Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Science Foundation Grant MCB-0718846 e Defesa Agência de Projetos de Pesquisa Avançada de contrato N66001-12-C-4020 (para JDB). LAM foi financiado por uma bolsa de pós-doutorado de Ciências Naturais e do Conselho de Investigação do Canadá Engenharia. A publicação deste artigo é patrocinado pela Roche.

1. Prepare O ADN genómico de levedura (ADNg) <ol><li> Preparar um estoque de tampão de lise de levedura 9 que contém 50 mM de Tris, pH 8,0, NaCl 100 mM, SDS a 1% (w / v), 2% de Triton X-100 (v / v), EDTA 1 mM, pH 8,0. </li><li> Como iniciar a utilização da matéria ~ 2 x 10 6 células, que geralmente corresponde a ~ 100 mL de cultura saturada para as estirpes de laboratório do BY4741 10 fundo. As células em cultura devem ser colhidas por centrifugação a 1000 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Aspirar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 200 ul de tampão de lise de levedura e ressuspender o sedimento de células por pipetagem. </li><li> Adicionar ~ 300 ul de ácido lavou-se contas de vidro de tal modo que o nível de grânulos é de cerca de 1 mm abaixo do nível da suspensão de células. </li><li> Numa hotte adicionar 200 ul de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico (25: 24: 1). Tapar o tubo de microcentrífuga e garantir que não há pérolas está preso entre a tampa eo tubo de como isso irá resultar em vazamentos durante a agitação(Passo 1.6). Inverta 3 vezes para misturar e verificar a tampa é fechada. </li><li> Agitar o tubo durante 10 minutos à temperatura ambiente utilizando um misturador de bancada, tal como um Eppendorf 5432. </li><li> Centrifugar a 20.800 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Transferência de 75 ul da fase aquosa para um novo tubo de microcentrifuga contendo 1 ml de etanol a 100%. Inverta 10 vezes para misturar. </li><li> Sedimentar o ADN por centrifugação a 20.800 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante sem desalojar o sedimento de DNA. Lavar o sedimento com 500 ul de etanol a 70%. </li><li> Centrifugar a 20.800 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante sem desalojar o sedimento de DNA e ar-secar o sedimento com o tampão de microcentrífuga aberta até que o excesso de etanol foi evaporado, o que geralmente é de cerca de 10 min. </li><li> Ressuspender o sedimento de ADN em 75 ul de Tris 10 mM pH 7,4 e vortex para misturar. Armazenar a amostra a -20 ° C indefinidamente. Medir a concentração de ADN na amostra usando umfluorímetro de bancada, tal como o Qubit, que o distingue do ADN a partir do ARN. Certifique-se de que a concentração final de ADNg é ~ 1-2 ng / ul. </li><li> Prepara-se uma diluição de 1:10 utilizando ADN genómico de água e agitar com vortex para misturar. </li><li> Aliquota de 30 ul de ADNg diluído ao poço adequado de uma placa de fonte que é compatível com um distribuidor de líquido acústico nanoescala (passo 3). Se estiver usando um Labcyte Eco 550, usar uma placa de polipropileno de 384 cavidades (placa 384PP). NOTA: Quando selado adequadamente esta placa pode ser armazenada durante pelo menos um mês à temperatura de -20 ° C. </li></ol> 2. Preparar e Dispense qPCR Master Mix em um 1536 placa com múltiplas cavidades <ol><li> Prepare 850 mL de qPCR mistura principal, como LightCycler 1536 DNA verde Mestre, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e vortex para misturar. Centrifugar a mistura principal qPCR durante 2 minutos a 20,800 xg à temperatura ambiente para remover quaisquer bolhas. Os componentes da mistura principal qPCR necessária para uma única placa de poços múltiplos 1536 são como seguems: <ol><li> Combine 170 ul de mistura principal enzima (verde Mestre Tubo 1, concentrado 5x), 42,5 ul de SYBR (verde Mestre tubo 4, 20x concentrado), e 637,5 mL de