidos ou mesmo novas imagens têm de ser feitas para melhorar o contraste para um melhor registro das estruturas por parte do software sem alterar espessura da parede celular dentro da imagem. Ferramentas de análise de imagem especializadas, como Roxas 18, WinCell ou os scripts específicos para ImageJ 29 são capazes de fornecer dados anatômicos básicos, tais como o número de células, a dimensão da célula, espessura da parede celular e posição da célula dentro do anel anual. Muitas métricas adicionais anatómicas que são relevantes em um contexto dendroecologia pode ser calculada a partir destas medições básicas, tais como o tamanho das maiores condutas, condutas de distribuição de tamanho, o tamanho de lenho inicial ou a primeira fila de condutas, (óptico) a densidade da madeira, intra-anual perfis de tamanho conduta e da parede celularespessura, e os padrões de agrupamento de condutas (solitária, múltiplos, etc.). Usando o software Roxas 18, os contornos de Lumina conduta (ou seja, a água celular condução) e fronteiras anuais anel são automaticamente reconhecidos e visualmente representadas como sobreposições sobre a imagem original. Algoritmos de detecção de condutas são baseadas em cor, tamanho e informação da forma, os algoritmos de detecção de borda do anel sobre o contexto local de cada conduta. Uma caixa de ferramentas permite-nos melhorar manualmente estes resultados editando diretamente os recursos de sobreposição, ou seja, suprimir, acrescentar e modificar as fronteiras anel e conduta descreve. Após a edição, a saída de dados final, incluindo a espessura da parede celular (coníferas), é gerado e salvo em uma planilha automaticamente. Totalmente sistemas automatizados não estão disponíveis, nem mesmo para as coníferas que mostram uma estrutura relativamente simples, mas este é um objetivo para futuros desenvolvimentos. Isso iria apoiar fortemente o fuintegração ll de parâmetros anatômicos da madeira em análises de séries temporais.

