Este protocolo pode ajudar a compreender os mecanismos envolvidos na regulação do KCC2, avaliando diretamente a sua fosforilação do tamanho molecular da quinase, lançando assim luz sobre as suas funções e atividades fisiológicas. Pode ser usado para identificar e caracterizar moléculas como proteínas de interesse a partir de misturas complexas de moléculas relacionadas, mesmo quando uma expressão de proteína é muito pequena. A técnica é uma ferramenta essencial para a análise de proteínas de sistemas complexos e a identificação de potenciais mecanismos subjacentes à função ou doença aberrante do tecido.
Demonstrando os procedimentos será domingo Salomão Josias, um estudante de doutorado do meu laboratório. Comece por pré-armar todos os reagentes no banho de contas de 37 graus Celsius e descongelar as células do rim embrionário humano KCC2b de rato KCC2b de forma estável completamente no banho de contas. Em seguida, transfira as células do tubo do frasco para injetáveis criogênico para um tubo de centrífuga contendo cinco mililitros de meio fresco e centrifugar as células a 1.200 G por três a cinco minutos.
Depois de aspirar o sobrenadante usando uma pipeta aspiradora fixada a uma bomba de vácuo, ressuspenda as células em 10 mililitros de meio fresco. Transfira a suspensão para uma placa de prato de 10 centímetros e deixe-a crescer por 48 horas em uma incubadora com temperatura de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Uma vez que as células atinjam 90% de confluência, divida-as aspirando o meio antigo e enxaguando-as com dois mililitros de PBS.
Adicione dois mililitros de tripsina e incube-os por cerca de um a dois minutos à temperatura ambiente. Lave as células tripsinizadas usando dois mililitros do meio completo. Adicione nove mililitros de mídia fresca aos novos pratos.
Em seguida, adicione um mililitro de solução do prato velho ao prato novo. Transfira os pratos de células divididas para a incubadora por 48 horas para atingir mais de 90% de confluência. Trate as células com sulfóxido de dimetilo, oito estaurosporinas micromolares ou N-etilmaleimida 0,5 milimolar por 15 minutos antes de colher em tampão de lise.
Aspirar o meio do prato de cultura transectado, colocar os pratos de cultura no gelo e lavar as células com PBS gelado. Aspirar o PBS e adicionar 1,0 mililitros de tampão de lise gelada ao prato. Depois de raspar as células do fundo do prato usando um raspador de células de plástico frio, transfira a suspensão da célula para um tubo de microcentrífuga colocado no gelo, seguido de agitação constante por 30 minutos a quatro graus Celsius.
Depois de centrifugar os lisados celulares em uma centrífuga fria, coloque-a no gelo. Colete o sobrenadante em um tubo fresco pré-resfriado e descarte o pellet. Pipeta 300 microlitros de Proteína G Sefarose em um tubo de microcentrífuga.
Em seguida, centrifugar a solução a 500 G durante dois minutos. Depois de descartar o sobrenadante, adicione 500 microlitros de PBS e o vórtice bem. Descarte o sobrenadante após centrifugação e repita a etapa.
Em seguida, misture um miligrama de anticorpos anti-KCC2 treonina 906 e anti-KCC2 treonina 1007 com 200 microlitros de contas de proteína G Sepharose antes de completar o volume para 500 microlitros com PBS. Depois de agitar em uma plataforma vibratória ou roda giratória por duas horas a quatro graus Celsius, repita duas lavagens com PBS. Realizar a quantificação de proteínas nos lisados celulares e adicionar um miligrama do lisado celular às contas lavadas e incubar em um rotador de ponta a ponta antes de girar.
Dê três lavagens com PBS contendo 150 milimolares de cloreto de sódio, seguidas de três lavagens com 200 microlitros de PBS antes de ressuspender o pellet final em 100 microlitros de tampão de amostra SUD. Agite os tubos num agitador de rotor à temperatura ambiente durante cinco minutos. Incube-os em um bloco de aquecimento e centrifuga-os antes de usar o sobrenadante para o carregamento do gel.
