This research was performed while the author (JAM) held a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratories. Co-author MW held a Wright Scholar Fellowship supported by the Air Force Office of Scientific Research. This work was supported by Air Force Office of Scientific Research, Air Force Research Laboratory, and Bio-X Strategic Technology Thrust.

1. Biblioteca e Primer Projeto e Síntese <ol><li> Projete a biblioteca inicial e primers (este tópico foi revisado em publicações anteriores extensivamente) 25,26. <ol><li> Sintetizar as seguintes sequências para este estudo, utilizando a química do fosforamidito padrão: Biblioteca: GAATGGATCCACATCCATGG-N 40 -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA Primer Forward: GGAATGGATCCACATCCATGG Primer reversa: Biotina-AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA </li><li> Conceber as sondas de captura de cDNA para ser complementar à região 5 &#39;da biblioteca. Escolher o comprimento inicial por análise de software de temperatura de fusão em linha para proporcionar uma temperatura de fusão ligeiramente acima RT, com cada base subsequente fornecimento de um aumento da temperatura de fusão. mer Captura Probe: CCATTCC-Biotina mer Captura Probe: TCCATTCC-Biotina mer Captura Probe: ATCCATTCC-Biotina </li></ol></li><li> Purifica-se a biblioteca por HPLC padrão. A dessalinização é suficiente para os iniciadores e sondas de captura. Reconstituir oligonucleótidos em água livre de nuclease na concentração desejada e armazenar a -20 ° C durante até vários meses. </li></ol> 2. Tampão, Biblioteca, e Preparação de Amostras <ol><li> Preparar 500 ml de tampão ou em água Millipore grau livre de nuclease, com concentrações de 50 mM Tris, 137 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, pH 7,4. Filtra-se o tampão através de uma membrana de 0,2 um estéril; armazenamento é possível em condições ambientes durante meses. <ol><li> Em alternativa, utilizar outros tampões tais como PBS (tampão fosfato salino), HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico), etc. </li></ol></li><li> Configure dois thermomixers; definir uma a 95 ° C e manter o outro em condições ambiente (~ 20 ° C no presente trabalho). Prepare um balde de gelo. </li><li> O calor / pressão arrefecer a biblioteca de ADN, colocando biblioteca 100 ul (~ 2,5 nmol por 10 15 -10 16 sequências) na termomisturador definir umt 95 ° C durante 5 min. Colocar o tubo no gelo enquanto as esferas magnéticas são preparados (seções 3.1-3.6). Determinar a concentração real da biblioteca de ADN por absorção de UV a λ = 260 nm, e aplicando o factor de conversão apropriada para a biblioteca. </li><li> Preparar as soluções de reserva alvo num meio apropriado para a solubilidade alvo. <ol><li> Prepare 100 ações de analitos mM em DMSO. Estas reservas são viáveis ​​durante aproximadamente 1 mês, quando armazenada à temperatura ambiente, mas diferentes objectivos demonstrar diferentes perfis de degradação. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de grânulos magnéticos e rodada inicial de Seleção <ol><li> Vortex 6,7 x 10 8 / mL de esferas de esferas magnéticas revestidas com estreptavidina e remover 400 ul a um tubo de microcentrífuga novo. Colocar o tubo sobre o magnete durante 2 min e remove-se o sobrenadante. </li><li> Lavar os grânulos por adição de 400 ul de tampão de ligação, vortex, e aspirando o sobrenadante após a colocaçãoo tubo sobre o magneto para separar os grânulos. Repita esse processo três vezes. </li><li> Imobilizar a sonda de captura sobre as esferas magnéticas as pérolas por ressuspensão em 400 ul de tampão de ligação com 50 uM de sonda de captura (final) e incubou-se durante 10 min com agitação suave na termomisturador a condições ambientes. </li><li> Lave as contas três vezes com 400 mL de tampão de ligação, repetindo os passos de lavagem descritos na seção 3.2 para remover sonda de captura livre. </li><li> Ressuspender as contas em 400 mL de tampão de ligação. Retirar 100 ul da solução de grânulo para as etapas seguintes, e reter os restantes 300 ul a 4 ° C até ser usado para outras rondas de selecção para um máximo de três semanas. </li><li> Lave as contas duas vezes com 200 mL de tampão de ligação, tal como descrito no ponto 3.2. </li><li> Adicionar 100 ul de ADN de encaixe arrefecido secção 2.3 para as pérolas lavadas e incubar durante 30 min com agitação suave usando o termomisturador a condições ambientes. NOTA: As concentrações de DNA nas primeiras rodadas são mais elevados do que a de rodadas subseqüentes para minimizar a perda de sequência nas rodadas anteriores, onde sequências únicas são teoricamente presente. </li><li> Quantificar o ADN no sobrenadante utilizando a absorção de UV como na secção 2.3 e subtrair este a partir da quantidade inicial adicionado na secção 3.7 para avaliar a quantidade de ADN ligada às pérolas. <ol><li> Lavam-se as esferas com 200 ul de tampão, seguido por duas lavagens adicionais com 200 ul de tampão de ligação, com agitação suave num termomisturador durante 5 minutos nas condições ambientes de ligação. </li></ol></li><li> Ressuspender as pérolas em 200 ul de 100 uM alvo diluído em tampão de ligação, e girar sobre a termomisturador durante 30 minutos nas condições ambientes. Preparar as soluções de trabalho fresca no início de cada dia, antes da selecção porque foram observadas e o controlo alvo para agregar-se da solução aquosa ao longo do tempo. Manter a solução do sobrenadante que contém a sequência-alvo eluidas para um estudo mais aprofundado. </li><li> Realizar a selecção negativa após a conclusão de 1-2 rodadas adicionando 200 ul de 1 uM de progesterona para as pérolas preparadas no ponto 3.8.1. Agitar suavemente durante 30 min no termomisturador a condições ambientes. </li><li> Utilizar o suporte magnético para capturar os grânulos e descartar o sobrenadante, lavagem das pérolas duas vezes em 200 ul de tampão antes da adição de cortisol de ligação como na secção 3.9. </li></ol> 4. Acompanhamento Enrichment, PCR, e Single-stranded DNA Generation <ol><li> Adicionar a solução de sobrenadante para uma cassete de diálise para monitorizar o enriquecimento selecção. A diálise é necessário remover o cortisol a partir do ADN eluído porque cortisol está presente em concentrações muito mais elevadas do que o ADN e também tem um pico de absorção de UV, que se sobrepõe ao padrão de ADN λ UV máx = 260 nm. <ol><li> Execute esta etapa todos os outros rodada (rounds 2, 4, 6, e 8) nas primeiras rodadas de seleção. Isso reduz amostra loss quando potencialmente alguns números de cópias de cada sequência estão presentes (maior diversidade). Para obter resultados mais rápidos, métodos alternativos, tais como colunas de exclusão de tamanho podem ser utilizadas, bem. </li></ol></li><li> Dialisar cassete com amostra fresca em 250 ml de tampão de ligação, durante 2 horas em condições ambientais duas vezes. Substituir tampão e incubar a 4 ° CO / N. </li><li> Analise da piscina dialisada por espectroscopia de UV para determinar a percentagem de ADN eluído por o alvo (comparar com os resultados de secção 3.8). </li><li> Preparar um gel de agarose a 3% com 1% w / v de brometo de etídio. Neste trabalho, preparar a partir de um gel de agarose a 1,5 g, 50 ml de tampão TAE (40 mM de Tris-Acetato, EDTA 1 mM, pH = 8,0), e 10 ul de brometo de etídio. </li><li> Ciclo-optimizar a piscina dialisada através da realização de uma pequena escala de PCR (5 x 50 mL alíquotas) usando ~ 5-15 ciclos. Para os componentes de PCR, utilizar 1x tampão de PCR reaccional (todas as concentrações finais), 200 uM de dNTP, 10% de volume de reacção de DNA molde, 500 nM de cada iniciador, e 2,5U polimerase (2,5 L estoque / l). <ol><li> Executar PCR utilizando condições optimizadas, a 95 ° C durante 2 min, seguido de repetidos ciclos de 95 ° C (30 segundos), 55 ° C (30 s) e 72 ° C (1 min), seguida de 72 ° C (10 min) de extensão final e mantenha a 4 ° C. </li><li> Empregar uma escada padrão 25 pb para comparação e visualizar em um imager gel. Selecione o número de ciclos que produz a banda intensidade maior no marcador tamanho correto, sem subprodutos indesejáveis. </li><li> Analisar os resultados da optimização do ciclo através da combinação de 10 ul de cada ciclo de PCR com 2 ul de corante de carga de 6x azul / laranja, e o carregamento na 5 cavidades separadas do gel de agarose a 3%, preparado no passo 4.4 (125 V durante 45 min). </li></ol></li><li> Realize