Árvores, bem como arbustos, arbustos anões, e até mesmo ervas, mostram padrões de respostas múltiplas relacionadas a mudanças em seu ambiente. Esses padrões têm sido objecto de botânica e fisiologia das plantas desde meados do século 19. Naquela época, a pesquisa sobre plantas lenhosas focada principalmente em árvores e em uma análise descritiva da estrutura e variabilidade dos anéis anuais em um contexto ecológico 1. Quando Andrew Ellicott Douglass inventou a técnica de cruzamento de namoro para a pesquisa de anéis de árvores 2, neste contexto ecológico foi mais ou menos suprimida pela nova capacidade de datar com precisão achados de madeira em arqueologia. -Dating Cruz pela primeira vez permitiu a datação precisa de anéis de árvores para o ano civil e é até hoje considerada a espinha dorsal da pesquisa de anéis de árvores em todos os campos da sua aplicação 1. Em paralelo, desde o final do século 19, anatomia da madeira evoluiu para uma disciplina de pesquisa importante relacionard a muitos outros campos das ciências naturais e aplicadas 3. Dois domínios principais são estabelecidos: a anatomia sistemática de madeira, que é a base para a identificação de madeira em arqueologia 4, ea anatomia da madeira aplicada, relacionada à tecnologia da madeira, fisiologia, patologia e ecologia 3,5. Na pesquisa de anéis de árvores, dendroecologia hoje em dia é definido como um tema que abrange estudos de anéis de árvores relacionadas com foco em estudos ambientais, tais como processos geomorfológicos (dendrogeomorphology), temperatura e precipitação reconstruções (dendroclimatologia), alterações do nível da água (dendrohydrology) ou mesmo flutuações Glacier ( dendroglaciology) 6. Como esta definição indica, análises de anéis de árvores tornaram-se cada vez mais importante no campo do namoro e reconstruir processos ambientais, tais como (i) condições climáticas do passado, analisando as variações anuais no anel de largura 7,8, densidade da madeira 9 ou isótopos 10, ou (ii) tele recorrência intervalos de processos geomorfológicos 11. Estes estudos muito detalhados sobre variações anel de largura e seu conteúdo isotópico demonstrar a necessidade de analisar os anéis com mais detalhes, ou seja, para estudar a estrutura anatômica dos anéis. No entanto, estudos detalhados de características anatômicas da madeira dentro dos anéis anuais relacionadas às mudanças ambientais são raros 12,13. Embora essas características microscópicas são conhecidas 14, eles raramente têm sido aplicadas em um nível microscópico para pesquisa dendroecologia. Além disso, o momento exato dessas reações de crescimento em árvores cultivados naturalmente, essenciais para fins de datação exata, tem sido raramente documentado recentemente 15. Com relação aos efeitos do aquecimento global 16, a melhoria das existentes e desenvolvimento de novas técnicas para registrar e quantificar os processos ambientais passados ​​e em curso é necessária, especialmente em termos de clima de investigação impacto 11.Ao expandir a investigação anatômica de madeira tradicional para uma anatomia da madeira ecologicamente baseado 17, dendrologicos cientistas podem analisar novos parâmetros e desenvolver novas metodologias para compreender a curto e longo prazo efeitos de fatores ambientais específicos sobre a anatomia de plantas lenhosas 18. O conhecimento detalhado sobre as variações nos parâmetros de células diferentes dentro de anéis individuais relacionados com drivers específicos (por exemplo, forças mecânicas, variações climáticas) é o requisito básico para a compreensão da variabilidade na formação dos anéis de árvore. Em comparação com as medições do anel de largura comuns, identificando variações anatômicas da madeira requer técnicas de preparação mais complexas e amplas que requerem uma grande quantidade de mão de obra e tempo. Os procedimentos detalhados de corte da amostra, a coloração, e incorporação são múltiplas e estão sempre dependentes do objetivo do estudo 19. Para a análise macroscópica da largura do anel de coníferas ou mesmo estruturas para o número, tamanho ou distribution de navios em madeiras de lei, a superfície de uma amostra é comumente polidas com lixa fina ou máquinas especiais de moagem de 20. Uma desvantagem deste procedimento é o enchimento das células individuais com a poeira que impede ainda mais a análise microscópica semi-automática 21. Os melhores resultados para a preparação da amostra macroscópica são alcançados quando a superfície da amostra são cortados com uma lâmina de barbear ou de outra faca afiada. Enquanto para pequenas