Este trabalho é financiado pela RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) sob um contrato de investigação em colaboração com a Escola Wake Forest University of Medicine. GL Prasad é um funcionário em tempo integral da RJRT.

NOTA: consentimento informado por escrito para fazer este estudo foi obtido em uma unidade de pesquisa clínica local, sob aprovação IRB, por Boas Práticas Clínicas. Processamento do sangue, o isolamento de PBMC e as outras experiências de cultura de células são realizadas em condições estéreis, utilizando reagentes e fornecimentos microbiologicamente estéreis. 1. Preparação WS-CM <ol><li> Gerar WS-CM como descrito anteriormente 12. <ol><li> Prepare WS-CM, passando fumaça de quatro 3R4F cigarros de referência através de Roswell Instituto Memorial Park (RPMI) 1640 sem vermelho de fenol usando o seguinte esquema de fumar: 35-60-2, o volume de sopro em ml, intervalo de sopro em segundo, ea duração do sopro no segundo, respectivamente. Cada preparação gera uma amostra de 20 ml. </li></ol></li><li> Tubo (s) etiqueta com data, hora concluída, eo nome e número de cigarros. Armazenar os 500 mL alíquotas a -80 ° C imediatamente após o tabagismo está concluída. </li><li> Analise alíquotas de WS congelados-CM Para determinar os níveis de nicotina, nitrosaminas específicas do tabaco, e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, tal como anteriormente descrito 12. </li></ol> 2. Isolamento de PBMC <ol><li> Coletar sangue fresco de doadores saudáveis ​​(que são não-consumidores de produtos de tabaco) Isolar PBMC de sangue fresco conforme descrito abaixo em uma aprovação separada do Wake Forest Baptist Health IRB 15. <ol><li> Antes da chegada da bolsa de sangue, possuem uma garrafa de 500 ml, uma tesoura, tampão de isolamento, e salino tamponado com fosfato de Dulbecco (DPBS) (RT) pronto em um nível de segurança biológica 2 (BSL-2) cultura de células de capa. Tampão de isolamento deve ser protegido da luz. </li><li> Mantenha o saco de sangue de cabeça para baixo e cortar o tubo logo abaixo onde foi preso deixando pelo menos 3 cm de tubagem. </li><li> Retire a tampa da garrafa de 500 ml e mantenha o tubo acima da abertura do frasco. Pegue o saco de sangue e inverter para permitir que o sangue flua livremente do saco em tele garrafa até que o saco está vazio. Permitir que o sangue flua para a parede interior da garrafa contra directamente para baixo a fim de evitar a criação de bolhas. </li><li> Pour tampão de isolamento para dentro da garrafa a uma proporção de 1: 5 de tampão de isolamento de sangue. Tapar o frasco firmemente e suavemente invertê-lo, a cargo de ponta a ponta, 10 vezes. Deixar o frasco dentro do capuz de cultura de células a incubar com as luzes apagadas, durante 1 h à TA. </li><li> A, camada de cor de palha luz vai construir acima do sangue. Remover esta camada usando uma pipeta de 25 ml sorológico em 50 ml tubos cônicos. O valor arrecadado pode variar 50-300 ml, dependendo do assunto que doou sangue. </li><li> Centrifugar os tubos a 200 xg durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar o sobrenadante translúcido, deixando um pelete de cor de sangue escuro. O pellet será solto, mas viscoso. </li><li> Pipetar 3 ml de tampão de isolamento em tubos cónicos de 15 ml. </li><li> Para ressuspender o sedimento, adicionar 20 ml de DPBS para cada 50 ml de líquido cor de palha recolhidos em step 2.1.5. Vortex para misturar bem, e consolidar o líquido novamente suspensas a partir de vários tubos. Este líquido contém suspenso células sanguíneas. </li><li> Com uma pipeta de transferência, a transferência de 5 ml de células sanguíneas em suspensão em 3 ml de tampão de isolamento no passo 2.1.8. Inclinar o tubo cónico de 15 ml que contém a suspensão de células lenta e suavemente para criar duas camadas separadas. Centrifugar os tubos a 400 xg durante 40 min à temperatura ambiente com o mínimo de aceleração e sem travão. </li><li> Usar uma pipeta de transferência para remover a camada resultante turva meio (buffy coat) contendo PBMCs em um tubo de 50 ml. Evite desenho outras camadas claras abaixo dela. Transferência não mais do que 25 ml em cada tubo de 50 ml. </li><li> Adicionar 25 ml de tampão corrente fria (ou mais para preencher todo o volume restante do tubo de 50 ml) para lavar as células. Centrifuga-se as células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento com 10 ml de tampão de corrida. Este contém PBMC. Contar as células e usar immediata ou colocar no gelo para congelar. </li></ol></li></ol> 3. congelamento e descongelamento do PBMC <ol><li> Centrifugar as PBMCs que foram recolhidas no passo 2.1.13 durante 10 min a 400 x g. </li><li> Encher o recipiente de congelamento com álcool isopropílico acordo com as instruções do fabricante. CUIDADO: O álcool isopropílico é inflamável e altamente tóxico. </li><li> Ressuspender o sedimento com meio RPMI 1640 (4 ° C) contendo 20% de soro fetal bovino (FBS) e 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Esta é meio RPMI 1640 congelação. Ressuspender o sedimento com uma quantidade de meio que irá resultar numa suspensão com cerca de 5 x 10 7 células / ml de congelação. O número de células disponíveis para a congelação irá variar. </li><li> Distribuir aliquotas de 1 mL de suspensão de células em tubos criogénicos de 2 ml e colocar os tubos criogénicos de congelação no recipiente. Coloque o recipiente de congelamento com criotubos em freezer a -80 ° C para armazenar O / N e, em seguida, remover os criotubos e transferir para armazenar