água. </li></ol></li><li> Dispensar 500 nl / poço em uma placa com múltiplas cavidades 1536 utilizando um dispensador de granéis líquidos, como o Art Robbins Cobra. (Note que os passos 2.2.1-2.2.4 se referem especificamente à Cobra.) <ol><li> Criar um programa de distribuição com as seguintes configurações: classe líquido, água; o volume aspirado, 800 ul; dispensar volumes, 500 nl; tempo de lavagem, 20 seg. Nas configurações do dispensador, verificar a velocidade de distribuição é definido para 49,6 mm / s, o deslocamento de distribuição é de 0,25 mm e o excesso de líquido aspirado será dispensado de volta para a fonte bem. </li><li> Coloque o tubo de microcentrífuga contendo a mistura principal qPCR no poço A1 do suporte do tubo de microcentrífuga, que está localizado em posição deck 1. Corte a tampa do tubo de microcentrífuga ou simplesmente deixá-la aberta. Defina o &#39;Aspirar bem&#39; para A1, editando o Aspiratdefinições e. </li><li> Executar uma etapa de lavagem antes da dispensa qPCR mistura principal por primeiro a aspirar e dispensar-seleção de etapas do programa criado no passo 2.2.2 e, em seguida, bater &#39;run&#39;. Uma vez completo, re-selecionar o aspirado e dispensar etapas antes de executar o programa completo para dispensar qPCR mistura principal. Se a Cobra foi ocioso por menos de 10 min a etapa inicial de lavagem, que serve para preparar o sistema, é desnecessário. </li><li> Hit &#39;run&#39; para dispensar qPCR master mix para cada poço. </li></ol></li><li> Recolher o master mix qPCR, na parte inferior de cada poço por breve centrifugação do 1536 placa com múltiplas cavidades (30 seg usando uma baixa velocidade PCR prato giratório). </li></ol> 3. Pipetar molde de ADN e os iniciadores para a placa 1536 Multiwell <ol><li> Dispensar 5 nl de ADNg diluída (passo 1.3) nas cavidades desejadas da placa com múltiplas cavidades 1536 usando um sistema de transferência de líquido acústico, tais como o eco 550. <ol><li> Para o echo 550, use o software Placa Reformat ou, alternativamente, fornecer um costume planilha do Excel para programar a transferência. Certifique-se a fonte selecionada para o bem gDNA no programa coincide com a fonte bem na qual você fisicamente dispensado o gDNA (passo 1.3). Escolha do Tipo de placa de origem &#39;384PP_AQ_BP2&#39;, o que indica que o líquido na placa 384PP é um tampão sem surfactantes. </li></ol></li><li> Dispensar 10 nl de iniciadores, pré-misturados para a frente e reversa para uma concentração final de 50 uM cada, nas cavidades desejadas da placa com múltiplas cavidades 1536 usando um sistema de transferência de líquido acústico, tais como o eco 550. <ol><li> Para o sistema de transferência de líquidos, use o software Placa Reformat ou, alternativamente, fornecer um costume planilha do Excel para programar a transferência. NOTA: Aqui é possível dispensar iniciadores tais que o layout da placa com múltiplas cavidades 1536 cromossómico corresponde à ordem dos iniciadores por isso é fácil de inspeccionar visualmente os resultados de PCR em tempo realdepois (passo 6). </li><li> Cereais os iniciadores numa placa que é compatível com o distribuidor de líquido acústico. Para o eco 550, usar uma placa Labcyte 384LDV (de baixo volume morto) e escolha o tipo de placa de fonte &#39;384LDV_AQ_B&#39; ao programar o eco para indicar o líquido é um buffer simples, sem proteínas. </li></ol></li></ol> 4. Seal e centrifugar a 1536 Multiwell Placa <ol><li> Utilizando um sistema de aferidor de microplacas, tal como o Plateloc Microplacas térmica Sealer, selar imediatamente a placa com múltiplas cavidades utilizando 1,536 selo opticamente claro que é compatível com o instrumento de selagem a quente. Não toque na superfície do selo para evitar marcas de sujeiras. <ol><li> Se estiver usando o Plateloc térmica Microplate Sealer, use as seguintes