amostras, lâminas de barbear são uma ferramenta perfeita; amostras maiores como núcleos requerem o corte de superfícies planas ao longo de toda a extensão de núcleos. Em contraste com o lixar, as células não são preenchidos com pó, o qual permite que as operações de preparação para a análise de imagens sucessivas. Além disso, o lúmen de células abertas, as paredes celulares adequadamente cortados, e a superfície do plano da amostra inteira permitir a aplicação de alta frequência densitometria 22 a toda a extensão do núcleo. Para análise de imagem, a superfície das amostras (célulaparedes) pode ser corada com tinta escura e o lúmen de células abertas podem ser utilizados posteriormente com giz branco para melhorar o contraste entre a parede da célula e a área do lúmen 19,23. Esta técnica bastante simples permite uma avaliação macroscópica de base das estruturas celulares maiores, para medições do tamanho do vaso. Estas técnicas para cortar superfícies planas são suficientes para a análise macroscópica. Para uma detalhada análise anatômica de madeira (ou seja, microscópica), microscopia de luz transmitida é o método mais comum aplicado nas ciências dendrologicos. Diferenciar células do xilema por meio de processos complexos que abrangem tipo celular determinação, divisão celular, diferenciação celular, a morte celular programada e 24. Desde o momento eo ritmo a que esses processos ocorrem determinar as características anatômicas de células, as condições ambientais que afetam esses processos podem gerar desvios anatômicos na estrutura do anel. Como uma condição importante para estes analisars, seções micro precisa estar preparado com um micrótomo 19. Quando a preparação de amostras para uma secção transversal, a visibilidade da direcção traqueídeos ou fibra é crucial. É recomendado o uso de normas ditadas micrótomos deslizamento mão para cortar seções micro porque esta técnica facilita seções de alta qualidade, conforme necessário para análise de imagem 19. Dependendo do objectivo específico de um determinado estudo, as lâminas microscópicas são cortadas perpendicularmente ou paralelamente à extensão longitudinal das células. Essas seções são então fotografadas abaixo de um microscópio e dimensões celulares medidos usando imagem especializado analisa software. Até recentemente, a capacidade de preparar as lâminas microscópicas foi restringido para amostras de pequenas dimensões apenas (aproximado 1 cm x 1 cm). Isto é aceitável para analisar eventos únicos como distúrbios em anos específicos, mas esta técnica não permite a análise de séries temporais necessário alargado para reconstruções ambientais. Este esforço só pode ser perceberd através do desenvolvimento de novos, eficientes e econômicas procedimentos de preparação e técnicas de análise. Nos últimos anos, os membros do laboratório de anéis de árvores no Swiss WSL Instituto Federal de Investigação, na Suíça começaram um trabalho intenso sobre este tema. Como resultado, os novos dispositivos e técnicas de análise foram desenvolvidos para suportar a ideia de integrar características anatômicas da madeira para uma ampla gama de temas de investigação ambiental.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1096">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:147px;">Increment corer</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:659px;">http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&#38;view=article 
			&#38;id=57&#38;Itemid=88&#38;lang=en</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Core-Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laboratory microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trephor micro corer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nawashin solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Picric-Anilin blue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Safranin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Astra-blue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linear Formula CH3CH2OH&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Xylol (Xylene)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linear Formula C6H4(CH3)2&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Canada Balsam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Embedding solution for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Roxas Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">WinCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a technical perspective in modern tree-ring research - how to overcome dendroecological and wood anatomical challenges