uma PCR em larga escala utilizando as condições e número do ciclo adequado determinado no ponto 4.5. Tipicamente 6-8 ml de reacções de PCR foram requeridos para obter o 1-2,5 nmol utilizado para cada rodada nesta selecção. Utilize tubos de 8 tiras para simplificarmanipulação dos diversos tubos necessários para este volume aliquotar para amplificação por PCR. </li><li> Preparar um gel de agarose a 3% como descrito na seção 4.4, e validar que a banda PCR aparece no local correto, seguindo os passos das secções 4.5.2-4.5.3. </li><li> Converso todo o produto de cadeia dupla de DNA secção 4.7 para DNA de cadeia simples por os passos descritos abaixo: <ol><li> Adicionar 300 ul de contas revestidas com estreptavidina (não magnético) a uma pequena coluna bloqueada por fritas. Lave as contas com 5 ml de tampão de ligação, anexando uma seringa luer-lock e aplicar pressão suave para o êmbolo. Remover a seringa a partir da coluna e remover o êmbolo da seringa fora de linha após a adição de cada material de modo que os grânulos não são perturbados por aspiração do êmbolo. </li><li> Adicione o produto de PCR e passá-lo através da coluna usando uma leve pressão sobre o êmbolo. Use várias colunas de modo a que não mais de 1-1,2 ml de produto de PCR é adicionado a cada coluna. Descarte a fl definitivaow através de uma vez que o ADN será retido na coluna por a porção de biotina na cadeia anti-sentido. </li><li> Lavar a coluna com 5 ml de tampão de ligação. </li><li> Dehybridize o DNA pela adição de 0,5 ml de 0,2 M de NaOH. Reter o fluido, pois ele contém o single DNA sentido encalhado. </li></ol></li><li> Dessalinizar a ssDNA em NaOH 0,2 M, adicionando os 0,5 ml a uma coluna de dessalinização preparado por uma lavagem com água livre de nuclease. Descarte a 0,5 ml de fluido inicial, em seguida, adicione água livre 1 ml nuclease e recolher essa amostra ssDNA dessalinizada. O uso de múltiplas colunas de dessalinização será requerido para cada 0,5 ml porção. <ol><li> Determinar a concentração de ADN eluído por absorção de UV a 260 nm = λ. </li><li> Aspirador de secar a amostra e reconstituir num volume apropriado de tampão de ligação. Se não havia DNA suficiente obtida para a próxima rodada de seleção, repita seções 4.6-4.9.2. </li></ol></li></ol> 5. rodadas subseqüentes de Seleção e Seqüenciamento <ol><li> Ajuste o rigor das condições de seleção, dependendo dos resultados da monitorização de enriquecimento (seção 4.1). Geralmente, tornar as condições mais rigorosas em sucessivas fases de selecção, a fim de selecionar o mais alto ligante de afinidade da piscina. NOTA: Este pode envolver uma combinação de aumentar a concentração de ADN, aumentando o número, a hora, ou o volume dos passos de lavagem, diminuindo a concentração de alvo, aumentando a concentração do composto-selecção negativa, ou uma variedade de outros métodos 27. <ol><li> Aplicar um controlo adequado, como apropriado para garantir a especificidade das sequências para a molécula alvo. Neste trabalho, aplicar uma molécula de selecção negativa (progesterona) para o sistema (Tabela 1), com início na ronda 3, e o aumento na concentração de toda a selecção. A partir de 11 rodada, pré-incubar a piscina DNA para 30 min com 10-20 mM progesterona antes da imobilização sobre as contas (antes da seção 3.7). </li&gt; <li> Aumentar o comprimento da sonda de captura após enriquecimento máxima é observada. </li></ol></li><li> Prepare a piscina final (rodada 15) e outras piscinas representando maximamente enriquecido (round 13) e minimamente enriquecido (redondo de 6) As condições para a sequenciação por PCR com oligonucleotídeos compatíveis e uma polimerase de alta fidelidade. <ol><li> Configurar um volume de 50 mL de reação utilizando concentrações finais de 1x (tampão de reação), 200 um (cada dNTP), 400 nm (cada primers), 0,5 l de piscina DNA e 0,5 l de polimerase. Ciclo optimizar para cada rodada utilizando os passos descritos na secção 4.5, utilizando as mesmas condições de PCR, com a excepção de um porão 7 min a 72 ° C durante a extensão final. </li><li> Enviar 50 ul de piscinas preparadas para uma instalação de seqüenciamento em microtubos com tampas bem vedadas com filme não adesiva. Colocar os tubos em um tubo de 15 ml embalado com plástico bolha e navio O / N com compressas de gelo para a instalação de seqüenciamento. </li></ol&gt; </li><li> Determinar o número de cópias de cada sequência a avaliar o enriquecimento da piscina sequenciado (s). <ol><li> Use o código-escrita / classificação etapas (Veja Complementar arquivo de código) para dados de sequenciamento de próxima geração no formato FASTA para determinar os números de freqüência / cópia de cada sequência repetida nos dados de todos os pools fornecidos pelo serviço de sequenciação: </li></ol></li><li> Analisar a especificidade e afinidade das sequências maior número de cópias. O tipo de interacção (proteína ou molécula pequena), as propriedades estruturais do aptâmero após ligação, e a afinidade esperada ditará qual o método é adequado. Este tópico é revisado em mais detalhes em um número de referências 1,28-30. </li></ol> 6. Síntese e AUNP Detecção <ol><li> Sintetizar os AuNPs usando o método de redução de citrato de 21. Misturar 98 ml de água Millipore com 2 ml de HAuCl 4 50 mM e de calor até à ebulição. </li><li> Adicionar 10 ml de citrato de sódio 38,8 mM comoLogo que se inicia o refluxo. Cor muda para uma cor vermelha após alguns minutos. Continuar a agitar a solução durante 20 minutos com a libertação de calor. </li><li> Permitir que a solução AUNP arrefecer até à TA e filtrar através de uma membrana de 0,2 um poliéster. Guarde todas as suspensões AUNP em uma garrafa âmbar escuro. </li><li> Calcular a concentração AUNP por absorção de UV, utilizando o coeficiente de extinção de 2,4 x 10 8 L mol -1 cm -1 31. A concentração foi de 10 nm de este trabalho, com um tamanho de 17 ± 0,6 nm determinada pela luz dinâmica de espalhamento 21. </li><li> Incubar o ADN com 10 nM AUNP durante 1 h a condições ambientes protegidos por uma folha de alumínio. Variar o volume de AUNP para fornecer a solução suficiente para permitir que todos os testes desejados para ser executada (~ 1-2 ml). As densidades de carga de 73, (moléculas de DNA por AUNP) 120 e 200 D / NP foram examinados neste trabalho, eo volume e concentração varia de acordo. </li><li> Dilui-se a solução de ADN / AUNP 1: 1 utilizando HEPES tampão (20 mM de HEPES, 2 mM de MgCl2, pH = 7,4). Permitir que a mistura se equilibre a TA coberto por folha de alumínio. NOTA: O tempo necessário para este passo terá de ser optimizada pelo pesquisador. Neste trabalho, os tempos que vão de vários minutos a S / N foram investigadas. </li><li> Prepare analito (cortisol, ácido eólico, 2 -metoxinaftaleno) soluções estoque em 100 mM em DMSO e cubra com papel alumínio. Adicione soluções iniciais fresco antes de cada experiência por diluição do stock de 100 uM numa diluição do tampão de ligação de cortisol (secção 2.1) 1/3. Diluir a solução inicial com o tampão de ligação 1/3 de tal modo que um volume constante (10 ul) de destino é adicionado para gerar uma gama de concentrações. </li><li> Optimizar a concentração de sal requerida pela adição de 80 ul da solução de ADN / AUNP com 10 ul de tampão de ligação 1/3 (referido como o &quot;branco&quot;). <ol><li> Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente, em seguida, adicionar diferentes volumes de NaCl solutde iões. Olhar para o volume de sal que induz uma mudança mal visualmente perceptível para uma cor azul após adição de sal (13-40 ul de 1 M de NaCl utilizado neste trabalho). Isto fornece um bom ponto de partida, mas pode precisar de mais ajustes na sequência dos resultados, incluindo adição de destino. </li></ol></li><li> Combinar 80 ul da solução de ADN / AUNP com 10 ul da solução de destino e incubar durante 20 min à temperatura ambiente. Utilizar uma placa de 96 poços e pipeta de canais múltiplos para analisar várias concentrações alvo em simultâneo, compreendendo sempre um espaço em branco (ponto 6.8). <ol><li> Adicionar o volume apropriado de solução de NaCl (13 mL de 1 M de NaCl foi utilizado neste trabalho) e analisar imediatamente a absorvância a 650 e 530 nm utilizando um leitor de placas. </li></ol></li><li> Traçar os resultados como a relação dos valores de absorvância (650 E / E 530) versus a concentração de alvo normalizado em relação à medição em branco. </li></ol>

