Este método de imagem in vivo de células da retina permite investigações de doenças oftalmológicas e compreensão das funções normais da retina. Este método fornece uma abordagem direta e altamente reprodutível para imagens in vivo da retina por microscopia de dois fótons. Estabilizar adequadamente o mouse é fundamental para obter imagens in vivo de qualidade.
Pratique a colocação do mouse no suporte da cabeça e fique confortável com o procedimento antes de tentar adquirir imagens. Sedar o animal de acordo com o protocolo de utilização animal aprovado. Aplique a solução de dilatação da pupila e deixe o rato no escuro durante cinco minutos para permitir que as pupilas se dilatem.
Prenda o pino do canal auditivo inferior na posição estendida para dentro e o pino do canal auditivo superior na posição retirada. Gire o braço principal do suporte da cabeça até que a barra do fone de ouvido esteja inclinada em um ângulo de 60 graus abaixo da horizontal. Com o rato virado para a barra de mordida, monte uma orelha no pino inferior estendido com o pino inserido no canal auditivo.
Depois de soltar o parafuso que prende o pino do canal auditivo superior, estenda o pino para o outro canal auditivo e aperte novamente o parafuso para prender a cabeça. Certifique-se de que o rato está seguro no suporte da cabeça. Pressione para baixo no topo da cabeça.
O rato deve ficar firmemente nas barras auriculares e sua cabeça deve girar livremente em torno do eixo dos canais auditivos. Com a barra de mordida posicionada em direção à cabeça do rato, eleve suavemente a cabeça do rato para permitir que os incisivos maxilares sejam abaixados para o suporte da barra de mordida e retraia a barra de mordida com força suave para fixar a cabeça. Use o parafuso para fixar a barra de mordida na posição e coloque o mouse e o suporte no palco do microscópio.
Aplique colírios lubrificantes em ambos os olhos do rato. Gire o braço principal do suporte de cabeça até que a pupila de um olho esteja orientada de acordo com o caminho da luz e coloque uma tampa de número 1,5 no suporte de filtro compacto. Depois de prender o suporte ao estágio do microscópio, abaixe a tampa até que ela entre em contato com o gel ocular lubrificante sem tocar na córnea e ajuste o estágio na dimensão X-Y e na posição Z objetiva até que a luz de excitação de campo largo cubra totalmente a córnea.
Use a ocular para continuar a ajustar a posição Z até que as células ou estruturas fluorescentes da retina entrem em foco, aumentando o iluminador de epifluorescência conforme necessário para resolver células ou estruturas individuais de interesse. Ajuste o alinhamento da retina com o caminho da luz de imagem. Ajuste o ângulo da cabeça até que ocorra apenas a expansão ou contração da luz fora de foco ao alterar o plano focal, minimizando as distorções X-Y.
Em seguida, desligue o iluminador de epifluorescência e feche o obturador do iluminador. Para imagens de dois fótons, siga todos os protocolos institucionais de segurança a laser. Desligue e cubra toda a luz ambiente e alterne o caminho da luz de excitação para o laser e o caminho da luz de emissão para os PMTs.
No software de aquisição de imagens, defina o tamanho do quadro para 512 por 512 e a média de quadros para três. Defina o passo Z para começar no topo da pilha e progredir para baixo, minimizando a ativação a laser de dois fótons dos fotorreceptores. Ligue e ative os PMTs e ajuste a tensão para 680 volts.
Ative os obturadores de imagem e emissão. Inicie uma visualização de imagem ao vivo do tecido alvo, começando com uma potência de laser de 1%, e ajuste automaticamente o brilho da tela para visualizar as células ou estruturas de interesse. Se o tecido alvo estiver escuro ou pouco claro, aumente a porcentagem de potência do laser até que as estruturas se tornem visíveis sem ultrapassar 45 miliwatts.
Manobrar o estágio do microscópio na direção X-Y para se concentrar em uma área de imagem desejada e navegar até o plano Z com as estruturas de interesse em foco. Para um experimento crônico de lapso de tempo, abra uma imagem previamente obtida para usar como referência para as células de interesse, cuidando para que o ângulo de imagem na imagem atual seja semelhante ao das imagens anteriores. Em seguida, navegue até os planos Z superiores e inferiores de interesse para definir os limites Z da pilha de imagens e adquirir a imagem.
Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, desative os PMTs e o obturador a laser. Mude o caminho da luz de excitação para a iluminação de epifluorescência e o caminho da luz de emissão de volta para a ocular. Em seguida, saia do software de aquisição de imagem, desligue o laser na interface do computador e desligue o hardware em ordem de inicialização inversa, com exceção do equipamento sempre ativo.
No final da análise, remova o rato do suporte da cabeça e utilize um tecido sem fiapos para remover suavemente o gel para os olhos. Em seguida, aplique pomada ocular lubrificante em ambos os olhos e coloque o mouse em uma almofada de aquecimento circulante de água quente de 37 graus Celsius com monitoramento até a decúbito total, antes de retornar o mouse à sua carcaça. Em camundongos VGlut-2-Cre, os somas de células ganglionares da retina são claramente discerníveis e os fascículos axônicos são frequentemente aparentes.
A trajetória dos axônios e a imagem negativa da vasculatura facilitam a identificação da cabeça do nervo óptico em camundongos VGlut-2-Cre, o que é útil como um marco em experimentos de imagem crônica. Em contraste com as células ganglionares da retina, os neurites de células amácrinas são mais frequentemente observados nas camadas plexiformes internas. Um dia após a injeção intraocular de NMDA, a micróglia retiniana demonstra processos curtos ou morfologia ameboide de acordo com relatórios anteriores.
A administração do corante azul de Evans através de uma única injeção intraperitoneal 30 a 60 minutos antes da imagem induz uma forte marcação dos vasos sanguíneos que emanam da cabeça do nervo óptico que persiste por pelo menos sete dias. Após a fixação, a distância real entre os pares de células dentro de montagens inteiras de retina achatadas pode ser medida em varreduras confocais e combinada com distâncias de pixels in vivo para determinar o tamanho médio de pixels de imagens in vivo. Microesferas fluorescentes injetadas nos olhos de camundongos permitem a medição do diâmetro da microesfera in vivo, dando uma estimativa de tamanho de pixel um pouco maior, mas com mais variância.
A imagem in vivo pode ser emparelhada com análises histológicas, como imunocoloração e hibridização in situ. Esses métodos podem identificar tipos específicos de células e examinar a expressão gênica de células fotografadas.