Pesquisa dendroecologia usa informações armazenadas em anéis de árvores para entender como árvores isoladas e até ecossistemas florestais inteiras respondeu às mudanças ambientais e finalmente reconstruir tais mudanças. Isto é feito através da análise de variações de crescimento de volta no tempo e correlacionando vários parâmetros específicos para cada planta para (por exemplo) os registros de temperatura. Integrando parâmetros anatômicos da madeira nessas análises reforçaria reconstruções, mesmo de resolução intra-anual. Por isso, apresentamos um protocolo sobre a forma de amostra, preparar e analisar amostras de madeira para análises macroscópicas comuns, mas também para análises microscópicas subseqüentes. Além disso, apresentamos uma solução potencial para a análise de imagens digitais geradas a partir de pequenas e grandes espécimes comuns de apoio de séries temporais analisa. O protocolo apresenta os passos básicos, dado que actualmente podem ser usadas. Além disso, há uma necessidade constante para o aprimoramento das técnicas existentes e desenvolvimento de novos techniques, para registrar e quantificar os processos ambientais passados ​​e em curso. Pesquisa de madeira tradicional anatômica precisa ser ampliado para incluir informações ecológica para esse campo de pesquisa. Este apoiaria dendrologicos cientistas que pretendem analisar novos parâmetros e desenvolver novas metodologias para compreender os efeitos de curto e longo prazo dos fatores ambientais específicos sobre a anatomia de plantas lenhosas.