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B., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+DNA+aptamers+using+Cell-SELEX.">Development of DNA aptamers using Cell-SELEX.</a> Nat. Protoc. 5 (6), 1169-1185 (2010).</li><li>Djordjevic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SELEX+experiments:+New+prospects,+applications+and+data+analysis+in+inferring+regulatory+pathways.">SELEX experiments: New prospects, applications and data analysis in inferring regulatory pathways.</a> Biomol. Eng. 24 (2), 179-189 (2007).</li><li>Thomas, J. R., Hergenrother, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RNA+with+Small+Molecules.">Targeting RNA with Small Molecules.</a> Chem. Rev. 108 (4), 1171-1224 (2008).</li><li>Jing, M., Boswer, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Methods+for+Measuring+Aptamer-Protein+Equilibria.">A Review of Methods for Measuring Aptamer-Protein Equilibria.</a> Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-12 (2011).</li><li>Sachs, E. -. F., Diederichsen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Binding of Triostin Analogues to DNA. , (2011).</li><li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+aptamer-linked+gold+nanoparticle+purple+aggregates+for+colorimetric+sensing+of+analytes.">Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes.</a> Nat. Protoc. 1 (1), 246-252 (2006).</li><li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+selection+of+DNA+aptamers+through+microfluidic+selection+and+high-throughput+sequencing.">Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (35), 15373-15378 (2010).</li><li>Martin, J. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+aptamers+by+systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+Addressing+the+polymerase+chain+reaction+issue.">Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Addressing the polymerase chain reaction issue.</a> Anal. Chim. Acta. 564 (1), 91-96 (2006).</li><li>Wiebe, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+metabolites+in+breast+cancer.">Progesterone metabolites in breast cancer.</a> Endocr.-Relat. Cancer. 13 (3), 717-738 (2006).</li></ol>