configurações: 2.0 sec selar tempo, temperatura do selo 162 ° C, pressão do ar de 82 psi. Este instrumento leva ~ 5 minutos para aquecer e assim deve ser ativada com antecedência. </li><li> Se estiver usando o Plateloc Microplate térmica Sealer, uma adapteR deve ser usado para elevar a altura da placa de poços múltiplos na fase 1536 do instrumento para garantir uma boa selagem. NOTA: Embora seja preferível comprar uma placa da fase para a microplaca Plateloc térmica Sealer, uma solução alternativa é inserir quatro ~ 2 mm de espessura arruelas padrão disponíveis em qualquer loja de ferragens nos cantos para levantar a altura da placa com múltiplas cavidades 1536. </li></ol></li><li> Centrifugar imediatamente a placa com múltiplas cavidades 1,536 selado a 2000 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente para recolher todos os reagentes na parte inferior de cada cavidade. </li></ol> 5. PCR em Tempo Real <ol><li> Programa de um instrumento qPCR 1536, tal como o LightCycler 1536, com um protocolo de amplificação em dois passos seguido por uma análise de curvas de fusão. Usando o software LightCycler 1536 estabeleceu um programa da seguinte forma: <ol><li> Pré-incubação: 95 ° C, 1 min a preensão, a taxa de rampa de 4,8 ° C / seg, não aquisição. </li><li> Dois passo de amplificação: 30 ciclos de [95 ° C, sem retenção,rampa taxa de 4,8 ° C / s, nenhuma aquisição; 64 ° C, 30 seg a preensão, a taxa de rampa de 2,5 ° C / seg, única aquisição]. </li><li> Derreter curva: 95 ° C, 10 seg, velocidade de rampa 4,8 ° C / seg, não aquisição; 60 ° C, 1 min, velocidade de rampa de 2,5 ° C / seg, não aquisição; 97 ° C, velocidade de rampa a 0,1 ° C / seg, 5 aquisições / ° C (contínua). </li><li> Arrefecer: 40 ° C, 30 seg, velocidade de rampa de 2,5 ° C / seg, não aquisição. </li></ol></li><li> Defina o formato de Detecção de &#39;Green intercalando Dye&#39; na guia Run Definição. </li><li> Defina o controle de pipetagem para &#39;Controle Mestre&#39; no separador Run Definição. Esta função serve como um controlo interno e detecta a presença de qPCR mistura principal em cada uma das cavidades da placa com múltiplas cavidades 1536, que é útil para identificar falsos negativos putativos. </li><li> Insira a placa com múltiplas cavidades 1536 preparado nas etapas 2-4 para o qPCR instrumento 1536 e executar o programa. </li></ol> Análise 6. Dados <ol><li> Perform inspeção visual dos dados dentro do software qPCR. NOTA: O software 1536 permite a visualização de ambos amplificação e derreter curvas, bem como um mapa de calor que mostra a chamada (positivo, negativo, inválido, N / A; Figura 2), o valor ponto de passagem (deslizante escala de cores para positivo ou cinza para negativo; Figura 3), ou um ponto de extremidade de fluorescência (EPF) valor (deslizante escala de cores). </li><li> Exportar dados do Software 1536 na forma de um arquivo .txt (resultados de mesa) ou .xml, quer com os dados brutos ou dados calculados para o processamento off-line a partir do instrumento. NOTA: O proprietário ponto de passagem automatizada (Cp) algoritmo chamando construído no software 1536 leva em conta a forma ea inclinação da curva de amplificação ao determinar chamadas de valor positivas / negativas e Cp com alta confiança, em volumes de reacção microlitro baixo sub com comparativamente baixo os valores de fluorescência. </li><li> Se o DNA LightCycler Verde Mestre estava usod para qPCR, verifique que todos os poços passou o &#39;controle mestre&#39;. Uma falha indica que o bem não recebeu qPCR mistura principal eo ponto de dados em falta deve ser considerada uma potencial falso negativo. Verifique se todos os poços passou o &#39;controle mestre&#39;. Uma falha indica que o bem não recebeu mastermix DNA e considerar o ponto de dados em falta um potencial falso negativo. </li></ol>