em umcongelador criogénico entre -150 ° C a -190 ° C. </li><li> Remover o tubo criogénico de armazenamento criogénico e descongelar rapidamente com agitação suave num banho de água a 37 ° C. </li><li> Transferir imediatamente as PBMCs foram descongeladas em tubo criogénico a um tubo de 15 ml com 10 ml de meio RPMI 1640 completo (4 ° C) contendo 10% de FBS, 1% de Pen / Strep e 1% de L-glutamina. O conteúdo do criotubo descongelado deve ser o mais rapidamente possível transferido para obter a viabilidade celular máxima 15. </li><li> Centrifuga-se as PBMC a 400 xg durante 10 min. </li><li> Ressuspender o sedimento com 5 ml RPMI 1640 completo e contar as células. </li><li> Medir a viabilidade celular por meio de métodos estabelecidos, tais como o método de exclusão de azul de tripano. Geralmente a viabilidade celular, com este método é de cerca de 90-95%. As PBMC agora está pronto para usar em experiências. </li></ol> 4. morte celular da Determinação NOTA: As diluições são listadas aqui para o propósito deste study. As diluições podem ser alteradas em conformidade. <ol><li> Diluir WS-CM ou nicotina numa placa de 96 poços, utilizando meio RPMI completo para um volume total de 100 uL / ​​poço, como indicado abaixo. </li><li> Diluir WS-CM às seguintes concentrações: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, e 5 ug / mL de unidades de equi-nicotina (com base no teor de nicotina no WS-CM) 12. </li><li> Diluir nicotina em meio RPMI com as seguintes concentrações: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, e 3000 ug / ml. ATENÇÃO: A nicotina é altamente tóxico e prejudicial ao ambiente. </li><li> Adicionar 100 ul de PBMC em suspensão em meio RPMI completo a cada poço a uma concentração de 1 x 10 6 células / poço. O volume total de células mais a WS-CM ou nicotina será de 200 ul / poço. </li><li> Para o propósito deste estudo, preparar dois conjuntos de placas como anteriormente. Cobrir as placas e incubar uma placa durante 24 horas e uma placa durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. Ajuste pontos de tempo que for necessário. </li&gt; <li> Lavam-se as células à temperatura ambiente por centrifugação a 300 xg durante 3 min, aspirando o sobrenadante, vortex parte inferior da placa com placa coberta e finalmente ressuspender as células com 200 ul de tampão de corrida gelo frio, e repetir o passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Adicionar 95 ul de tampão de corrida seguido por 5 ul de 7-aminoactinomycin D (7AAD) para cada poço de um volume total de 100 ul / poço. Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Adicione 100 ml de tampão de corrida para tubos de fragmentação. Transferir todo o volume de suspensão de células de cada poço da placa para os tubos de fragmentação e adquirir as amostras no citómetro de fluxo. </li><li> Determinar a percentagem de células 7AAD-positivo utilizando o software de análise de citometria de fluxo. </li></ol> 5. CE 50 Determinação <ol><li> Os valores de EC50 de WS-CM e nicotina são determinadas por coloração 7AAD-positivo de PBMC. </li><li> O valor de EC50 é definido como o ácido clorídrico coneentration à qual 50% das células já não eram viáveis ​​num ensaio de 24 horas, e os valores são expressos como ug de equi-nicotina unidades / ml. </li><li> Para as finalidades deste estudo, os valores de EC 50 foram determinados como sendo 1,56 ng / mL e 1,650 ug / ml para o WS-CM e nicotina, respectivamente. </li></ol> 6. As citocinas secretadas NOTA: As diluições são listados aqui com o propósito do presente estudo. As diluições podem ser ajustados em conformidade. <ol><li> Diluir WS-CM em uma placa de 96 poços, utilizando meio RPMI completo para um volume total de 100 ul / poço a uma concentração de 0,3, 1,56, 3, e 5 ug / ml de unidades de equi-nicotina. </li><li> Diluir nicotina para as seguintes concentrações: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, e 3000 ug / mL. ATENÇÃO: A nicotina é altamente tóxico e prejudicial ao ambiente. </li><li> Adicionar 100 ul de PBMC em suspensão em meio RPMI completo a cada poço a uma concentração de 1 x 10 6 células / poço.O volume total de células mais a WS-CM ou nicotina será de 200 ul / poço. </li><li> Cobrir a placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Lavam-se as células à temperatura ambiente por centrifugação a 300 xg durante 3 min, aspirando o sobrenadante, vortex parte inferior da placa com placa coberta e, finalmente, a suspensão de células com 200 ul de tampão de corrida de gelo frio e repetindo o passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Adicionar 200 ul de meio RPMI completo, e repetir o passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Adicionar 200 ul de 10 ug / ml de LPS meio a cada poço. </li><li> Cobrir a placa e incubar durante 4 h, 24 h, 48 h, ou 72 h a 37 ° C e 5% de CO 2. Ajuste os tempos de incubação, se necessário. </li><li> Centrifugar a placa a 300 x g durante 3 min. </li><li> Tome 175 mL de sobrenadante de cada bem e guarde em um freezer a -80 ° C para realizar os ensaios em etapas 7 e 8. </li></ol> 7. Cytometric Bead Matriz Assay &lt;ol&gt; <li> Descongelar os sobrenadantes de células preparadas a partir do passo 6.10 e utilização no ensaio de CBA. Realizar o ensaio de matriz de esferas de citometria (CBA), conforme as instruções do fabricante. </li></ol> 8. IL-8 ELISA <ol><li> Descongelar os sobrenadantes de células do passo 6.10 e utilização no ELISA de IL-8. Realizar o ensaio ELISA, conforme as instruções do fabricante. </li></ol> 9. intracelular