Todas as análises dendroecologia depender de amostras precisas, não importa se discos, núcleos, ou micro núcleos são tomadas. Para isso, os dispositivos precisam estar em perfeita forma (afiadas com precisão) para evitar micro fissuras dentro da amostra de madeira. Ao preparar as superfícies em núcleos de incremento, a utilização de um micrótomo núcleo é essencial. A capacidade de ter células abertas, que podem ser tratados ainda mais para melhorar o contraste para imagem análises e medições do tamanho do reservatório (Figura 1), é um primeiro passo importante para a adaptação das estruturas anatômicas em tempo série analisa. Por vezes, a densidade de uma amostra de madeira evita a utilização de um micrótomo. Nesse caso, um polimento adequado e subsequente remoção do excesso de serragem dos vasos com um compressor ou de vácuo é a melhor opção. Para análises mais detalhadas das estruturas celulares menores como lenho inicial e traqueidas lenho tardio em coníferas, são necessários seções micro de alta qualidade. Aqui, potential artefactos, tais como paredes celulares secundárias serem retirados para fora da parede primária necessidade de ser evitada (Figura 2). Se estes artefactos ocorrer nas imagens digitais, uma análise automática das dimensões da célula já não é possível. Os artefatos em seguida, precisam ser corrigidos manualmente, o que é demorado e na maioria dos casos resulta em medições incorretas de dimensões celulares. A simples aplicação de um fluido não-newtoniano, ou seja, uma solução de amido de milho, para o topo da amostra suporta a estabilidade da estrutura, enquanto a redução da ocorrência de artefactos para um mínimo (Figura 2) 26. Esta aplicação de amido de milho, adequado para todas as amostras de madeira, incluindo espécies tropicais, faz com que a aplicação do processo de incorporação para as amostras antes de cortar redundante. Micro secções permitir uma determinação mais seguro dos anéis anuais. Este é especialmente o caso para as coníferas crescendo em seus limites naturais, ou seja, &lt;/ Em&gt;, na linha de árvore em áreas de alto alpinas. Extremamente anéis estreitos são freqüentes e difíceis de detectar macroscopicamente (Figura 3). Em casos extremos, os anéis consistem em uma ou duas filas de células de lenho inicial e uma linha de células achatadas lenho tardio, que não têm (em contraste com as células lenho tardio comuns) paredes celulares espessas. Para isso, eles são melhores ou até mesmo visível somente ao utilizar lâminas microscópicas. Além disso, as flutuações de densidade podem ser diferenciados a partir das fronteiras do anel de forma mais clara, o que simplifica a detecção dos anéis anuais especialmente no Mediterrâneo e os trópicos (Figura 3). Ao analisar as imagens com uma ampliação de 40X ou mais, células individuais são visíveis e a espessura das suas paredes celulares também é detectável. Software de análise semi-automático permite a medição de parâmetros específicos ao longo de caminhos definidos seguindo a direção de seu desenvolvimento temporal e espacial (Figura 4). Com isso, changes de parâmetros individuais, tais como a luz da célula ou a espessura da parede da célula pode ser determinada ao longo de toda a extensão de um anel anual (Figura 4). Isso pode ser feito para todos os anéis visíveis na imagem e isso apoia plenamente a necessidade de uma análise de séries de tempo prolongado. A análise das imagens podem também ser usadas para determinar as fases de desenvolvimento de anéis anuais no âmbito do período de vegetação (Figura 5). Ao analisar a imagem de uma secção corada com safranina e Astra-azul usando luz polarizada, mesmo as diferentes fases da lenhificação, começando nos cantos exteriores das paredes das células, até o completo lenhificação da parede celular secundária, tornam-se visíveis. Isso ocorre porque as paredes lignificadas (maduro) brilhar em luz polarizada (Figura 5). Informações detalhadas podem ser relacionadas aos dados ambientais documentados para o respectivo período de vegetação para determinar, por exemplo, um clima relati-crescimento mais detalhada<html> onship. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig1.jpg" /> Figura 1. Exemplos de uma seção de micro e uma superfície plana preparada de um carvalho, incluindo anel de largura e medição do tamanho dos vasos esquerda:. Parte mais externa de um núcleo incremento de carvalho. O núcleo de 5 mm de diâmetro foi cortado usando um micrótomo núcleo. A superfície foi depois corado preto utilizando um marcador de células e foram cheios com giz branco após a mancha foi seca. Direita: o gráfico está indicando anel de largura e do tamanho do vaso medições feitas sobre a superfície do núcleo mostrado à esquerda. Não há seções micro eram necessários para fazer estas medições devido à superfície clara criada pelo microtome núcleo (modificado após 21). Resumindo: a seção Micro cortar um núcleo de incremento, manchado, desidratado e fixados em bálsamo do Canadá. Espessura: 20 mm, comprimento: 25 cm.<html> g &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig2.jpg" /> Figura 2. Imagens de seções micro cortar sem estabilização contra um corte de seção usando a solução de amido de milho esquerda:. Seção Micro mostrando corte de artefatos nas traqueidas lenho inicial de uma conífera. A amostra foi cortada sem incorporar e como resultado as paredes secundárias, em vez de as células finas lenho inicial foi dividido a parede principal (setas azuis). Direita: Micro seção sem quaisquer artefatos nas traqueidas lenho inicial de uma conífera. Esta seção (mesma amostra, como mostrado à esquerda) foi cortado depois de aplicar a solução de amido de milho com uma escova em cima da superfície da amostra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> ove_content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig3.jpg" /> . Figura 3. Exemplos de dificilmente detectáveis ​​limites anuais anelar esquerdo: seção Micro de um núcleo de incremento (aqui: Larix decidua) mostrando um limite de anel (seta preta), indicado por uma única fileira de células achatadas lenho tardio, sem qualquer espessamento das paredes das células. Este anel não seria visível macroscopicamente. Direita: flutuações de densidade intra-anual (seta branca) são comuns em espécies do Mediterrâneo (seção micro: Quercus ilex). A mudança gradual da estrutura celular em direção lenho tardio e de volta à estrutura de lenho inicial (seta branca) permite diferenciar flutuações de densidade de Limites de anéis de reais (seta preta). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 4. Ilustração da área de luz, e medidas de espessura de parede dentro de um anel anual de uma conífera Top:. Cut-out imagem que mostra um resultado exemplar de análise Roxas em uma árvore-ring de Pinus sylvestris (pinheiro silvestre). Borda do anel são mostrados em amarelo e contornos de tracheid Lumina em ciano. Para um arquivo radial (azul tracheid Lumina) da espessura da parede da célula medida é representado por círculos vermelhos. Bar escala Preto = 100 mm. Inferior:. As mudanças intra-anuais na área do lúmen tracheid e espessura das células-wall tracheid para todo o anel anual <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig5.jpg" /> Figura 5. example de um anel anual de formação. A imagem foi capturada em microscópio de luz com luz polarizada de um micro-seção manchado Safranina e Astra-azul obtido a partir de um micro-core amostrados em 7 de julho de 2007 a ​​partir de uma decídua Larix crescente no Lötschental a 1.300 m acima do nível do mar. Nesta secção, os micro-células do câmbio, as células na fase de alargamento, as células na fase de espessamento da parede e as células maduras são reconhecíveis. A largura tangencial da imagem cobre ~ 1 mm da seção transversal do xilema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Technical Perspective in Modern Tree-ring Research - How to Overcome Dendroecological and Wood Anatomical Challenges

Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.

Uma perspectiva técnica em Modern Tree-anel Research - Como superar dendroecologia e Madeira anatômicas Desafios

Dendroecological research uses information stored in tree rings to understand how single trees and even entire forest ecosystems responded to ...

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Research

JoVE Journal

Environment

28.8K visualizações.  Swiss Federal Research Institute WSL. Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.

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Design and Construction of an Urban Runoff Research Facility

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use due to increased demand for landscape irrigation. Improper irrigation practices and large rainfall events can result in runoff from urban landscapes which has potential to carry nutrients and sediments into local streams and lakes where they may contribute to eutrophication. A 1,000 m2 facility was constructed which consists of 24 individual 33.6 m2 field plots, each equipped for measuring total runoff volumes with time and collection of runoff subsamples at selected intervals for quantification of chemical constituents in the runoff water from simulated urban landscapes. Runoff volumes from the first and second trials had coefficient of variability (CV) values of 38.2 and 28.7%, respectively. CV values for runoff pH, EC, and Na concentration for both trials were all under 10%. Concentrations of DOC, TDN, DON, PO4-P, K+, Mg2+, and Ca2+ had CV values less than 50% in both trials. Overall, the results of testing performed after sod installation at the facility indicated good uniformity between plots for runoff volumes and chemical constituents. The large plot size is sufficient to include much of the natural variability and therefore provides better simulation of urban landscape ecosystems.

This paper describes the design, construction, and function of a 1,000 m2 facility containing 24 individual 33.6 m2 field plots equipped for measuring total runoff volumes with time and collection of runoff subsamples at selected intervals for quantification of chemical constituents in the runoff water from simulated home lawns.

Projeto e Construção de um Mecanismo de Pesquisa escoamento urbano

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use ...

Ambiente

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água pela cultura e RT-qPCR. I. Recolha de amostras de vírus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Preparation and Testing of Plant Seed Meal-based Wood Adhesives

Recently, the interest in plant seed meal-based products as wood adhesives has steadily increased, as these plant raw materials are considered renewable and environment-friendly. These natural products may serve as alternatives to petroleum-based adhesives to ease environmental and sustainability concerns. This work demonstrates the preparation and testing of the plant seed-based wood adhesives using cottonseed and soy meal as raw materials. In addition to untreated meals, water washed meals and protein isolates are prepared and tested. Adhesive slurries are prepared by mixing a freeze-dried meal product with deionized water (3:25 w/w) for 2 hr. Each adhesive preparation is applied to one end of 2 wood veneer strips using a brush. The tacky adhesive coated areas of the wood veneer strips are lapped and glued by hot-pressing. Adhesive strength is reported as the shear strength of the bonded wood specimen at break. Water resistance of the adhesives is measured by the change in shear strength of the bonded wood specimens at break after water soaking. This protocol allows one to assess plant seed-based agricultural products as suitable candidates for substitution of synthetic-based wood adhesives. Adjustments to the adhesive formulation with or without additives and bonding conditions could optimize their adhesive properties for various practical applications.

To facilitate the effort in seeking more economic and environment-friendly formulations of natural product-based wood adhesives, this work demonstrates the preparation and testing of plant seed-based wood adhesives. This protocol allows one to assess plant seed-based agricultural products as suitable candidates for the substitution of synthetic-based wood adhesives.

Preparação e Teste de madeira adesivos à base de planta refeição Semente

Recently, the interest in plant seed meal-based products as wood adhesives has steadily increased, as these plant raw materials are considered renewable ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ecological interactions. Arthropods are usually tracked in nature by tagging them with a unique mark and then re-collecting them over time and space to determine their dispersal capabilities. In addition to actual physical tags, such as colored dust or paint, various types of proteins have proven very effective for marking arthropods for ecological research. Proteins can be administered internally and/or externally. The proteins can then be detected on recaptured arthropods with a protein-specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Here we describe protocols for externally and internally tagging arthropods with protein. Two simple experimental examples are demonstrated: (1) an internal protein mark introduced to an insect by providing a protein-enriched diet and (2) an external protein mark topically applied to an insect using a medical nebulizer. We then relate a step-by-step guide of the sandwich and indirect ELISA methods used to detect protein marks on the insects. In this demonstration, various aspects of the acquisition and detection of protein markers on arthropods for mark-release-recapture, mark-capture, and self-mark-capture types of research are discussed, along with the various ways that the immunomarking procedure has been adapted to suit a wide variety of research objectives.