<ol>
	<li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome.">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li><li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design.">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li><li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization.">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li><li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit.">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li><li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-A-Gene+with+GeneDesign.">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li><li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes.">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li><li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome:+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast.">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li><li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li></ol>

LAM, NAP, JAM e JDB têm nada a revelar. RC e AL são empregados pela Roche Life Science, EUA e trabalhou no desenvolvimento da aplicação com a LAM como parte de uma prova de princípio experimento.

Incorporação de detecção em tempo real PCR para o ensaio de genotipagem PCRTag é um desenvolvimento importante para o projeto Sc2.0 pois permite significativamente maior taxa de transferência. O fluxo de trabalho anterior especificada 2,5 ul reações em 384 placas de PCR, 1,5 horas de tempo de execução ciclismo térmica, eletroforese em gel de agarose, e de anotação manual da gel. O fluxo de trabalho apresentado aqui, chamada de análise qPCRTag, supera vários dos principais pontos de estrangulamento. Primeiro, uma corrida qPCRTag condensa 4 x 384 placas de poços em um único experimento que pode ser processado, do início ao fim (placa configurar mais tempo de execução), em cerca de uma hora. É importante notar que o custo de reagente por poço para análise qPCRTag está a par com a abordagem baseada em gel de agarose rendimento mais baixo. No entanto, por electroforese em gel de contornar e anotação manual, o fluxo de trabalho qPCRTag proporciona economias substanciais em tempo e mão de obra, que são as principais vantagens. É importante ressaltar o fluxo de trabalho é qPCRTag entirely compatível com a automatização. Uma preocupação importante com a utilização de detecção em tempo real, como a saída do ensaio PCRTag é a taxa de falsos positivos e falsos negativos. Uma vez que os iniciadores PCRTag não foram originalmente concebidas para utilização em PCR em tempo real, espera-se que nem todos os pares de iniciadores será adequado para utilização com esta saída. Para este fim, é importante para a função e validar a especificidade de todos os pares de iniciadores PCRTag para excluir o subconjunto que não funcionam no ensaio com base em tempo real na frente. Por exemplo, cromossoma 3 PCRTag falsos positivos e negativos são a-e-grande reprodutível na dados de PCR em tempo real (Figuras 2 e 3) e estes podem ser excluídos de análises posteriores. Além disso, os pares de iniciadores conhecidos para falhar (avaliada por electroforese em gel e mostrado nas Figuras S6 e S7 de Annaluru et ai. 1) também podem ser excluídas. Isto é facilmente conseguido simplesmente excluding os pares de primers com defeito ao configurar o protocolo de transferência acústica. Como a maioria dos ensaios de alto rendimento, temos a intenção de usar a detecção de PCRTag tempo real como uma tela principal para identificar transformantes que merecem uma validação adicional a jusante. Posteriormente, o padrão-ouro para o rastreio secundário permanecerá análise PCRTag com eletroforese em gel como a leitura. Além da aplicação da análise PCRTag para Sc2.0, combinando sistemas de manuseio de líquido nanoescala state-of-the-art com alta taxa de transferência de tecnologia PCR em tempo real permite a análise rápida e automatizada e tem potencial para impactar muitos campos. Por exemplo, este fluxo de trabalho pode ser aplicado a alta biblioteca throughput screening, diagnóstico de doenças infecciosas, análise microbiome, e genoma de edição de ponta se aproxima de tentar modificar loci múltiplos simultaneamente.