Coloração e Citometria de Fluxo NOTA: As diluições são listados aqui com o propósito do presente estudo. As diluições podem ser ajustados em conformidade. <ol><li> Diluir WS-CM em uma placa de 96 poços, utilizando meio RPMI completo para um volume total de 100 ul / poço a uma concentração de 0,3, 1,56, 3, e 5 ug / ml de unidades de equi-nicotina. </li><li> Na mesma placa, diluir nicotina para as concentrações seguintes: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 e 4000 ug / ml. ATENÇÃO: A nicotina é altamente tóxico e ambientalmente hazardous. </li><li> Adicionar 100 ul de PBMC em suspensão em meio RPMI completo a uma concentração de 1 x 10 6 células / poço. O volume total de células mais a WS-CM ou nicotina será de 200 ul / poço. </li><li> Cobrir a placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Lavam-se as células à temperatura ambiente por centrifugação a 300 x g durante 3 min, aspirando o sobrenadante, vortex parte inferior da placa com placa coberta e finalmente ressuspender as células com 200 ul de tampão de corrida gelo frio, e repetir o passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Adicionar 200 ul de meio RPMI completo para a placa, e repetir o passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Preparar as concentrações de trabalho de 2 ul / ml GolgiPlug e 10 ug / ml de LPS, utilizando meio RPMI completo e adicionar 200 ul a cada poço. </li><li> Incubar a placa durante 6 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> No final do passo 9.8, lavar as células com tampão de corrida (4 ° C) e centrifugação a 300xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 100 ul de Cytofix a cada poço e incubar durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Lavam-se as células 3 vezes, conforme descrito no passo 9.9 com 1x Permwash (4 ° C) a 300 xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 45 ul de 1x Cytoperm a cada poço seguido por 5 ul de cada um de um dos seguintes anticorpos para cada cavidade: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incubar a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Lavar as células duas vezes conforme descrito no passo 9.9 com 1x Permwash (4 ° C) e uma vez com tampão de corrida (4 ° C) a 300 xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as células com 200 uL de paraformaldeído a 2% (4 ° C). Transferência das células em 12 × 75 mm tubos, e analisar as amostras em citômetro de fluxo. CUIDADO: O paraformaldeído é corrosivo, altamente tóxico e um perigo para a saúde. </li></ol> 10. K562 Ensaio Killing NOTA: As células devem ser cultivadas K562em cultura a 37 ° C e 5% de CO 2 com meio RPMI completo até atingirem 80% de confluência antes do ensaio. <ol><li> Prepare um mM 5 carboxyfluorescein solução éster succinimidyl (CFSE) estoque, adicionando 18 mL de DMSO para o frasco. </li><li> Diluir WS-CM ou nicotina numa placa de 96 poços, utilizando meio RPMI completo para um volume total de 100 ul / poço para alcançar as unidades de equi-nicotina desejadas ou as concentrações de nicotina para cada poço. ATENÇÃO: A nicotina é altamente tóxico e prejudicial ao ambiente. </li><li> Adicionar 100 ul de PBMC em meio RPMI completo a uma concentração de 1,5 x 10 6 células / poço. O volume total de células com WS-CM ou nicotina será de 200 ul / poço. </li><li> Cobrir a placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Lavam-se as células K562 por adição de 10 ml de DPBS e centrifugar a 400 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender as células com 10 ml de DPBS e contar as células K562. </li><li> Prepare CFSE workisolução ng por adição de 1 ml de solução de estoque de CFSE a 1 ml de DPBS. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de trabalho de CFSE a 1 ml da suspensão de células K562 contendo 1-2 x 10 7 células. Vortex e incubar exactamente durante 2 minutos a RT. </li><li> Imediatamente adicionar 200 mL de FBS. Vortex e incubar exactamente durante 2 minutos a RT. </li><li> Adicionar 10 ml de meio RPMI completo e centrifugar o tubo a 400 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante e meio RPMI romper a pelota e ressuspender as células com 10 ml de meio RPMI completo e contar as células K562 marcadas com CFSE. </li><li> Lavam-se as CMSPs por centrifugação a placa a 300 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante por decantação do líquido. Substituir a tampa e vortex a parte inferior da placa. Adicionar 200 ul de meio RPMI completo e repetir o passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Adicionar células K562 marcadas com CFSE, na proporção de 01:15 (100.000 K562s: 1,5 x 10 6 PBMC) a cada poço da placa de amostra de CMSP e ainda incubate durante 5 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Lava-se a mistura de células por centrifugação a 300 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante por se eliminar o líquido. Coloque a tampa e vortex a parte inferior da placa. </li><li> Adicionar 200 ul de tampão de corrida e repetir o passo de lavagem descrito no passo 10,14 mais uma vez. </li><li> Adicionar 95 ul de tampão de corrida, seguido por 5 mL de 7AAD a cada poço para um volume total de 100 ul / poço. Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de corrida a cada poço e transferir todo o volume de suspensão de células de cada poço da placa para os tubos de fragmentação e adquirir as amostras no citómetro de fluxo. </li><li> Determinar a percentagem de células positivas 7AAD e CFSE-positivos usando software de análise de citometria de fluxo. </li></ol>