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

Administrando e Detecção de Marcas de proteína em artrópodes para a dispersão de Pesquisa

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

How to Create Conditioned Taste Aversion for Grazing Ground Covers in Woody Crops with Small Ruminants

Conditioned taste aversion (CTA) is a learning behavior process where animals are trained to reject certain feed after gastrointestinal discomfort has been produced. Lithium chloride (LiCl) is the preferred agent used in livestock to induce CTA because it specifically stimulates the vomit center. In addition, LiCl is commercially available, and easy to prepare and administer using a drenching gun. Nevertheless, some factors have to be considered to obtain an effective long-lasting CTA, which allows small ruminants to graze during the cropping season. A key aspect is to use animals with no previous contact with the target plant (the plant chosen to be avoided; new feed). Due to their native neophobic feeding behavior, small ruminants can easily associate the negative feedback effects with the new feed, resulting in a strong and persistent CTA. The recommended doses are 200 and 225 mg LiCl/kg body weight (BW) for goats and sheep, respectively. To induce CTA, 100 g of the target plant should be individually offered for at least 30 min, and LiCl administered thereafter if the intake is greater than 10 g. Each time the animal eats the target plant without negative consequences, the CTA becomes weaker. Consequently, to minimize the risk of target plant consumption, it is essential to have sufficient palatable ground cover available. The presence of an alternative feed (of quality and quantity) prevents the accidental consumption of the target plant. A close monitoring of the flock is recommended to remove and re-dose any animal consuming more than 4 bites or 10 g of the target plant. At the beginning of each grazing season, check the CTA status of each animal before moving them to the crop.

Feeding behavior preferences in livestock can be modified to implement a grazing management plan in woody crops. Here, we present a protocol to show a lithium chloride dose after eating a new plant that induces conditioned taste aversion.

Como criar aversão ao sabor condicionado para Grazing forrações em culturas lenhosas com Pequenos Ruminantes

Conditioned taste aversion (CTA) is a learning behavior process where animals are trained to reject certain feed after gastrointestinal discomfort has ...

Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells

In plasma medicine, ionized gases with temperatures close to that of vertebrate systems are applied to cells and tissues. Cold plasmas generate reactive species known to redox regulate biological processes in health and disease. Pre-clinical and clinical evidence points to beneficial effects of plasma treatment in the healing of chronic ulcer of the skin. Other emerging topics, such as plasma cancer treatment, are receiving increasing attention. Plasma medical research requires interdisciplinary expertise in physics, chemistry, and biomedicine. One goal of plasma research is to characterize plasma-treated cells in a variety of specific applications. This includes, for example, cell count and viability, cellular oxidation, mitochondrial activity, cytotoxicity and mode of cell death, cell cycle analysis, cell surface marker expression, and cytokine release. This study describes the essential equipment and workflows required for such research in plasma biomedicine. It describes the proper operation of an atmospheric pressure argon plasma jet, specifically monitoring its basic emission spectra and feed gas settings to modulate reactive species output. Using a high-precision xyz-table and computer software, the jet is hovered in millisecond-precision over the cavities of 96-well plates in micrometer-precision for maximal reproducibility. Downstream assays for liquid analysis of redox-active molecules are shown, and target cells are plasma-treated. Specifically, melanoma cells are analyzed in an efficient sequence of different consecutive assays but using the same cells: measurement of metabolic activity, total cell area, and surface marker expression of calreticulin, a molecule important for the immunogenic cell death of cancer cells. These assays retrieve content-rich biological information about plasma effects from a single plate. Altogether, this study describes the essential steps and protocols for plasma medical research.

A high-throughput cold physical plasma treatment protocol of liquids and cells is shown. It involves setting up different feed gas compositions for plasma ignition, measuring the plasma&#39;s emission spectra, and the subsequent analysis of liquids and cellular activity after plasma treatment.