Sc2.0, ou o Projeto Genoma fermento sintético ( <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org</a> ), fixou o objetivo de projetar e construir um genoma eucariota inteiramente sintético. Usando a seqüência do genoma altamente curadoria de Saccharomyces cerevisiae 3 como ponto de partida, cada um dos cromossomos lineares dezesseis foi re-projetado para atender um conjunto de princípios de design que especificam a manutenção da aptidão de células, melhorando a estabilidade do genoma, e aumentando a flexibilidade genética. Por exemplo, elementos desestabilizadores, tais como repetições são excluídos de cromossomos Sc2.0. Todos os casos de codões de paragem TAG são re-codificada para TAA para &quot;libertar-se &#39;um codão na estirpe final para a introdução de um aminoácido não geneticamente codificados. Além disso, um sistema de evolução induzível, precipitação, habilitado pelo sistema Cre-lox, permite a capacidade sem precedentes para gerar genomas derivativos com novas estruturas 4. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Outro grande elemento de design no genoma Sc2.0 é a introdução de PCRTags, que servem como marcas d&#39;água de ADN para permitir o rastreamento de DNA tipo sintético e selvagem. PCRTags são segmentos curtos, re-codificado em ORF nos cromossomos sintéticos; enquanto as sequências PCRTag diferem ao nível do ADN entre os cromossomas de tipo selvagem e sintéticos, as proteínas codificadas são idênticas em sequência de aminoácidos e assim, presumivelmente, a função. PCRTag sequências são especificamente concebidas como locais de ligação de iniciadores para facilitar a amplificação selectiva (Figura 1A). PCRTag desenho é efectuada utilizando o algoritmo &#39;mais diferente&#39; em GeneDesign 5,6, dando origem a sequências sintéticas recodificados que são tipicamente ~ 60% diferente do que as sequências nativas (mínimo 33%) com temperaturas de fusão entre 58 ° C e 60 ° C e amplicão comprimentos entre 200-500 pares de bases 2. A recodificação não é permitida dentro do primeiro 100 pb de cada ORF, uma vez que estas regiões são conhecidas portêm preferências especiais em termos de uso de códon 7. Juntas, essas regras de design favorecer alto desempenho de quase todos os PCRTags sob um único conjunto de condições de PCR em que pares de primers tipo PCRTag sintéticos e selvagens exclusivamente ligam e amplificar DNA sintético e nativo, respectivamente (Figura 1B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> Figura 1:. PCRTag esquema (A) PCRTags são sequências dentro de quadros de leitura aberta (ORF) de genes nos cromossomas Sc2.0 recodificados. (B) sintético (SYN) e do tipo selvagem (WT) iniciadores PCRTag vincular exclusivamente e amplificar DNA genómico tipo sintético e selvagem (gDNA), respectivamente. Mostrado aqui é uma análise de um segmento de ~ 30 kb do braço esquerdo do cromossomo seis, testando treze pares de primers PCRTag usando tanto WT ou semi-synVIL2 gDNA como modelo. Em muitos casos, uma única ORF codifica mais do que um PCRTag. Presença / ausência de amplicões PCRTag é avaliada através de electroforese em gel de agarose. Amplicons PCRTag variam em tamanho de 200 pb e 500 pb. As espécies que migram mais rapidamente na parte inferior dos painéis são dimeros de iniciadores. Análise PCRTag tem provado ser uma ferramenta importante para o conjunto de cromossomos Sc2.0. Numa experiência típica de 30-50 kb de ADN sintético, codificando 20-30 PCRTags, é transformado em células de levedura para substituir o tipo selvagem correspondente ADN 1,2,8. Análise PCRTag é então utilizado para identificar transformantes que codificam PCRTags tipo sintético, mas não selvagem abrangendo esse segmento de DNA, ou os chamados &quot;vencedores&quot;. Geralmente é necessário testar vários transformantes para identificar &quot;vencedores&quot;, de modo a produtividade e custo da análise PCRTag são considerações importantes. Actualmente dois cromossomas Sc2.0 foram concluídos (synIII 1 e synIXR 2), representando menos de 10% do genoma Sc2.0, altHough mais de metade dos cromossomas restantes estão actualmente em fase de síntese e montagem. A escala de análise PCRTag necessário para este projeto está rapidamente superando a capacidade de executar géis e marcar manualmente a presença de DNA sintético e ausência de DNA tipo selvagem. Para melhorar o rendimento do ensaio PCRTag temos desenvolvido um trabalho utilizando PCR em tempo real para contornar a utilização de electroforese em gel de agarose. O fluxo de trabalho faz uso de um distribuidor de líquido para distribuir grandes quantidades de qPCR mastermix em cada poço de uma placa com múltiplas cavidades 1536, um distribuidor de líquido em nanoescala acústico para transferir ADN molde e iniciadores, e um termociclador 1536 qPCR, permitindo-nos para miniaturizar reacções a 500 nl maximizar o rendimento. Além disso análise pode ser automatizado. Este tipo de protocolo de genotipagem de alto rendimento deve ser generalizado a qualquer projecto requer uma análise de vários clones em loci múltiplos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Yeast gDNA prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast gDNA</td>
			<td>custom</td>
			<td>custom</td>
			<td>template for real time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-washed glass beads (0.5mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5432 Mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5432</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621807</td>
			<td>yeast cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte 384PP plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>P-05525</td>
			<td>gDNA source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DNA Green Mastermix prep and dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 DNA Green</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5573092001</td>
			<td>real time PCR mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL Microfuge Tube Holder</td>
			<td>ARI</td>
			<td>EST BD060314-1</td>
			<td>microfuge tube holder for deck of Cobra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5358639001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobra liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>630-1000-10</td>
			<td>dispense qPCR master mix into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Spinner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89184-608</td>
			<td>cenrifugation of 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Template and primer dispensing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRTag primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>custom</td>
			<td>premixed forward and reverse, [50uM] each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempPlate pierceable sealing foil, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2923-0110</td>
			<td>temporary seal for PCRTag primer plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte LDV 384 well plate</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>LP-0200</td>
			<td>pre-mixed primer source plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550 Liquid Handler</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plateloc Thermal Microplate Sealer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-90001</td>
			<td>heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Permanent Seal</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>24212-001</td>
			<td>optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G5402-20008</td>
			<td>can substitute ~2mm thick washers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>Thermo Scientfic</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td>centrifuge heat sealed 1536 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Industrial Air Compressor</td>
			<td>Jun Air</td>
			<td>1795011</td>
			<td>to run the Echo and Heat Sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Real Time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1536</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>requires 220V outlet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcrtag analysis - a high throughput, real time pcr assay for sc2.0 genotyping

O Projeto Genoma fermento sintético (Sc2.0) pretende construir 16 grife cromossomas de levedura e combiná-los em uma única célula de levedura. Até à data, um cromossoma sintético, synIII 1, e um braço cromossoma sintético, synIXR 2, foram construídos e a sua função in vivo validado na ausência dos cromossomas de tipo selvagem correspondentes. Uma importante característica do modelo de cromossomas Sc2.0 é a introdução de PCRTags, que são sequências curtas, re-codificada dentro de quadros de leitura abertos (ORFs) que permitem a diferenciação dos cromossomas sintéticos dos seus homólogos de tipo selvagem. PCRTag iniciadores emparelham selectivamente, quer cromossomas de tipo selvagem ou sintéticos e a presença / ausência de cada tipo de ADN pode ser testada usando um ensaio de PCR simples. A leitura do ensaio padrão PCRTag é avaliar a presença / ausência de produtos de amplificação por electroforese em gel de agarose. No entanto, com uma densidade PCRTag amplicão média de um por 1,5 kb e agenome tamanho de ~ 12 Mb, o genoma Sc2.0 concluído irá codificar cerca de 8.000 PCRTags. Para melhorar o rendimento, temos desenvolvido um ensaio de detecção baseado em PCR em tempo real para PCRTag genotipagem que chamamos análise qPCRTag. O fluxo de trabalho especifica 500 nl reações em uma placa com múltiplas cavidades 1536, o que nos permite testar até 768 PCRTags com dois pares de primers tipo sintéticos e selvagens em um único experimento.