Monte o aparelho de fundição Western Blot e despeje o gel de separação a 8% recém-preparado para moldar o gel, permitindo cerca de dois centímetros de espaço a partir do topo do vidro de fundição. Adicione 200 microlitros de isopropanol absoluto à configuração e deixe-o repousar à temperatura ambiente durante 60 minutos. Retire o isopropanol usando uma pipeta e lave cuidadosamente o gel com cerca de 200 microlitros de água destilada.
Depois de adicionar o gel de empilhamento a 6% recém-preparado à configuração de fundição, encaixe suavemente no pente do poço e deixe repousar à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, fixe o gel fundido no tanque de eletroforese. Depois de despejar o tampão de corrida no tanque, carregue cinco microlitros de marcador de peso molecular no primeiro poço e uma quantidade igual de proteína em cada poço do gel SDS-PAGE.
Encha os poços vazios com LDS e passe o gel por cerca de 90 a 120 minutos a 120 volts. Reidratar a membrana de nitrocelulose com tampão de transferência contendo 20% de metanol. Lave o gel e a membrana com o tampão de transferência e espalhe-os suavemente na pilha de preparação.
Organize o sanduíche a ser transferido nesta ordem: eletrodo negativo, espuma de sanduíche, papel de filtro enxaguado gel SDS-PAGE, membrana de nitrocelulose enxaguada, papel de filtro, espuma de sanduíche, eletrodo positivo. Uma vez feito, empilhe o sanduíche montado no tanque de transferência e corra a 90 volts por 90 minutos ou 30 volts por 360 minutos. Bloqueie a membrana seca por uma hora à temperatura ambiente usando um tampão de bloqueio.
Incubar as membranas com diluições apropriadas de anticorpo primário e beta-actina em tampão de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, dê três lavagens de TBST por cinco minutos cada. Incubar a membrana lavada com um anticorpo secundário diluído em um tampão de bloqueio por 60 minutos e repetir três lavagens de TBST.
Uma vez feito, coloque a membrana lavada na placa de imagem. Para desenvolver os sinais, espalhe a solução preparada misturando volumes iguais de cada reagente de quimioluminescência aprimorado na membrana antes de transferir a placa de imagem para o sistema de imagem para geração de imagens. O tratamento de células HEK293 com estaurosporina e N-etilmaleimida ou NEM causou diminuição da fosforilação nos locais-alvo do SPAK, treonina 233 situada no domínio da quinase T-loop e no sítio de fosforilação S-loop serina 373 do SPAK endogenamente expresso.
A estaurosporina reduziu a fosforilação da serina 940 em células HEK294 expressando KCC2b de forma estável, mas o NEM aumentou significativamente sua fosforilação. Além disso, a estaurosporina diminui a fosforilação no sítio da treonina 505, enquanto o NEM causou um ligeiro, mas insignificante, aumento da fosforilação no mesmo local. Os efeitos diferenciais de ambos os compostos na fosforilação da proteína quinase C no sítio da treonina 505 e do KCC2b no sítio da serina 940 correlacionam-se bem.
O resultado representativo também mostrou que o NEM causou um aumento significativo na expressão da quantidade total de KCC2, enquanto a expressão do NKCC1 total e do SPAK não foram significativamente alterados quando tratados com ambos os compostos. Além disso, os dois compostos causaram uma diminuição da fosforilação do SPAK nos sítios treonina 233 e serina 373, e isso se correlacionou com a fosforilação abreviada de treonina 906/1007 e treonina 203/207/212 e NKCC1 expressa endogenamente, respectivamente. Além disso, a estaurosporina e o NEM reduziram e aumentaram a fosforilação da proteína quinase C no sítio da serina 940 e KCC2b expressos de forma estável, respectivamente, o que se correlacionou com a redução e o incremento na fosforilação da proteína quinase C delta no local da treonina 505 após o tratamento com estaurosporina e NEM, respectivamente.
Se um anticorpo primário ou secundário inadequado for usado, a banda não será vista durante a imagem. Além disso, o sinal pode não ser visível se uma concentração muito baixa de anticorpos for usada. A técnica é uma ferramenta relevante na análise quantitativa de proteínas e tem permitido seu uso para diversos fins científicos e de recursos, inclusive como uma ferramenta eficaz de diagnóstico precoce.