Pesquisa básica em Plasma medicina - uma abordagem de taxa de transferência de líquidos para células

In plasma medicine, ionized gases with temperatures close to that of vertebrate systems are applied to cells and tissues. Cold plasmas generate reactive ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the associated accuracy is unknown. Here, we present a detailed protocol for efficient and clustered soil sampling in a research plot and, relying on a pilot sampling using this design, for demonstrating soil spatial heterogeneity and informing reasonable sample sizes and associated accuracy for future study. The protocol mainly comprises four steps: sampling design, field collection, soil analysis, and geostatistical analysis. The step-by-step procedure is modified according to former publications. Two examples will be presented to demonstrate contrasting spatial distributions of soil organic carbon (SOC) and soil microbial biomass carbon (MBC) under different management practices. In addition, we present a strategy to determine the sample size requirement (SSR) given a certain level of accuracy based on the plot-level coefficient of variation (CV). The field sampling protocol and the quantitative determination of the sample size will assist researchers in seeking feasible sampling strategies to meet research needs and resources' availability.

The traditional soil-sampling procedure determines the number of soil samples arbitrarily. Here, we provide a simple yet efficient clustered soil-sampling design to demonstrate soil spatial heterogeneity and quantitatively determine the number of soil samples required and the associated sampling accuracy.

Amostragem de solos em uma parcela de pesquisa heterogênea

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water distribution in plant tissues in combination with freeze fixation techniques using liquid nitrogen (LN2). For woody species, however, preparations for observing the xylem transverse-cut surface involve some difficulties due to the orientation of wood fibers. Additionally, higher tension in the water column in xylem conduits can occasionally cause artifactual changes in water distribution, especially during sample fixation and collection. In this study, we demonstrate an efficient procedure to observe the water distribution within the xylem of woody plants in situ&#160;by using a cryostat and cryo-SEM. At first, during sample collection, measuring the xylem water potential should determine whether high tension is present in the xylem conduits. When the xylem water potential is low (&#60; ca. &#8722;0.5 MPa), a tension relaxation procedure is needed to facilitate better preservation of the water status in xylem conduits during sample freeze fixation. Next, a watertight collar is attached around the tree stem and filled with LN2&#160;for freeze fixation of the water status of xylem. After harvesting, care should be taken to ensure that the sample is preserved frozen while completing the procedures of sample preparation for observation. A cryostat is employed to clearly expose the xylem transverse-cut surface. In cryo-SEM observations, time adjustment for freeze-etching is required to remove frost dust and accentuate the edge of the cell walls on the viewing surface. Our results demonstrate the applicability of cryo-SEM techniques for the observation of water distribution within xylem at cellular and subcellular levels. The combination of cryo-SEM with non-destructive in situ observation techniques will profoundly improve the exploration of woody plant water flow dynamics.

Observing the water distribution within the xylem provides significant information regarding water flow dynamics in woody plants. In this study, we demonstrate the practical approach to observe xylem water distribution in situ&#160;by using a cryostat and cryo-SEM, which eliminates artifactual changes in the water status during sample preparation.

Distribuição da água de xylem em plantas lenhosas visualizadas com um microscópio de elétron da Cryo-exploração

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

A Guide to Concentration Alternating Frequency Response Analysis of Fuel Cells

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency response analysis (cFRA) on proton-exchange membrane (PEM) fuel cells. During cFRA experiments, the modulated concentration feed was sent to the cathode of the cell at different frequencies. The electric response, which can be cell potential or current depending on the control applied on the cell, was registered in order to formulate a frequency response transfer function. Unlike traditional electrochemical impedance spectroscopy (EIS), the novel cFRA methodology makes it possible to separate the contribution of different mass transport phenomena from the kinetic charge transfer processes in the frequency response spectra of the cell. Moreover, cFRA is able to differentiate between varying humidification states of the cathode. In this protocol, the focus is on the detailed description of the procedure to perform cFRA experiments. The most critical steps of the measurements and future improvements to the technique are discussed.

We present a protocol for concentration alternating frequency response analysis of fuel cells, a promising new method of studying fuel cell dynamics.

Um guia para a análise de resposta de frequência alternada de concentração das células de combustível

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency ...