This work was supported by R01NS075062-01A1. FACS sorting performed at UAB Comprehensive Flow Cytometry Core facility (P30 AR048311, P30 A1027767). Dr. Scott Philips from the UAB Neurobiology Core facility and Dr. Susan Nozell from UAB CDIB assisted with technical aspects of the luciferase assay.

Todos os animais foram tratados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde orientações. O tratamento ea utilização Comitê Animal da Universidade de Alabama em Birmingham aprovou o uso animal. 1. A obtenção de RNA e DNA a partir de uma Enriched astrocítica População usando fluorescente de células activadas (FACS) de astrócitos partir de tecido cerebral Whole <ol><li> Sedar animais com CO 2 durante 1 min e, em seguida, rapidamente decapitar. Dissecar córtices como descrito em Albuquerque et ai, 26.; não é necessário para remover das meninges. Nota: Ratos transgênicos expressando eGFP sob a S100β (um marcador de astrócitos) promotor foram gerados por Itakura et al 27 e utilizado para triagem de FACS astrócitos.. </li><li> Prepare homogenato de cérebro total utilizando um kit de dissociação de papaína em condições não-estéreis de acordo com o protocolo do fabricante. Calor-activar a papaina, a 37 ° C em banho-maria durante 10 min. Nota:Solução de papaína é fornecido pelo fabricante e contém L-cisteína e EDTA (Ver Tabela de Materiais). <ol><li> Cortar ou dremel um furo no topo de um tubo de 50 ml para tubos de permitir transportar 95% de O2: 5% de CO 2 a ser alimentado a um tubo cónico fechado (Figura 1A). Coloque córtices dissecadas em 10 milímetros placa de cultura contendo meio de dissociação (MEM suplementado com glucose 20 mM e penicilina / estreptomicina (500 U / ml) e equilibrou-se a 95% de O2: 5% de CO 2) e utilizar uma lâmina de barbear limpa para tecido triturado em 1 x 1 mm 2 peças. </li></ol></li><li> Tecido de transferência usando 10 ml PIPETMAN manual para tubo de 50 ml contendo solução de papaína. Permitir que o tecido para resolver a parte inferior da pipeta de transferência antes da descarga para minimizar a quantidade de mídia dissociação transitadas. Manter solução de papaína equilibrada a 95% de O2: 5% de CO 2 por meio de intercâmbio de gás de superfície para a duração da incubação. Não bolha papaína solutiligar. Incubar o tecido durante 20 minutos em 37 ° C num banho de água. </li><li> A seguir à incubação em solução de papaína, o tecido triturado 10 vezes com uma pipeta de 10 ml de transferência a uma velocidade lenta. Centrifugar a suspensão de células a 1000 x g turva durante 5 min à TA. <ol><li> Equilibrar soluo do inibidor de ADNase / albumina (fornecido pelo fabricante), através de intercâmbio de gás superficial e re-suspender as células precipitadas em 3 ml de solução / inibidor de albumina de ADNase. Prepare gradiente de densidade descontínua comercial seguindo as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Gire gradiente de densidade descontínua em 1000 xg durante 6 min. Isolar as células dissociadas a partir do fundo do tubo por sucção sedimento de fundo, utilizando uma pipeta. </li><li> Re-suspender as células dissociadas em 2-3 ml de DPBS com 0,02% de albumina de soro bovino e 1 mg / ml de DNase ou tamponadas de HEPES preferidos meios de cultura. Passe por 40 um filtro antes de FACS (Figura 2A). Manter as células no gelo até a classificação. <ol><li> Execute FACS 28. &lt;/ li&gt; <li> Células sedimento em 1,5 ml de tubos de centrífuga a 2000 xg durante 5 min a 4 ° C. Nota: astrócitos sedimentado pode ser utilizada imediatamente ou mantidas em -80 ° C até à extracção do ADN. </li></ol></li><li> Extrair RNA e DNA usando o método de isolamento preferido 29 30. Avaliar RNA e DNA e qualidade através de espectrofotómetro e 31 Bioanalyzer. Nota: Utilize apenas RNA de alta qualidade e DNA em passos subsequentes, 260/280 = 2,0-2,2 e 1,8-1,9, respectivamente. Análise Bioanalyzer é essencial para avaliar a degradação do RNA ou a fragmentação do DNA. ARN ou ADN pode ser utilizado imediatamente ou armazenado em -80 ° C ou -20 ° C, respectivamente, para os estudos subsequentes. </li></ol> 2. Avaliar DNA metilação status de um Gene usando metilação-sensível de alta resolução Melt Análise (MS-HRMA) <ol><li> Digite sequência do gene de interesse em software de mapeamento on-line preferido de metilação para identificar quaisquer ilhas CpG em genede interesse 32. <ol><li> Iniciadores design contra bissulfito convertido sequência de ADN 33 e amplificar utilizando polimerase de ADN preferida de acordo com o protocolo do fabricante. Verificar o tamanho do produto amplificado, executando um gel de agarose a 1% de ADN a 100 V durante 45 min. Loja primers na concentração estoque de 20 mM em -20 ° C. </li></ol></li><li> Bissulfito converter 500-1000 ng de ADN de cada amostra e padrões de ADN metilado que variam de 0-100% em relação à mesma espécie animal 34. Elui-se amostras para proporcionar uma concentração de 20 ng / ul. Verificar a concentração de ADN convertido por meio de bisulfito espectrofotómetro 31. </li><li> 20 ul de configuração para reacções de amplificação MS-HRM utilizando polimerase de ADN preferida e iniciadores na concentração de 5 ^ M de acordo com a Tabela 1 e 2. Executar todas as amostras, incluindo os padrões de ADN metiladas e FACS, em triplicado. </li><li> Dependendo de software de análise, definir pré e pós iniciar e parar parâmetrosem torno das transições da curva de fusão. Set começar a pré-melt e os parâmetros de paragem pré-fusão assim que a diferença entre os dois é 0,2-0,5 ° C. Definir início de pós-fusão e pós-melt parar de forma semelhante. Extrair dados de diferença de temperatura de pico para cada amostra. </li><li> Utilizar percentagem normas metilados (valor-y) e seus correspondentes diferenças médias de temperatura de pico (valor-x) gerar uma equação de regressão linear (Figura 3A-B, Tabela 3-4). Use esta equação de regressão linear para estimar estado de metilação de amostras desconhecidas 35. </li></ol> 3. Avaliação Hyper-metilado Promotor Atividade via uso de ensaio de luciferase <ol><li> Identificar ilhas CpG do gene alvo (Passo 2.1). PCR amplificar regiões de interesse 36 e clone a montante do Firefly gene repórter de luciferase luc2 para produzir plasmídeos CpG-island-luc2 37. </li><li> Linearizar 30 ug do plasmídeo CpG-island-luc2 via restriçãodigestão enzimática 38. Verifique sites para digestão de restrição e evitar cortes de casal usando software cortador de 38 preferida. Calor-inactivar enzimas, à temperatura e duração apropriada, após digestão de acordo com o protocolo do fabricante. Perda mínima de ADN ocorre durante a etapa de linearização. </li><li> Metilato de plasmídeos linearizados utilizando CpG metilase (M.Sssl) O / N a 30 ° C ou deixam protocolo fabricante seguinte sem tratamento, exceto para os seguintes ajustes. </li><li> Realizar 50 reações ul. </li><li> Use 5 unidades de CpG metilase para metilar 700 ng do plasmídeo linearizado. </li><li> Execute reações O / N para 13-19 h. </li><li> Após reacção CpG metilase, executar a limpeza do DNA usando o padrão, comercialmente membrana de gel de sílica disponíveis limpar kit de acordo com o protocolo do fabricante. Perdas significativas de DNA ocorrem após reação metilase CpG, perda de 30-60%. </li><li> Verificar a metilação dos plasmídeos através de uma digestão de restrição Hpall. </li&gt; <li> Tomar 1 ug de ADN metilado ou não metilado e digestão de restrição com Hpa II durante 1 hora a 37 ° C. Use 5-10 unidades de Hpa II para cada ug de ADN. Após a digestão Hpa II, executar a limpeza DNA usando membrana comercialmente disponível sílica-gel limpar kit preferido,. Executar tanto CpG metilados plasmídeos e não metilados no ADN de um gel de agarose a 1% em tampão TAE ou TBE a 100 V durante 45 min para visualização (figura 4B). </li><li> Plasmídeos Assunto tanto metilados e não metilados a dupla digestão com enzimas de restrição apropriadas para liberar full-length luc 2 (vector) e ilha CpG (insert) fragmenta 38. Execute dupla digestão O / N à temperatura adequada e enzimas inatividade ao calor após digestão de acordo com o protocolo do fabricante. Perda mínima de concentração de DNA ocorre durante a restrição dupla digestão. </li><li> Executar plasmídeos duplamente digerido em gel de agarose a 1% de ADN a 100 V durante 1 h para permitir a separação óF vector e inserção (Figura 4C). Cuidado. Vestindo protetor rosto protetor UV, coloque gel DNA em uma luz negra tabletop para visualizar bandas. Com base no tamanho, consumo de inserção metilado e não metilado e não metilado vector utilizando uma lâmina cirúrgica limpo. </li><li> Extracto de gel de ADN utilizando fenol saturado, pH 6,6. Resumidamente, pesar de gel contendo o vector de ADN ou de inserção. Use 100 ul de fenol por 0,1 grama de gel de ADN. Homogeneizar em gel de ADN de fenol Dounce de vidro usando homogeneizador. </li><li> Adicionar clorofórmio (utilizando 1/5 do volume de fenol) e agitar amostras por 20 s. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 2-3 minutos. Centrifugar durante 15 minutos à velocidade máxima (16,1 x 1000 x g) a 4 ° C. </li><li> Remover solução aquosa e adicionar o volume de 0,1X de 3 M de acetato de sódio e o volume de 2,5X de etanol. Incubar as amostras durante 1 hora a -80 ° C. Após a incubação, remover o etanol e re-suspender o ADN em 30 ul de tampão preferido. Perda significativa de DNA ocorre isolamento seguimento de inserções e vetores, 30-50% loss. </li><li> Re-ligar inserções metilados e não metilados para não metilado vector utilizando DNA ligase T4 38. Usar uma proporção de 1: 4 de vector para inserir para reacções de ligação. Reação de configuração de acordo com as instruções do fabricante. Utilizar um volume total de 50 ul por reacções e incubar O / N à temperatura de -20 ° C ou sobre gelo com a tampa sobre o balde de gelo. </li><li> Após a ligação, executar a limpeza DNA usando membrana comercialmente disponível sílica-gel limpar kit preferido,. Uma perda significativa de ADN ocorrem após reacção de ligação, uma perda de aproximadamente 30-50% do DNA. Verifique re-ligação, executando em 1% de gel de agarose de ADN a 100 V durante 45 min e avaliar a concentração de plasmídeos re-ligado (Figura 4D). </li><li> Transfectar plasmídeos metilados ou não metilados nas células D54 usando um reagente de transfecção comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Células D54 sementes Onto de 12 poços na placa de 0,14 x 10 6 células / poço. </li><li> Na sequência de 24 horas, as células transf with concentrações iguais de ambos (1) plasmídeo não methyated CpG-luc2 + Renilla ou outro vector controle luciferase ou (2) metilado plasmídeo CpG-luc2 + Renilla ou outro vector controle luciferase. </li><li> Permitir que as células transf durante 24 horas antes de realizar ensaio de luciferase duplo. Realizar ensaio de acordo com as instruções do fabricante. Realizar as leituras utilizando um luminómetro. Leia cada poço em triplicado. </li><li> Calcular a relação da actividade da luciferase do pirilampo ou de Renilla para outra actividade de luciferase de controlo. Normalizar Firefly metilado: atividade luciferase controle para Firefly não metilado: atividade luciferase controle dividindo atividade luciferase metilado pela atividade luciferase não metilado </li></ol>