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The authors declare that there are no conflicts of interest.

Nós e outros autores demonstraram previamente que o tratamento das PBMC com UTEs suprime a várias respostas, incluindo a expressão e a secreção de citocinas e medidas funcionais, tais como células alvo de matar 14. Os métodos experimentais descritos na obra anterior exigem períodos de incubação mais longos e eram modestas em magnitude 14. Dadas as potenciais aplicações desse modelo atrativo ex vivo para pesquisa básica e aplicada, investigamos se algum dos parâmetros do ensai...

Um corpo substancial de pontos de conhecimento para os efeitos adversos para a saúde de tabagismo crônico, incluindo a doença cardiovascular (DCV), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e câncer de 1,2. Fumar do cigarro crónica tem sido conhecido por causar inflamação e supressão imune, e estas alterações estão relatados para contribuir para o aumento do risco de infecção microbiana e o cancro em fumadores 3. Estudos in vitro e ex vivo, as técnicas são úteis para elucidar a base molecular dos efeitos patofisiológicos de fumaça de cigarro 4-9 (Tabela 1) e são reconhecidos como importantes ferramentas para orientar a regulamentação emergente de vários produtos do tabaco 10,11. Por exemplo, nós demonstramos que inflamáveis ​​produtos do tabaco (UTEs), como meio de toda com ar-fumo (WS-CM) e material particulado total (TPM) são muito mais citotóxica e prejudicial paraDNA de UTEs não-combustíveis ou nicotina 12,13. Consistente com o trabalho publicado, foi recentemente informou que UTEs combustíveis ou nicotina 12,13. Consistente com o trabalho publicado, que recentemente informou que UTEs combustíveis causou acentuada imunodepressão. Isto foi demonstrado pela supressão da Toll- como receptores (TLR) -ligands, estimulou a secreção de citocinas, e célula-alvo (K562) matando por PBMC em um modelo ex vivo 14. Dada a importância da inflamação em processos de doença induzida por fumo de cigarro, uma maior optimização das condições de ensaio para avaliar os efeitos imunomoduladores do fumo do cigarro é apresentado no presente relatório. Os ensaios ex vivo tipicamente medido intracelular e citocinas, bem como a função citolítica das células T citotóxicas e de células K562 NK em ensaios de morte 14 segregada. Os ensaios envolvidos pré-incubação com WS-CM e nicotina e subsequente estimulação de PBMCs com agonistas de TLR durante um período de 3 dias; as leituras finais são realizadas utilizando ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) e / ou citometria de fluxo. Utilizamos o lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), que se liga a receptores TLR-4 e estimula as CMSPs resultando na produção de citocinas intracelulares e de secreção de citocinas. Além disso a optimização das diversas etapas do ensaio para avaliação dos efeitos imunomoduladores da UTEs, também presentes métodos para isolar as PBMC, ensaios de morte celular, e a quantificação de IL-8. Estes métodos podem ser aplicados para abordar outras questões de pesquisa e mais refinado para avaliar os produtos do tabaco no contexto regulamentar. Tabela 1. relatos de in vitro e ex vivo Publicado métodos usados ​​para estudar varilus efeitos fisiopatológicos de preparações de produtos de tabaco CS, médio fumaça de cigarro.; CSC, fumaça de cigarro condensado; CSE, cigarro extrato de fumo; ELISA, enzima-linked immunosorbent assay; GADPH, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase; qPCR, a reação em cadeia da polimerase quantitativa; RT, em tempo real reação em cadeia da polimerase quantitativa; TS, fumo de tabaco. <table><tbody><tr><td> Autor (ano de estudo) </td><td> Laan et al. (2004) </td><td> Moodie et al. (2004) </td><td> Oltmanns et al. (2005) </td><td> Vayssier (1998) </td><td> Witherden et al. (2004) </td><td> Birrell, et al. (2008) </td></tr><tr><td> As células usadas </td><td> Células do endotélio brônquicas humanas (BEAS-2B), neutrófilos humanos </td><td> Células epiteliais alveolares Humanos (A549) </td><td> Vias aéreas células musculares lisas Humanos (HASMC) </td><td> As células U937 premonocytic Humanos, monócitos humanos </td><td> Alveolares tipo II células epiteliais (ATII) </td><td> Monocytic HumanoA linha de células (células THP-1), os macrófagos de pulmão humano </td></tr><tr><td> TPP usado </td><td> CSE </td><td> CSC </td><td> CSE </td><td> TS </td><td> CSE </td><td> CS </td></tr><tr><td> Método usado </td><td> ELISA, qPCR, migração, mudança electromobility </td><td> Imuno-química, electroforese, kit Arrayscan, RT-PCR, ELISA </td><td> ELISA, RT-PCR, qPCR, electroforese </td><td> Mudança Gel-mobilidade </td><td> A microscopia óptica, microscopia eletrônica, eletroforese, ELISA </td><td> qPCR, ELISA, kit de E-toxate (Sigma), o ensaio de placa de p65 (TransAM), electroforese, vários kits de imunoensaio </td></tr><tr><td> Medida </td><td> IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, a migração </td><td> Acetiltransferases de histona, desacetilases de histonas, NF-kB, IL-8, pi-kB α, GADPH </td><td> HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxina </td><td> Proteínas de choque térmico / estresse (HSP / Hsp70), fator de transcrição HF, NF-kB,TNF-α </td><td> Proteína tensioactiva (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, o TNF-α, IL-1β, IFN-γ </td><td> IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / fosforilação de ERK, cJun: ligação de ADN, a glutationa, o p65: ligação de ADN </td></tr><tr><td> Resultado final </td><td> CSE regula negativamente a produção