Testamos sintético e selvagem tipo cromossomo 3 pares de primers PCRTag 1 com ADN genómico de levedura (gDNA) extraído de quatro estirpes diferentes. Cromossoma 3 tem 186 pares de iniciadores PCRTag que abrangem o comprimento do cromossoma (synIII é ~ 270 kb do cromossoma e tipo selvagem é 3 ~ 315 kb). Para testar cada uma das quatro cepas com ambos os conjuntos de iniciadores, que divide a placa com múltiplas cavidades em quatro quadrantes, um para cada tipo de ADNg, atribuindo PCRTag iniciadores sintéticos para a metade superior de cada quadrante e de tipo selvagem para a metade inferior. O ADN genómico foi extraído a partir das estirpes de levedura, dois dos quais codificam tipo selvagem cromossoma 3 (tipo selvagem, synIXR 2), enquanto no cromossoma dois restantes codificam sintético 3 (synIII 1, synIII synIXR). qPCR mistura principal foi distribuído por cada poço de uma placa com múltiplas cavidades 1536 utilizando um distribuidor de líquido em massa, seguido de ADNg e PCRTag iniciadores utilizando o eco 550. Os iniciadores foram dispostas de forma idênticacada quadrante da placa com múltiplas cavidades para comparação visual fácil. A placa com múltiplas cavidades foi então selada a quente com um selo opticamente clara e sujeito a análise por PCR em tempo real. Nesta experiência observou-se qPCRTag, na sua maior parte, a amplificação como se espera, em que os iniciadores de síntese exclusivamente amplificado de ADN sintético e vice-versa (Figuras 2 e 3). No entanto, também observamos vários desvios do padrão esperado, sugerindo falsos negativos e falsos positivos no conjunto de dados. Nesta experiência, o controlo principal foi detectada em 100% dos poços, indicando a distribuição de líquido de massa dispensada com sucesso mastermix em cada poço na placa (dados não mostrados). Isto exclui uma fonte potencial de falsos negativos. Além disso, alguns cromossoma 3 PCRTags falha de forma conhecida (mostrado nas Figuras S6 e S7 de Annaluru et ai. 1), incluindo, pelo menos, 2 sin e um WTpares de iniciadores; Assim, estes poços podem ser ignorados em cada quadrante. Falsos negativos verdadeiros podem surgir a partir de uma falta de transferência de ADNg molde ou iniciadores, na nossa experiência no entanto, dada a calibração correcta do eco 550, bem como a preparação de ADNg e iniciadores tal como descrito, isto não tem sido uma das principais fontes de erro. No geral neste experimento a taxa de falsos negativos foi extremamente baixa para primers WT com modelo WT (~ 2%), embora um pouco maior para os iniciadores com SYN SYN DNA (~ 8%). Os falsos positivos, a detecção de sinal nos poços onde iniciadores SYN são misturados com WT ADNg (e vice-versa), pode surgir a partir de amplificação cruz ou dimeros de iniciadores. Com efeito, os dímeros de iniciadores são frequentemente visíveis por electroforese em gel (Figura 1B) e representam uma fonte de erro razoável. Para a aplicação de qPCR, a análise das curvas de fusão pode ser útil para determinar se diferentes espécies, tais como dimeros de iniciadores, podem estar a contribuir para um sinal. Além disso, performing uma experiência de controlo em que os iniciadores são dispensadas na ausência de molde de ADN pode ajudar a identificar os iniciadores com uma propensão para dimerizar. Cruz amplificação pode ser observado por electroforese em gel, em particular se também muitos ciclos de PCR são executadas ou se a temperatura de hibridação é muito baixa. Tentamos minimizar o número de falsos positivos devido a amplificação cruzada por meio da otimização ambos os parâmetros para o protocolo qPCRTag. Finalmente, examinando os valores de ponto de cruzamento (Cp) para cada poço pode ajudar a identificar iniciadores que não são adequados para a detecção com base em tempo real (Figura 3, por exemplo, BB22, Fb22, Bb46, Fb46). No geral neste experimento a taxa de falsos positivos foi baixa para primers SYN com modelo WT (~ 5%) e maior para primers WT com modelo SYN (~ 10%). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> Figura 2: Placa mapa de calor exibindo presença / abNesse aspecto chamada para um experimento qPCRTag. Quatro tipos diferentes de DNA genômico (quadrantes separados por linhas brancas sólidos) foram submetidos à análise PCRTag usando sintético (SYN) e do tipo selvagem (WT) cromossomo 3 primers PCRTag (linhas brancas tracejadas para separar SYN (topo ) e WT (parte inferior) em cada quadrante). WT e synIXR ADNg codificar tipo selvagem cromossoma 3, obtendo-se amplificação com iniciadores WT PCRTag. SynIII e synIII synIXR ADNg codificar cromossoma sintético 3, obtendo-se amplificação com iniciadores PCRTag SYN. Primers estão dispostas de acordo com sua esquerda para a direita posicionamento cromossômica e posicionado de forma idêntica nos quatro quadrantes para comparação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> Figura 3: Placa de calormapa visualizadas ponto de passagem de valor (Cp) para um experimento qPCRTag. Este é o mesmo conjunto de dados, como na Figura 2 e a disposição da placa é, portanto, idêntico. N / A se refere a «amplificação não &#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Análise qPCRTag - A High Throughput, PCR em Tempo Real Ensaio para Sc2.0 Genotipagem

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.8K visualizações.  Institute for Systems Genetics. Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biologia

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitativas Real-Time PCR usando o Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Análise de Expressão Gênica em Emerald Borer Ash ( Agrilus planipennis) Usando Quantitativa em Tempo Real-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Perfil dos pré-micro RNAs e microRNAs usando Quantitative PCR em tempo real (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

Alto rendimento Assay Sacarificação para materiais lignocelulósicos

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

Um método de genotipagem baseados em PCR para distinguir entre variedades do tipo selvagem e Ornamental de Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice Cap: Um Método para Crescer Arabidopsis Plantas e tomate em placas de 96 poços para High-Throughput Genotipagem

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...