Declaração de Distribuição A: Aprovado para publicação; distribuição é ilimitada (88 ABW-2014-4103). Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O fato de que pequenas moléculas são de interesse biológico, mas constituem apenas 19% de todos os aptâmeros relatados torna métodos concebidos para a seleção de aptâmeros que são aplicáveis ​​a pequenas moléculas de grande importância. SELEX de moléculas pequenas é particularmente difícil uma vez que menos grupos funcionais, motivos estruturais, e a área de superfície estão disponíveis para interacção com as sequências de proteínas, em comparação com uma, e estima-se que menos do que 30% de todas as selecções para alvos tentativas resultaram em um aptâmero 38. Portanto, é preciso ser excepcionalmente consciente de concepção experimental e a execução a fim de seleccionar com sucesso um aptâmero a uma pequena molécula alvo. O método de selecção aptâmero descrito neste trabalho é vantajoso porque é aplicável a pequenas moléculas, sem necessidade de qualquer modificação química as quais podem alterar as suas propriedades de ligação. É também eluição com base, o que significa que uma vez que tADN que, em vez do alvo, é inicialmente ligado, em seguida, eluiu-se a partir das esferas magnéticas por o alvo, o ADN que interage com a matriz de pérolas não será amplificado para a próxima ronda de selecção porque ligantes para a molécula de interesse são libertadas para o sobrenadante tampão e ligantes de matriz inespecíficos permanecer vinculado. Por outro lado, é necessário um método de selecção negativa contra a matriz por métodos que imobilizam o alvo ao suporte sólido, cada rodada porque o ADN que interage com a matriz vai ser amplificado em adição aos ligantes alvo 1. O método atual foi concebido como uma estratégia de seleção limitada T m. Isto significa que a T m do cDNA / piscina hibridação foi mantida junto à RT. Morse utilizada uma estratégia semelhante, mas aplicada uma sonda de ADNc de 6-mer com uma T m &lt;10 ° C com condições de selecção, a 4 ° C 17. O nosso pedido era de um ensaio biosensoriamento realizada à temperatura ambiente, de modo que o comprimento do ADNc foi ajustada de acordoly. Isso mantém o rigor da selecção suficientemente baixo de modo que os potenciais ligantes não sejam perdidos por causa da interacção de ligação alvo ocorre num local remoto que não induz uma mudança conformacional capaz de destruir a ligação de cDNA. No entanto, a eficiência de particionamento do método proposto é baixa porque algumas sequências vai dehybridize unicamente com base em termodinâmica. Em contraste, Nutiu et al. Aplicado um ADNc de 15-mer, e eram apenas capazes de identificar aptâmeros para dois dos quatro alvos, possivelmente porque a T m do 15-mer foi demasiado elevada para permitir uma libertação por uma pequena molécula alvo 18. Portanto, enquanto que a estratégia de selecção actual exigirá muitas rodadas para remover as sequências de fundo, através do controlo do rigor da selecção e minimizar a perda de ligantes potenciais a probabilidade de sucesso vai ser aumentada. Muitos pesquisadores novos para seleção aptamer não têm conhecimento de aspectos importantes relacionados com a PCR depotenciais ligantes. Optimização do ciclo (secção 4.5) é necessária porque o excesso de amplificação de bibliotecas de ADN produz subprodutos não desejados (tipicamente maiores em tamanho) em números elevados de ciclo, e o produto desejado pode desaparecer completamente com um excesso de apenas 5 ciclos 39. No caso de excesso de amplificação, os produtos de PCR já não representam as sequências eluídas pelo alvo, e as possibilidades de sucesso selecção são significativamente diminuída. A Figura 4 ilustra um exemplo de ciclo de optimização rodada 5 neste trabalho. O ciclo menor produz um produto mínima banda, os aumentos da banda em montante a 8 ciclos; em 10 ciclos a banda inicia uma transição para um excesso de amplificação do produto de tamanho maior, e é quase inteiramente constituída do produto amplificado ao longo-prazo de 12 ciclos. Outro detalhe que muitos pesquisadores inexperientes em SELEX pode ignorar é que todo o conjunto deve ser ampliado em grande escala amplificação PCR (secção 4.6) no first rodada para atenuar a perda de ligantes. O número de sequências únicas possíveis a partir de oligonucleótidos 4 é N, onde 4 representa as quatro bases de ácido nucleico, e N é o número de bases da região aleatória da biblioteca. Para este trabalho, N = 40, o que resulta em um espaço de sequências de 1,2 x 10 24 possíveis sequências únicas. A 2,5 nmol de biblioteca utilizada no primeiro ciclo de selecção corresponde a 10 ~ 15 moléculas, o que significa que cada cópia de ADN é provável representado no conjunto inicial como uma sequência única. Portanto, todo o volume de DNA eluído das contas de pelo destino deve ser ampliada para manter uma cópia de cada pasta potencial para a próxima rodada de seleção. Uma vez que esta amplificação inicial ocorreu, várias cópias estão disponíveis para seleção nas rodadas seguintes, onde uma solução homogénea é assumida por amostragem. A concentração de destino também deve ser cuidadosamente considerado em cada rodada. Nutiu et al. Usoconcentração da meta de 1 mM durante todo o processo de seleção, e selecionou um aptamer ATP com K d = 600? M 18. Tanto a corrente de trabalho e a pesquisa de Morse 17 começou com 100 uM alvo, diminuindo ao longo do curso da selecção, e resultou em aptâmeros com afinidades micromolares baixas. Exatamente o que ronda o rigor deve ser aumentado (menor concentração da meta) depende de quando o enriquecimento é observado. Um outro passo crucial é a aplicação de medidas adequadas de selecção negativa de modo aptâmeros demonstrar especificidade para a molécula alvo. Quais controles são usados ​​está condicionada à aplicação pretendida do aptamer selecionado. Por exemplo, aptâmero 15-1 foi concebido para funcionar como um elemento de reconhecimento num ensaio biosensoriamento para o cortisol, assim progesterona foi usado como uma molécula de selecção negativa, porque é um precursor metabólico para o cortisol, que é encontrado nos fluidos fisiológicos 40. O aptâmero ATP seleccionado por Nutiu et al. &lt;/ Em&gt; não incluir uma etapa de seleção negativa, e interage com moléculas estruturalmente semelhantes, incluindo ADP, AMP, a adenosina, e dATP 18. Uma nota final para a consideração é que o ensaio AUNP muitas vezes requer otimização considerável para cada par aptamer / target. Olhando para o volume de sal que induz uma mudança mal visualmente perceptível em direção a uma tonalidade azul após a adição de sal é um bom ponto de partida, mas o ajuste do ponto de partida pode ser obrigado a observar a resposta. Também se verificou que o ensaio produz drasticamente diferentes respostas dependendo da concentração de tampão (o tampão de selecção pode exigir a diluição devido a elevada concentração de sais de tampões, muitas vezes origina a agregação) e composição, o grau de cobertura de DNA (Figura 3), a preparação da amostra (alguns orgânica Os solventes utilizados para dissolver o alvo pode causar um fundo alta que as máscaras de alvo de resposta), temperatura, tipo de sal e concentração, e incubatempo mento (de ambos DNA com AUNP e DNA / AUNP com alvo). Sob condições totalmente optimizadas, os resultados são tipicamente observados com um tempo de incubação de destino &lt;5 min, demonstrando o benefício de uma resposta rápida alvo da plataforma biosensoriamento AUNP. Por exemplo, na Figura 5, o tempo de incubação do aptâmero / AUNP passo foi reduzido a partir de O / N (Figura 3) e 30 min, e sal foi adicionado imediatamente (&lt;10 segundos), após a adição de destino, em vez de 20 minutos mais tarde (Figura 3 ) a uma densidade de carga de 73 D / NP. Isto aumentou a resposta de cortisol para ~ 82% mais elevado do que o espaço em branco (Figura 5A) numa concentração de 10 fiM contra o alvo ~ 40%, utilizando as condições anteriores (Figura 3). Esta resposta pode ser distinguidas a olho nu (Figura 5B). Note-se que o intervalo de linearidade da detecção de cortisol é diferente do que utilizando as condições anteriores, sugerindo que estas condições podem ser optimizadas para um desejadoalcance de detecção. Ácido eólico e 2-metoxinaftaleno (2MNP) controlos não produziu uma resposta significativa (Figuras 5A-B). Os pesquisadores devem estar cientes de que a redução destes tempos de incubação pode facilitar a resposta aumentada de analitos com a superfície do AUNP, que podem contribuir para o sinal global aprimorada (alvo) ou fundo (moléculas não-alvo). Portanto, cuidado AUNP desenho do ensaio e desempenho caracterização é necessário para cada par aptamer / target. Este processo descreve um protocolo para a selecção de pequenas estrutura de comutação de aptâmeros de moléculas que funcionam de uma plataforma biosensoriamento tais como o ensaio descrito AUNP, que requerem uma alteração de conformação do ADN para detectar a presença do alvo. No entanto, este método pode ser aplicado a outros sistemas de biossensores, tais como electroquímica ou fluorescência que funcionam na mesma premissa para virtualmente qualquer tamanho alvo. O poder do protocolo pode ser desenvolvido experimentalmente porvárias abordagens. Em primeiro lugar, o próprio processo de selecção pode ser potencialmente melhoradas através da investigação de métodos de optimização, tais como a determinação do ideal T m do cDNA / biblioteca de hibridação que proporciona uma interacção que é suficientemente fraca para interagir com uma pequena molécula alvo, mas suficientemente forte para reduzir a quantidade de fundo dehybridized exclusivamente a partir de sequências de termodinâmica. Isto vai condensar o número de ciclos necessários para a selecção, o horário de trabalho e em reduzir o consumo de reagente. Outras investigações sobre modificações ao selecção seria para determinar as concentrações mais favoráveis ​​de grânulos e de ADN, de modo que uma população diversa de sequências é exposta ao alvo, especialmente na primeira ronda. O sucesso desses experimentos de prova de princípio fornecer uma base para investir mais recursos para otimizar e adaptar o ensaio tampão AUNP de fluidos fisiológicos. Há uma necessidade legítima de uma plataforma biosensing rápida, robusta que pode function como uma ferramenta de diagnóstico do estado fisiológico de um indivíduo, e um maior desenvolvimento do ensaio AUNP no soro humano, suor ou saliva iria atender a uma esta lacuna atual.