de citocinas por meio de supressão da activação de AP-1. </td><td> H 2 O 2 e CSC melhorar a acetilação de proteínas histona, diminuir a actividade de histona-desacetilase, diferencialmente regulam a libertação de citocina pró-inflamatória. </td><td> A fumaça do cigarro pode causar a liberação de IL-8 de HASMC, reforçada por TNF-α, 20% CSE menos IL-8 libertação, a inibição da eotaxina e RANTES por fumaça de cigarro. </td><td> TS activado fator de transcrição HF, que foi associado com Hsp70 superexpressão e inibição da actividade NFkB e TNF-α liberação vinculativo. </td><td> Redução ATII níveis de quimiocinas derivadas de células compromisso alveoreparação lar, contribuindo para o cigarro induzida pelo fumo dano alveolar e enfisema. </td><td> Dados fornecer explicação mecanicista para infecções respiratórias por que os fumantes têm aumentado. Supressão da resposta inata é acompanhada por um aumento na produção de IL-8. </td></tr></tbody></table>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:223px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">12 X 75 tubes</td>
			<td style="width:148px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">2 mL Microtubes</td>
			<td style="width:148px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">3R4F reference cigarettes&#160;&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Univ. of Kentucky, College of Agriculture</td>
			<td style="width:119px;">3R4F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">500 ml bottle</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">7AAD</td>
			<td style="width:148px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">559925</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well flat bottom plate</td>
			<td>Termo Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well round bottom plates</td>
			<td style="width:148px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture hood</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">58110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CFSE</td>
			<td style="width:148px;">Molecular Probes Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cluster tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td>4401</td>
			<td>Harmful if swallowed, carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cytofix/Cytoperm (Permwash)</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555028</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide )</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DPBS</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FBS</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCAP Array</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">652099</td>
			<td>Software analyzes CBA data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Filter unit</td>
			<td style="width:148px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">156-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">FACS Canto II</td>
			<td>&#160;8 colors, at Ex 405 and Em785.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">FACS Calibur</td>
			<td>&#160;4 colors at Ex 495 and Em 785.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Flow cytometry analysis software</td>
			<td style="width:148px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Freezing Container</td>
			<td style="width:148px;">Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Contains DMSO,&#160; irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">GogliPlug</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555029</td>
			<td>Carcinogen, Irritant, Corrosive&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:223px;">H2SO4</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human Inflammatory Cytokine Kit</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">IFN-&#947; V-500 Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BD Horizon</td>
			<td style="width:119px;">561980</td>
			<td>&#160;skin sensitizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">IL-8 ELISA Kit</td>
			<td style="width:148px;">R and D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Isolation Buffer</td>
			<td style="width:148px;">Isolymph, CTL Scientific Corp.</td>
			<td style="width:119px;">1114868</td>
			<td>Flammable liquid, Irritant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">LPS</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MIP1-&#945; PE Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">554730</td>
			<td>Acute toxicity, Oral</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Monensin</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M5273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotine</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N3876</td>
			<td>Acute toxicity, Environmental hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Parafilm</td>
			<td style="width:148px;">Bemis</td>
			<td style="width:119px;">&#8220;M&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>Flammable, Skin irritation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Pen/strep</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Running buffer</td>
			<td style="width:148px;">MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Th1/Th2 CBA Kit</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">TNF-&#945; Alexa Fluor 488 Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">502915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tris Base</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to evaluate cytotoxicity and immunosuppression of combustible tobacco product preparations