The authors have no disclosures.

This protocol describes the isolation of an enriched population of astrocytes via FACS as well as a variety of techniques that allow for both correlative and causative studies between DNA methylation and gene expression. These techniques, used in isolation or in combination, are particularly useful for laboratories that work with tissue of high cellular heterogeneity or are interested in the DNA methylation status of a particular gene or gene region versus global DNA methylation changes. One relatively unique challenge i...

Epigenetics is the study of chemical modifications that can affect the transcriptional activity of the genome. Essentially, without a change in the DNA sequence, epigenetic modifications such as DNA methylation, histone acetylation, and histone methylation are sufficient to reversibly alter patterns of gene expression 1. DNA methylation, a potent regulator of gene expression, is the most well characterized epigenetic modification. DNA methylation is the covalent attachment of methyl groups on the C5 position of a cytosine, typically the cytosine of a cytosine-guanine dinucleotide, also known as a CpG site. Areas that contain a high density of CpG sites are known as CpG islands (CGIs). CGIs are frequently associated with transcriptional start sites (TSS) and gene promoters 1-3. Thus, while changes in DNA methylation at CGIs are not always concomitant with changes in cellular expression or function, changes in DNA methylation at CGIs can exert powerful regulation on transcriptional activity 2. 
Historically, DNA methylation was observed to be essential in embryogenesis, imprinting, and development, with little changes in the levels of DNA methylation occurring in post-mitotic cells (with the exception of alterations in cancer-related genes) 4,5. However, the field of neuroepigenetics has highlighted an important non-developmental role for DNA methylation. Specifically, cognitive epigenetics has redefined DNA methylation as a highly plastic mechanism integral in mediating both the transcriptional activation and repression of genes essential for the process of learning and memory 6. Apart from cognitive epigenetics, studies modeling ischemic injury and neuropathic pain characterize DNA methylation as a labile mechanism that responds rapidly to a variety of CNS insults 7-9. In regards to astrocytes, several lines of evidence suggest DNA methylation plays an important role in astrogliogenesis. Fan et al., found that conditional KO of DNMT1 in neural progenitor cells (NPCs) resulted in precocious development of astrocytes concordant with a global state of hypomethylation 10. Additionally, Perisic et al., concluded differential levels of DNA methylation of the GLT-1 promoter mediated differential levels of expression of the glutamate transporter in the cortex and cerebellum, emphasizing a role in DNA methylation in establishing brain-region specific patterns of astrocytic gene expression 11. Overall, numerous studies underscore the dynamic and labile nature of DNA methylation in the CNS as environment, drugs, and injury have all been shown to change DNA methylation and often, gene expression 4,9. Together, these neuroepigenetic studies point to DNA methylation as a feasible therapeutic target with the potential to mitigate a variety of CNS pathologies.
As the field of epigenetics expands its understanding of the role of DNA methylation in neurodevelopment and disease, the challenge of moving DNA methylation towards a therapeutic target is performing not only correlative, but causative studies that define specific gene targets and sites. Additionally, surveying changes in DNA methylation specific to brain region and cell type remains an ongoing and time worthy challenge unique to the field of neuroepigenetics. This protocol utilizes a variety of techniques including fluorescence-activated cell sorting (FACS) of astrocytes, methylation-sensitive high resolution melt analysis (MS-HRM), and a methylation luciferase assay to investigate the DNA methylation status of KCNJ10, a gene that encodes for Kir4.1. Kir4.1 is a glial specific potassium channel that demonstrates both brain region and cell specific patterns of expression in the CNS 12-16. Kir4.1 expression increases moving from rostral to caudal CNS regions, with the highest expression occurring in the spinal cord 15. Although the channel is expressed in ependymal cells, oligodendrocytes and their precursor cells, Kir4.1 is predominantly expressed in astrocytes and thought to be essential for maintaining homeostatic levels of potassium as well as supporting glutamate uptake by setting the astrocytic resting membrane potential at a hyperpolarized -80mV 12,16-19. Importantly, the expression of Kir4.1 is non-static both during development and following multiple forms of CNS injury 20-25. We wished to examine the epigenetic regulation of this channel, specifically in astrocytes during development. The techniques utilized offer gene-specific and targeted CpG site analyses that provide causal evidence for a role of DNA methylation in regulating KCNJ10 gene expression. These techniques can be applied to other genes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Primer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>online</td>
			<td>software to localize CpG Islands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Premixed Calibration Standard</td>
			<td>EpiGenDx</td>
			<td>80-8060R-Premix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG Methylase (M.Sssl)</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction&#160;</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Used for gel extraction and DNA cleanup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB cutter</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>online</td>
			<td>verify restriction digest sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luc2 vector, pGL4.10</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>renilla vector, pGL4.74</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TD-20/20 Luminometer</td>
			<td>Turner Designs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine LTX and Plus Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A12621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, saturated pH 6.6/6.9</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 17501-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeltDoctor Master Mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4415440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Melt (HRM) Software v2.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4397808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB SDS software v2.3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>online</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB High Resolution Melting Getting Started Guide&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>online</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB 7900HT Fast Real-Time System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlating gene-specific dna methylation changes with expression and transcriptional activity of astrocytic kcnj10 (kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Uma população enriquecida dos astrócitos foi adquirida via FACS classificação de eGFP-S100β animais transgênicos 27. Devido à diminuição da qualidade das células e moléculas moleculares isoladas de animais com idade superior a 50 dias pós-parto (p50), animais com idade p0-p40 são ideais para tais experimentos. Tecido cortical foi usada para estas experiências. Córtices de dois a seis animais foram reunidas. FACS foi realizada nas instalações UAB Comprehensive Citometria de Fluxo Core. Triage...

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Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Correlacionando DNA Alterações metilação específico do gene com expressão e transcrição Atividade de astrocítica<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

correlating-gene-specific-dna-methylation-changes-with-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

7.9K visualizações.  University of Alabama at Birmingham. DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression. 