Pequenas moléculas têm sido reconhecidos como desempenhando um papel vital em diversos processos biológicos, tais como toxicidade fisiológica ou nutrição, a sinalização celular e tratamentos farmacêuticos como a doença 1. Várias moléculas pequenas também têm sido sugeridos como biomarcadores indicativos de condições fisiológicas, incluindo o stress 2,3, fadiga 4, 5 e doença. Por exemplo, os níveis elevados de cortisol correlacionar com o stress, que pode resultar na diminuição do desempenho fisiológico e outras condições de saúde 6-8. Da mesma forma, as variações nas proporções de certos péptidos na saliva são preditivos de fadiga, onde manifestações fisiológicas incluem falta de concentração, tempo de reacção prejudicada, e redução da função cognitiva 4. Portanto, o desenvolvimento de biossensores específicos para o alvo para monitorar os níveis de moléculas pequenas pode proporcionar uma métrica de valor inestimável para avaliar as capacidades de saúde e de desempenho de um individual. Historicamente, a pequena molécula de detecção foi realizada por técnicas de separação de trabalho intensivo, ou por reconhecimento baseado em anticorpos 6,7. Mais recentemente, os aptâmeros de ácidos nucleicos 9,10 surgiram como elementos de reconhecimento que possuem vantagens distintas sobre os anticorpos em aplicações específicas. Com a sua capacidade de se ligar a um alvo que variam entre os íons metálicos 11 para tecidos 12, aptâmeros têm sido amplamente empregados como elementos de reconhecimento em plataformas biosensoriamento 13,14. Em comparação com anticorpos, aptâmeros são quimicamente sintetizados, e é, por conseguinte, simples de introduzir modificações químicas reprodutíveis para imobilização superfície ou relatórios. Aptamers podem ser selecionados com alta especificidade alvo nas condições desejadas, modificando as condições de selecção utilizados, enquanto que os anticorpos são limitados a condições fisiológicas 15,16. Além disso, aptâmeros são capazes de mais elevada densidade de ligando devido ao thEIR tamanho menor, resultando em maior eficiência alvo de sinalização em uma plataforma biosensor, ea maior estabilidade de aptâmeros permite o uso repetido e armazenamento do sensor de longo prazo 16. Os aptâmeros são gerados utilizando um procedimento conhecido como SELEX, em que uma biblioteca inicial de sequências é desenvolvida a partir de 10 13 -10 15 moléculas únicas de piscina definitiva enriquecido contendo vários (1 10 2) -10 sequências com potencial para se ligar à molécula alvo. A piscina é, em seguida, enriquecido definitiva sequenciado, e as constantes de dissociação K (d) são obtidos a partir de ensaios de as sequências mais elevados do número de cópias de ligação com a molécula alvo. Evolução da piscina para uma população final enriquecido é seguido por monitorização da percentagem da ligação do alvo em cada ronda piscina, até enriquecimento máximo é obtido. Isso ocorre ao longo de um número de rodadas evolutivos, onde sequências de ligação são divididas de nonbinders e amplacidificado utilizando a reacção em cadeia da polimerase (PCR). A capacidade de criar partições e manter efetivamente ligantes é um dos principais determinantes da eficiência da seleção e impacta diretamente as características dos aptâmeros selecionados 15. A etapa de particionamento SELEX é mais desafiador para as moléculas pequenas, uma vez que não possuem o tamanho ou a variedade de grupos funcionais que auxiliam o processo de particionamento de metas de proteína 1,15. Por exemplo, muitas plataformas de separação de proteínas dependem de tamanho ou de separação à base de carga, no entanto as propriedades de complexos ligados alvo da molécula de ADN não-pequenas são geralmente significativamente diferente do que a de sequências não ligantes, resultando em um particionamento ineficaz. Métodos alternativos de separação de SELEX pode envolver a imobilização ou a rotulagem do alvo, o que potencialmente alterar as características de ligação de uma molécula pequena. Consequentemente, o design de um processo de selecção para gerar aptâmeros para pequena molécula alvo requires consideração especial. Uma variedade de modificações têm sido aplicados com a metodologia SELEX original para aumentar a eficiência do processo de particionamento, melhorar a afinidade ou especificidade das sequências no conjunto final, ou torná-la mais receptiva a diferentes aplicações 15,16. Uma modificação SELEX capaz de seleccionar para pequenas moléculas foi concebido para gerar a estrutura de comutação de aptâmeros, ou aptâmeros que sofrem uma alteração conformacional após interacção com a molécula alvo 17,18. Num exemplo deste método, a biblioteca é hibridizado com um pequeno pedaço de DNA complementar não ligante (cDNA) imobilizado sobre esferas magnéticas 17. Após a ligação ao alvo, a mudança conformacional de sequências de ligação permite-lhes dehybridize a partir do ADNc, libertando-as para dentro da solução sobrenadante, enquanto os restantes nonbinders hibridado com o ADNc / grânulos são magneticamente e repartiu descartado. Este método é vantajosa para moléculas pequenas, pois não requer a imobilização ou a rotulagem de a molécula alvo para conseguir a separação. Aptâmeros que são capazes de estrutura de comutação de possuir uma característica valiosa para qualquer plataforma biossensor potencial que requer uma mudança na estrutura aptâmero para detectar a presença de uma molécula alvo. Especificamente, aptâmeros podem ser combinados com nanopartículas de ouro (AuNPs) para criar ensaios que funcionam com base no princípio da estrutura de comutação para produzir uma resposta colorimétrica na presença de molécula alvo após desafio sal 19,20. Num ensaio AUNP, o aptâmero de DNA de cadeia simples (ssDNA) inicialmente adsorve à superfície da AUNP e protege-lo do desafio sal. A presença do alvo induz uma alteração conformacional na aptâmero que expõe a superfície AUNP, resultando numa mudança de cor vermelho-para-azul a seguir à adição de sal. AUNP ensaios também foram exibidas para amplificar o sinal, no qual a afinidade micromolar aptâmeros pode detectar níveis alvo em ordens de magnitude inferior à constante de dissociação (K d) 21. Esse recurso é especialmente atraente para os alvos de moléculas pequenas, onde afinidades normalmente variam de baixo micromolar a concentrações milimolares 1,15. Geralmente, o ensaio também é relativamente rápido e simples de realizar, encorajar a continuação estudo de ensaios aptâmero-AUNP como plataformas de detecção de biossensor. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo universal para a seleção de mudança de estrutura aptâmeros de pequenas moléculas para aplicações biosensoriamento utilizando o cortisol marcador de stress como uma molécula representante. Um esquema de detecção biosensor AUNP é de interesse devido à sua simplicidade de operação e leitura colorimétrica, mas de mudança de estrutura aptâmeros são aplicáveis ​​às saídas da plataforma de detecção alternativos, como eletroquímica 22 ou 23 de fluorescência, que também permitem a detecção através de uma mudança na aptamer conformation em cima meta vinculativa. Comparado com os métodos anteriores, várias etapas de seleção negativos foram incorporados ao projeto 17,18, e um esquema simples de detecção de enriquecimento à base de UV foi implementado (Figura 1). Este protocolo está em contraste com o esquema de detecção de enriquecimento radioligando utilizado em métodos herdados 17. O método proposto também incorporado um aumento no comprimento das sondas de captura de ADNc utilizadas na selecção para aumentar a eficiência de separação e ajustar eficazmente o rigor da selecção após enriquecimento máxima foi observada 24. O chumbo rigor sintonizado numa percentagem total inferior de DNA eluição pela alvo na piscina final, mas resultou em números de cópias mais altos de uma seqüência que prendiam com afinidade melhorada em comparação com o número de seqüência de cópia mais alta de um primeiro turno. O número de sequência mais elevada cópia da piscina final foi aplicado a um ensaio AUNP para ilustrar que a sequência era passível de uma plataformaque requer uma mudança estrutural para indicar meta vinculativa. Este tampão de ensaio baseado mostra que a resposta do ensaio AUNP pode ser modificada alterando a densidade de ADN aplicados à superfície, e serve como prova de princípio de trabalho de dedicar futuros esforços de investigação para o desenvolvimento de pequenas moléculas à base de aptâmeros biossensores em AUNP fluidos fisiológicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="639">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:203px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dynabeads M280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112.06D</td>
			<td style="width:203px;">Compatible with DynaMag-2 Magnet</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td style="width:203px;">Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Streptavidin Sepharose High Performance</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5113-01</td>
			<td style="width:203px;">This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H4001</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Progesterone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td>P0130</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholic Acid</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1129</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NanoDrop ND-1000</td>
			<td style="width:103px;">NanoDrop</td>
			<td style="width:119px;">ND-1000</td>
			<td style="width:203px;">Replaced by ND-2000 model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris Base</td>
			<td style="width:103px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">H5135</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9888</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td style="width:103px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">63068</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">500 mL Filter System</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430769</td>
			<td style="width:203px;">0.22 &#181;m cellulose acetate membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNA Library</td>
			<td style="width:103px;">Operon</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td style="width:203px;">HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">All other DNA</td>
			<td style="width:103px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td style="width:203px;">Capture probes and primers- desalted; Aptamers- HPLC</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">R</td>
			<td style="width:203px;">Any model with&#160; temperature and mixing speed control will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn</td>
			<td style="width:103px;">Agilent</td>
			<td>600674</td>
			<td style="width:203px;">Taq polymerase can be used as well</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Agilent</td>
			<td>200415</td>
			<td style="width:203px;">Other brands will work here</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer</td>
			<td style="width:103px;">Agilent</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:119px;">200532</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">GeneAmp PCR System</td>
			<td style="width:103px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">9700</td>
			<td style="width:203px;">Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose-LE</td>
			<td style="width:103px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9040</td>
			<td style="width:203px;">&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E-1510</td>
			<td style="width:203px;">Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Empty Synthesis Columns, 1 &#181;m Expedite Style</td>
			<td style="width:103px;">Glen Research</td>
			<td style="width:119px;">20-0021-01</td>
			<td style="width:203px;">This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replacement Filters Expedite</td>
			<td style="width:103px;">Glen Research</td>
			<td style="width:119px;">20-0021-0F</td>
			<td style="width:203px;">1 &#181;m size</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Illustra NAP-25 Columns</td>
			<td style="width:103px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0852-01</td>
			<td style="width:203px;">Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">66205</td>
			<td style="width:203px;">2k MWCO used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gold(III) chloride hydrate</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">254169</td>
			<td style="width:203px;">99.999% purity is important</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td style="width:103px;">SAFC</td>
			<td style="width:119px;">W302600</td>
			<td style="width:203px;">We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SpectraMax&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">M5</td>
			<td style="width:203px;">Results were similar to Bio-TEK system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Synergy</td>
			<td style="width:103px;">Bio-TEK</td>
			<td style="width:119px;">HT</td>
			<td style="width:203px;">Results were similar to Molecular Devices system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES Buffer</td>
			<td style="width:103px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">J848</td>
			<td style="width:203px;">Any brand that makes a sterilized product will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">250 mL Filter System</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430767</td>
			<td style="width:203px;">0.22 &#181;m cellulose acetate membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV Spectrophophotometer</td>
			<td style="width:103px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;">Cary 300&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Other brands will work here</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">5 mL Syringe</td>
			<td style="width:103px;">Becton-Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309646</td>
			<td style="width:203px;">This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ThermoEC Minicell Primo</td>
			<td style="width:103px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EC320</td>
			<td style="width:203px;">Compatible with Power Supply</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Power Supply</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB300</td>
			<td style="width:203px;">Compatible with ThermoEC Minicell Primo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:203px;">Flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 Methoxynaphthalene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">148245</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Assay Plate</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3370</td>
			<td>96-well Flat Bottom, Sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for selecting structure-switching aptamers applied to a colorimetric gold nanoparticle assay

Pequenas moléculas fornecer alvos ricos para aplicações biosensoriamento devido às suas implicações fisiológicas como biomarcadores de vários aspectos da saúde humana e performance. Aptâmeros de ácidos nucleicos têm sido cada vez mais aplicado como elementos de reconhecimento em plataformas de biossensores, mas selecionando aptâmeros em direção a alvos pequenos de moléculas requer considerações especiais do projeto. Este trabalho descreve a modificação e etapas críticas de um método destinado a seleccionar, de mudança de estrutura aptâmeros para pequenos alvos molécula. Binding sequências a partir de uma biblioteca de ADN hibridado com sondas de captura de DNA complementares sobre esferas magnéticas são separadas do nonbinders através de uma mudança induzida por alvo na conformação. Este método é vantajoso porque sequências de ligação da matriz de suporte (grânulos) não irá ser amplificado, e que não requer a imobilização da molécula alvo. No entanto, a temperatura de fusão da sonda de captura e uma biblioteca é mantida a temperatura ambiente ou ligeiramente acima, de modo a que as sequências Tdehybridize chapéu baseado em termodinâmica, também estará presente na solução sobrenadante. Isso limita efetivamente a eficiência de particionamento (capacidade de alvo separado sequências de nonbinders obrigatório), e, portanto, muitas rodadas de seleção será obrigado a remover as sequências de fundo. O método relatado difere da estrutura de comutação de seleções aptamer anteriores devido à implementação das etapas de seleção negativa, monitoramento enriquecimento simplificada e extensão do comprimento da sonda de captura seguinte seleção enriquecimento para fornecer maior rigor. Os aptâmeros de comutação de estrutura seleccionadas são vantajosos numa plataforma de ensaio de nanopartículas de ouro que reporta a presença de uma molécula-alvo pela alteração conformacional do aptâmero. O ensaio de nanopartículas de ouro foi aplicada, porque fornece uma rápida leitura simples, colorimétrico que é benéfico num ambiente clínico ou implantado. Considerações de design e otimização são apresentados para o ensaio como prova de principle trabalho em tampão para fornecer uma base para uma maior extensão do trabalho em direção a pequena biosensing molécula em fluidos fisiológicos.