Entre outras alterações fisiopatológicas, a exposição crónica ao fumo do cigarro provoca a inflamação e a supressão imunitária, que têm sido associados ao aumento da susceptibilidade dos fumadores a infecções microbianas e a incidência de tumores. Ex vivo supressão de respostas imunes mediadas por receptores em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) tratadas com constituintes do fumo é uma abordagem atraente para estudar os mecanismos e avaliar os possíveis efeitos a longo prazo da exposição a produtos do tabaco. Aqui, nós optimizado métodos para realizar ensaios ex vivo utilizando PBMC estimuladas por lipopolissacarídeo bacteriano, um receptor-ligando 4 de tipo Toll. Os efeitos do meio condicionado de fumo todo (WS-CM), a preparação de produtos de tabaco combustível (TPP), e nicotina foram investigados sobre a secreção de citocinas e alvo morte celular por PBMC nos ensaios ex vivo. Mostramos que as citocinas secretadas IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, e IL-8 e citocinas intracelulares IFN-47 ;, o TNF-α, e MIP-1α foram suprimidos em PBMC WS-CM-expostos. A função citolítica de PBMC efectoras, conforme determinado por um ensaio de matar células K562 alvo também foi reduzida por exposição a WS-CM; nicotina era minimamente eficaz nestes ensaios. Em resumo, é apresentado um conjunto de ensaios melhorados para avaliar os efeitos de UTEs em ensaios ex vivo, e estes métodos podem ser facilmente adaptados para testar outros produtos de interesse.

Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média (quatro amostras do dador). T-teste do aluno entre amostras de controlo tratados e não tratados foi realizada utilizando o software Excel, bem como comparações t-teste para todos os tratamentos com seus controles correspondentes. A significância estatística foi indicada por: *, P &lt;0,05; **, P &lt;0,005; ***, P &lt;0,0005. Para medir o efeito da exposição a WS-CM e nicotina, as PBMC foram tratadas com diferentes ...

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Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.

Métodos para avaliar a citotoxicidade e Imunossupressão de combustível tabaco Preparações Produto

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K visualizações.  Wake Forest University Health Sciences. Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure. 

Vídeo: Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Método de aglutinação de partículas de Identificação Poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Imunologia e Infecção

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Dois métodos de formação de heterocários Descobrir Fatores de restrição HCV

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Criação e Otimização de um Setup de Alto Rendimento para o Estudo<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infecção como um modelo para a Descoberta de Drogas

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

Desenvolvimento de um Sistema Reporter vírus da hepatite B de acompanhar as fases iniciais do ciclo de replicação

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Uso de um monócito monocamada Ensaio para Avaliar a fagocitose mediada pelo receptor Fcy

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Um romance em Vitro ferida cura ensaio para avaliar a migração celular

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple organs. With the development of therapies, most patients survive the hyperinflammatory phase but progress to an immunosuppressive phase, which increases the emergence of secondary infections. Therefore, improved understanding of the pathogenesis underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive phase during sepsis is of tremendous importance. Reported here is a model to test infectious outcomes by creating double-hit infections in mice. A standard surgical procedure is used to induce polymicrobial peritonitis by cecal ligation and puncture (CLP) and followed by intranasal infection of Staphylococcus aureus to simulate pneumonia occurring in immune suppression that is frequently seen in septic patients. This dual model can reflect the immunosuppressive state occurring in patients with protracted sepsis and susceptibility to secondary infection from nosocomial pneumonia. Hence, this model provides a simple experimental approach to investigate the pathophysiology of sepsis-induced secondary bacterial pneumonia, which may be used for discovering novel treatments for sepsis and its complications.

This protocol describes techniques to measure infectious outcomes underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive condition, first by establishing cecal ligation/puncture mice then challenging them with intranasal infection to create a clinically relevant model of immunosuppression sepsis.

Projeto de ligadura cecal e punção e infecção intranasal modelo duplo de imunossupressão induzida por sepse

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Adaptando os ensaios de citotoxicidade in vivo para estudar Imunodominância em respostas de células T CD8+ específicas do tumor

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Teste in vitro ELISA para avaliar a potência da vacina antirrábica

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Métodos para avaliar a citotoxicidade e Imunossupressão de combustível tabaco Preparações Produto

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