O rigor das condições foi inicialmente mantida baixa para reter ligantes presentes no baixo número de cópias nas primeiras rodadas. A primeira rodada, em particular, implementado o menor rigor para preservar ligantes normalmente apresentados como sequências únicas, demonstrada pelas concentrações de DNA de alta e cortisol, e da falta de etapas de seleção negativos. O sucesso desta selecção aptâmero é demonstrada pela evolução das piscinas de uma percentagem baixa eluída por o alvo (Fase 2) para uma fracção mais elevada eluída pelo alvo que permanece relativamente constante no rodadas 12-13 (Tabela 1). Este platô de DNA eluição pela alvo é tradicionalmente um ponto final na seleção (&quot;enriquecimento&quot;). No entanto, este método aumentou ainda mais o rigor da selecção após enriquecimento através do aumento do comprimento da sonda de captura de cDNA (Figura 1). Alongamento esta sonda aumenta a força da hibridação entre o CDNA e a piscina, aumentando a temperatura de fusão (Tm) do complexo, e exigindo uma maior interacção entre alvo e a sequência para libertar as sequências de ligação em solução. A primeira ronda de selecção implementado uma interacção mais fraca devido ao ADNc menos uma base G na extremidade 5 &#39;da biblioteca. Isto está de acordo com as condições de rigor geralmente mais baixos na primeira rodada, e não é esperado para afetar significativamente a seleção diferente, permitindo que os ligantes mais potenciais, bem como sequências de fundo (dehybridize baseadas em termodinâmica) para passar para a próxima fase de seleção. Estas sequências de fundo foram minimizados como a seleção continuou em direção enriquecimento através da implementação de maiores condições de rigor em rondas de selecção subsequentes. Quando o cDNA foi prolongado a partir de um 7-mer para um 8-mer em redondo de 14, a percentagem de ADN eluído por o alvo é reduzida de 15,3% para 11,1% para uma T m aumentou de 19,2 ° C a 26,7 ° C. O cDNA wnovamente prorrogado para 9-mer no round 15 com T m de 31,3 ° C, caindo do total eluído para 3,3%. Outras informações sobre o enriquecimento pode ser obtida por sequenciação de vários pools de ambos os exemplos, enriquecidas e não enriquecido, a fim de controlar a progressão das piscinas em cada ronda. Sequenciamento de próxima geração (NGS) surgiu como um método poderoso para seqüenciamento em seleção, principalmente devido maior seqüência lê (número total de sequências relatado) são obtidos em relação ao sequenciamento Sanger. Estes seqüência maior lê apresentar uma maior cobertura do número total de sequências na piscina, proporcionando uma imagem mais completa da diversidade de sequências. NGS também remove a clonagem de polarização 32, e permite a sequenciação de múltiplos conjuntos num único lote, com a adição dos códigos de barras 24,33. NGS foi usada para analisar a evolução de enriquecimento a partir de três grupos separados nesta selecção da amostra (Figura 2). Poolsda rodada 6 (ligeiro enriquecimento comparação com round 2% por eluída), redondo 13 (mais alto enriquecimento) e rodada 15 (maior rigor) foram escolhidos como pontos representativos da seleção. Os números de cópias de cada sequência única foram representados como uma percentagem do número total de sequência lê para cada pool. O topo do ranking (o mais alto número de cópias) seqüência constituía apenas 0,1% de todas as seqüências em rodada 6 (33.435 seqüências totais, 22.463 sequências únicas). Como a piscina se torna maximamente enriquecido no round 13, os melhores classificados seqüência aumenta para compor 15,4% de todo o pool (17.681 seqüências totais, 2.987 sequências únicas), 150x maior do que na rodada 6 apesar de só um ~ 5x aumento enriquecimento observado por UV . 15 redondo (28,919 sequência total lê, 2980 sequências únicas) saltou para 44,9% de todas as sequências representadas pela sequência única classificados topo, embora o controlo de enriquecimento de UV mostrou que a quantidade eluída por o alvo foi de ~ 5 vezes inferior do que a de volta 13 ( Tabela 1 </strong&gt;). Enriquecimento também é demonstrado pela menor porcentagem de sequências únicas (67% no round 6 a 10% na rodada 15) como a piscina evolui de muitos para várias sequências com a ligação potencial alvo. Além disso, a top sequência classificados no round 13 (15-3) foi a terceira sequência de número de cópias maior no round 15 depois do comprimento do cDNA foi prorrogado, e a sequência segundo classificado na rodada 13 tornou-se a seqüência do número de cópias maior no round 15 (15 -1): 15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT CACTGCAGACTTGACGAAGCTT 15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT CACTGCAGACTTGACGAAGCTT Estudos anteriores examinaram a ligação destas duas seqüências termoforese microescala e diálise de equilíbrio 24. Os resultados mostraram cortisol significativa de ligação para a sequência de 15-1 (K d = 6,9 ± 2,8 mM por diálise de equilíbrio; 16,177; 0,6 mM por termoforese microescala), enquanto uma ligação mínima foi observada entre cortisol e sequência 15-3. Isso mostra que o aumento do comprimento da sonda de captura no round 15 auxiliado no fornecimento de condições de rigor mais elevados para analisar a maior ligante de afinidade. Além disso, nem demonstrado observável sequência de ligação à molécula de selecção negativa, a progesterona, que mostra que a adição dos passos de selecção negativa foi vantajosa para o processo. O facto de um agente de ligação de afinidade mais elevada surgiram após enriquecimento máximo (determinado pelo método tradicional de se analisar a percentagem de ADN eluído pelo alvo) após elevadas condições de severidade foram aplicados em novas rondas de selecção valida o método de prolongamento do comprimento da captura de cDNA sondar pós-enriquecimento. Este resultado mostra que o seu número de cópias a partir de um pool de sequenciada e afinidade para o alvo pode estar associado apenas sob certas condições 24,34, em concontraste com um relatório prévio que implica uma correlação direta 35. Ele também destaca o benefício de monitoramento de enriquecimento através da NGS, ao invés de somente pela estratégia eluída% comum na maioria das seleções, que pode variar naturalmente de uma rodada para o próximo como condições de rigor mais elevados são aplicadas. No entanto,% eluída é útil para monitorar o enriquecimento, quando as condições semelhantes são aplicados em várias rodadas. Por exemplo, rodadas de 10/06 todos os envolvidos condições semelhantes, com nenhuma mudança significativa no enriquecimento (Tabela 1). Quando isso é observado em várias rodadas, as condições são provavelmente demasiado rigorosos para promover o enriquecimento, eo pesquisador deve diminuir rigor na próxima rodada. Por exemplo, a concentração de cortisol foi aumentada de 35 uM a 100 uM em rodadas 11-13, e o eluído% aumentou de 2,5% em rodada 10-14,5% em volta 12. Assim,% eluído pode servir como um guia para ajustar o rigor durante o curso de uma selecção quando similar condições são comparados de rodada a rodada, e pode fornecer informações complementares para NGS para determinar um ponto final a seleção. Sequência 15-1 foi aplicada a um ensaio AUNP para determinar se uma sequência seleccionada de forma a produzir uma estrutura de comutação de aptâmero seria funcionar num ensaio que se baseia numa alteração estrutural seguinte ligação para produzir uma resposta de destino. Estudos iniciais anteriores mostraram que o ensaio AUNP com 15-1 responderam ao biomarcador estresse cortisol, mas não para outros dois marcadores de stress, epinefrina e norepinefrina, ou ácido eólico, um marcador de doença hepática estruturalmente semelhante ao cortisol 24. A resposta foi observada na gama normal de cortisol livre relatado no soro humano (~ 150-600 nM) 6, validando que o aptâmero seleccionado para uma mudança estrutural após a ligação de cortisol produz uma resposta no ensaio de AUNP. Neste trabalho atual, a caracterização do sistema foi dado mais um passo, ajustandoa cobertura (densidade) de 15-1 na superfície do AUNP. Utilizando o mesmo conjunto de condições, a cobertura de ADN foi aumentada de 73 D / NP (moléculas de ADN / AUNP), a 120 D / NP e 200 D / NP (Figura 3). Ácido eólico produziu uma resposta mínima, com a excepção de 10 uM a 200 D / NP. A resposta do ensaio diminui à medida que a cobertura foi aumentou com o aumento dos limites de detecção (LOD). O LOD foi de 29,5 nM para 73 D / NP, 145,2 nm para 120 D / NP, e 27,3 M para 200 D / NP. Este resultado está de acordo com o trabalho de Smith et al., Que ilustra que a resposta de um ensaio utilizando o aptâmero AUNP cocaína diminuiu quando a cobertura aptâmero foi aumentada de 60 D / NP para 300 D / NP 36. Isto implica que o intervalo de detecção para o alvo de interesse pode ser ajustada com base em optimizar a cobertura da superfície de DNA no ensaio AUNP. Isto pode ser benéfico quando se compara, por exemplo, a gama de cortisol livre no soro humano (~ 150-600 nM) em comparação com saliva humana (~ 5-25 nM) &lt;sup&gt; 6,37. Enquanto fluidos fisiológicos são muito mais complexos do que este ensaio buffer, os resultados fornecem uma extensão no trabalho de prova de princípio demonstrando que as condições AUNP pode ser ajustado, dependendo da aplicação, e que a continuação dos trabalhos no sentido de alargar a médio e fluidos biológicos seria de interesse para a comunidade biossensor. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52545/52545fig1highres.jpg" /> Figura 1. Visão geral do método de selecção de mudança de estrutura. Uma pequena sonda de captura cDNA biotinilado é imobilizada em esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. O cDNA é complementar à região a 5 &#39;da biblioteca, a biblioteca de hibridação para os grânulos. Quando alvo é adicionado, uma mudança conformacional induzida a libertar sequências de ligação do grânulo, permitindo particionamento facilitada pela aplicação de um íman. O sobrenadante é retido para monitorizar o enriquecimento (% do ADN eluído por the de destino) por UV após diálise o alvo do DNA. Este passo só é necessário se a molécula alvo absorve na mesma faixa de UV como DNA. As sequências são então PCR amplificado e preparado para a rodada seguinte de seleção. À medida que a selecção progride, a selecção negativa é aplicada, em que as sequências eluídas pela molécula de selecção negativa são descartadas, e os grânulos com os potenciais ligantes alvo são então incubadas com alvo. O comprimento da sonda de cDNA é aumentada após o enriquecimento máximo (% eluída), para aumentar o rigor da selecção. Este número foi reproduzido com permissão da 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52545/52545fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Redondo </td><td> [Cortisol] (? M) </td><td> [Progesterona] (? M) </td><td>DNA Bound (pmol) </td><td> % Eluï¿½o por alvo </td><td> cDNA Comprimento </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 100 </td><td> 0 </td><td> 357,57 </td><td> N / D </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 50 </td><td> 0 </td><td> 145,49 </td><td> 1.4 </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 50 </td><td> 1 </td><td> 188,74 </td><td> N / D </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 50 </td><td> 5 </td><td> 336,4 </td><td> 2.3 </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 35 </td><td> 5 </td><td> 88,05 </td><td> N / D </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 35 </td><td> 10 </td><td> 303,89 </td><td> 3.1 </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 35 </td><td> 10 </td><td> 255,01 </td><td> N / D </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 35 </td><td> 10 </td><td> 236,81 </td> &lt;td&gt; 2.1 </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 35 </td><td> 10 </td><td> 318,95 </td><td> 2.6 </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 35 </td><td> 10 </td><td> 297,18 </td><td> 2,5 </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td> 147,61 </td><td> N / D </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td> 154,36 </td><td> 14.5 </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 13 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td> 150,39 </td><td> 15.3 </td><td> 7-mer </td></tr><tr><td> 14 </td><td> 75 </td><td> 20 </td><td> 247,71 </td><td> 11.1 </td><td> 8-mer </td></tr><tr><td> 15 </td><td> 50 </td><td> 40 </td><td> 409,63 </td><td> 3.3 </td><td> 9-mer </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Selecção e progressão enriquecimento por eluição 24% &lt;<html> strong&gt;. N / A (Não Aplicável) é relatado para as rodadas em que o acompanhamento de enriquecimento de diálise / UV não foi realizada em rodadas de seleção precoce para mitigar a perda de sequências de baixo número de cópias. Este quadro foi reproduzido com permissão da 24. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52545/52545fig2highres.jpg" /> Figura 2. Seleção enriquecimento determinado pelo sequenciamento de próxima geração (A) Round 6.; (B) Rodada 13; (C) adesivo 15. As sequências foram classificados de acordo com seu número de cópias. A sequência de número de cópias maior aumento de constituir um baixo percentual de toda a piscina seqüenciados em rodada 6 (0,1%) para uma alta porcentagem em rodada 15 (44,9%) como a piscina foi enriquecida para sequências de ligação de cortisol. Este número foi reproduzido com permissão da 24.et = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52545/52545fig3highres.jpg" /> Figura 3. AUNP resposta do ensaio variando de 15-1 aptâmero cobertura. A densidade do aptâmero incubadas com o AuNPs foi aumentada de 73 D / NP (triângulo vermelho), a 120 D / NP (quadrado verde) e 200 D / NP ( círculo azul). Respostas de cortisol são cores fortes, a resposta ácido eólico está em cores claras. A resposta do ensaio é melhorada por cortisol em densidades mais baixas, reduzindo assim a LD e a gama o alvo pode ser detectado dentro. As condições de maior resposta de cortisol (73 D / NP) foram caracterizados ainda na gama linear para proporcionar mais pontos dentro da gama normal esperada de cortisol livre relatado no soro humano (~ 150-500 nM) e de saliva (5-25 nM ) 6,37. A resposta mínima de ácido eólico aplicando as mesmas condições de 73 D / NP tem seren detalhado no trabalho anterior 24. Todos os lotes representam a média ± SEM para medições em duplicado ou triplicado. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52545/52545fig4highres.jpg" /> . Figura 4. Os resultados representativos de optimização do ciclo de PCR da esquerda para direita os poços representam: 4 ciclos, 6 ciclos, 8 ciclos, 10 ciclos, 12 ciclos, (nenhum modelo de DNA) negativo, 25 pb padrão escada DNA. As condições óptimas são observados em 8 ciclos, onde a banda único produto está em alta intensidade, sem excesso de amplificação produtos presentes em ciclos mais elevados. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52545/52545fig5highres.jpg" /> Figura 5. AUNP optimização do tempo de ensaio de incubação. O tempo de incubação do passo AUNP / ADN a 73 D / NP foi reduzido a partir de O / N (Figura 3) e 30 min, e a incu alvobation foi imediatamente seguida por adição de sal, em vez de depois de 20 minutos (Figura 3). (A) A resposta é observada para cortisol (diamantes azuis), mas não para o ácido eólico (círculos verdes) ou 2MNP (2-metoxinaftaleno; quadrados vermelhos). Todos os lotes representam a média ± SEM para medições em duplicado ou triplicado. (B) Da esquerda para a direita: em branco, 10 cortisol mM, 10 mM de ácido eólico, 10 mM 2MNP. Visual mudança pode ser observada a olho nu para cortisol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52545/52545fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Um método para selecionar Aptamers de comutação Estrutura Aplicado a um colorimétrico nanopartículas de ouro Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.0K visualizações.  Wright-Patterson Air Force Base. A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

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Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Biologia

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

A conversão de um ELISA de captura para um ensaio de xMAP Luminex usando um método de rastreio de anticorpos Multiplex

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inhalation Exposures

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle inhalation toxicology studies, the aerosols in a chamber housing the experimental animals must have: 1) a steady concentration maintained at a desired level for the entire exposure period; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable size distribution with a geometric mean diameter &lt; 200 nm and a geometric standard deviation &sigma;g &lt; 2.5 5. The generation of aerosols containing nanoparticles is quite challenging because nanoparticles easily agglomerate. This is largely due to very strong inter-particle forces and the formation of large fractal structures in tens or hundreds of microns in size 6, which are difficult to be broken up. Several common aerosol generators, including nebulizers, fluidized beds, Venturi aspirators and the Wright dust feed, were tested; however, none were able to produce nanoparticle aerosols which satisfy all criteria 5.
A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure system was fabricated, validated and utilized for nano-TiO2 inhalation toxicology studies. Critical components: 1) novel nano-TiO2 aerosol generator; 2) 0.5 m3 whole-body inhalation exposure chamber; and 3) monitor and control system. Nano-TiO2 aerosols generated from bulk dry nano-TiO2 powders (primary diameter of 21 nm, bulk density of 3.8 g/cm3) were delivered into the exposure chamber at a flow rate of 90 LPM (10.8 air changes/hr). Particle size distribution and mass concentration profiles were measured continuously with a scanning mobility particle sizer (SMPS), and an electric low pressure impactor (ELPI). The aerosol mass concentration (C) was verified gravimetrically (mg/m3). The mass (M) of the collected particles was determined as M = (Mpost-Mpre), where Mpre and Mpost are masses of the filter before and after sampling (mg). The mass concentration was calculated as C = M/(Q*t), where Q is sampling flowrate (m3/min), and t is the sampling time (minute). The chamber pressure, temperature, relative humidity (RH), O2 and CO2 concentrations were monitored and controlled continuously. Nano-TiO2 aerosols collected on Nuclepore filters were analyzed with a scanning electron microscope (SEM) and energy dispersive X-ray (EDX) analysis.
In summary, we report that the nano-particle aerosols generated and delivered to our exposure chamber have: 1) steady mass concentration; 2) homogenous composition free of contaminants; 3) stable particle size distributions with a count-median aerodynamic diameter of 157 nm during aerosol generation. This system reliably and repeatedly creates test atmospheres that simulate occupational, environmental or domestic ENM aerosol exposures.

A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure facility was constructed for nano-sized titanium dioxide (TiO2) inhalation toxicology studies. This system provides nano-TiO2 aerosol test atmospheres that have: 1) a steady mass concentration; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable particle size distribution during aerosol generation.

Todo o corpo de nanopartículas de aerossóis exposições por inalação

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Detecção de Vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Células por PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without breaching the collagenous basement membrane. While DCIS is a non-obligate precursor to invasive breast cancers, the molecular mechanisms and cell populations that permit progression to invasive cancer are not fully known. To determine if progenitor cells capable of invasion existed within the DCIS cell population, we developed a methodology for collecting and culturing sterile human breast tissue at the time of surgery, without enzymatic disruption of tissue.
Sterile breast tissue containing ductal segments is harvested from surgically excised breast tissue following routine pathological examination. Tissue containing DCIS is placed in nutrient rich, antibiotic-containing, serum free medium, and transported to the tissue culture laboratory. The breast tissue is further dissected to isolate the calcified areas. Multiple breast tissue pieces (organoids) are placed in a minimal volume of serum free medium in a flask with a removable lid and cultured in a humidified CO2 incubator. Epithelial and fibroblast cell populations emerge from the organoid after 10 - 14 days. Mammospheres spontaneously form on and around the epithelial cell monolayer. Specific cell populations can be harvested directly from the flask without disrupting neighboring cells. Our non-enzymatic tissue culture system reliably reveals cytogenetically abnormal, invasive progenitor cells from fresh human DCIS lesions.

Primary cell culture using intact tissue organoids provides a model system that mimics the multi-cellular in vivo microenvironment. We developed a serum-free primary breast epithelium tissue culture model that perpetuates mixed cell culture lineages and exhibits differentiated morphology, without enzymatic tissue disruption. Breast organoids remain viable for &#62;6 months.

Não enzimática, Soro livre de Cultura de Tecidos de lesões mamárias pré-invasivas para a geração espontânea de Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Análise qPCRTag - A High Throughput, PCR em Tempo Real Ensaio para Sc2.0 Genotipagem

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Concepção e desenvolvimento de aptâmero-nanopartículas de ouro Baseadas colorimétricos Ensaios para Aplicações In-the-campo

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &amp;#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

Membranas lipídicas de bicamadas tethered para monitorar a transferência de calor entre nanopartículas de ouro e membranas lipídicas

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

Análise de rastreamento de nanopartículas para a quantificação e determinação de tamanho de vesículos extracelulares

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...