Name: in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system
Uploaded: 2015-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
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This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women&#8217;s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).

NOTA: Os procedimentos a seguir que envolvem o tecido de animais de laboratório são consistentes com as Diretrizes AVMA para a eutanásia de animais para 2013 e foram aprovados com antecedência pela Michigan State University IACUC. 1. Preparação do Tecido <ol><li> Anestesiar pesquisa animal numa câmara contendo 2,5% de isoflurano em oxigénio ou colocando 3-5 ml de isoflurano líquido sobre um material absorvente sobre o chão da câmara, assegurando que uma barreira física impede os animais de um contacto directo com o isoflurano. Teste para a profundidade da anestesia, apertando a pata. NOTA: A profundidade da anestesia é considerado apropriado quando não há reflexo de retirada do membro posterior. Uma vez devidamente anestesiados, sacrificar o mouse por deslocamento cervical </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal e limpar a pele abdominal com etanol 70%. Use uma pinça para beliscar a pele abdominal na linha média e usar uma tesoura cirúrgica para fazer uma media 6 centímetrosl incisão ao longo da linha alba para expor órgãos digestivos internos. </li><li> Use uma pinça sem corte para localizar e expor o íleo dentro do peritônio. Corte o mesentério ileal / cólon com uma tesoura e começar a desvendar o intestino. </li><li> Uma vez que o comprimento do intestino delgado é adequadamente desvendados, cortar o intestino distai para o estômago e proximal do ceco para uma preparação de íleo. Para uma grande preparação intestino, cortar o cólon distai ao ceco e proximal ao recto. </li><li> Remover rapidamente o segmento intestinal e colocá-lo num copo com meio DMEM / F12 suplementado com cloridrato nicardipine 3? M e 1 PM cloridrato de escopolamina (doravante referida como &quot;media&quot;) em gelo. A adição destes inibidores facilita microdissection e imagem posterior por paralisar o músculo liso do intestino. </li><li> Cortar segmento de interesse (por exemplo, jejuno, íleo, cólon distai ou proximal) com base em marcadores anatómicos estabelecidos. Normalmente utilize tecido do íleo terminal ou o cólon distai. No entanto, utilize o mesmo procedimento básico para isolar, de carga e de imagem neurônios mioentéricos e glia em todas as regiões intestinais. </li><li> Retirar um pequeno segmento (4-6 cm) do segmento de intestino desejada e coloque em uma placa de Petri Sylgard revestido preenchido com media gelada. </li><li> Fixar as extremidades proximal e distal do segmento intestinal com os pinos de insetos e abrir o tubo intestinal, por fazer uma sequência no sentido do comprimento cortado ao longo da fronteira mesentérica. </li><li> Tecido Pin plana sob tensão luz com o lado mucosa e dissecar cuidadosamente afastado camada mucosa usando uma pinça fina (# 5 e # 5/45 trabalho melhor) e tesoura primavera muito finas. NOTA: A remoção da mucosa pode ser bastante traumático para o ENS se não for feita correctamente. Para as preparações de qualidade, tome cuidado para limitar a remoção abrupta da mucosa por descamação ou raspagem. A melhor prática é para levantar a mucosa e cortar por baixo com uma tesoura fina. </li><li> Corte o tecido em preparação menors (aproximadamente 0,5 cm 2) e pinos em placas de imagem (4 cantos com camada muscular circular voltada para cima) colocados no gelo com meio fresco. </li><li> Dissecar cuidadosamente afastado músculo circular por provocando distante com uma pinça fina para expor o plexo mioentérico. Evitar o alongamento excessivo. </li><li> Coloque imaging prato de volta no gelo e na mudança solução por meio fresco. </li><li> Prepare a 2 ml de mistura de enzima por prato [Dispase 1 U / ml (4,48 mg / 8 ml), colagenase tipo II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) em meio]. </li><li> Retirar pratos de gelo e adicione a mistura de enzimas a partir do passo 1.13. </li><li> Incubar pratos à TA durante 15 min com 5% de CO2 / 95% ar. </li><li> Preparações de tecido lavar com mídia 3 vezes e cantos re-pin. </li></ol> 2. Carregando Fluo-4 Dye NOTA: Evite a fotodegradação, trabalhando com luz limitada durante o manuseio de corantes fluorescentes e tecidos carregados com corantes indicadores. <ol><li> Prepare 4 uM Fluo-4 solução de carregamento. <ol><li> Adicionar 1,5 ml de mídia e 1,2 l de um estoque probenecida 250 mm a uma alíquota de 1,5 mL de 4 mM Fluo-4 estoque. 4 mM de Fluo-4 é preparada por adição de 11,4 ul de Pluronic F-127 (20% em DMSO; suplementado com 0,25% cremaphor-EL) a 50 ug de Fluo-4, AM. </li></ol></li><li> Incubar preps em Fluo-4 solução de carga durante 45 min numa incubadora de escuro a 37 ° C. </li><li> Remover da incubadora e lave preparações à mídia 3 vezes. </li><li> Meios de troca para meio contendo 200 uM de probenecid e incubar 15 min a 37 ° C antes de imagem. NOTA: Probenecid é uma droga que inibe transportadores multirresistência em neurônios. A adição desta droga inibe a capacidade dos neurónios para extrudir corantes e aumenta a marcação neuronal. -Carregamento a granel de Ca 2+ corantes indicadores na ausência de probenecida produz célula de carga, principalmente glial. A adição de probenecid permite a visualização das respostas neuronais e gliais. </li><li> Prepare Modificado Kretampão bs. <ol><li> Adicione um tampão de Krebs modificada de tal modo que as concentrações finais (em mm) dos componentes são como se segue: 121 de NaCl, 5,9 de KCl, 2,5 de CaCl2, 1,2 de MgCl2, 1,2 de NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21,2 NaHCO3, 1 pirúvico e ácido 8 glicose (pH ajustado para 7,4 com NaOH). Adiciona-se 3 uM de nicardipina e 1 uM escopolamina para inibir as contracções musculares durante Ca 2+ imagiologia e todo o monte dissecações. </li></ol></li></ol> 3. Imagem e Análise NOTA: Utilize pelo menos um equipamento básico de imagem com uma fonte de luz fluorescente, microscópio, uma câmera CCD qualidade e software de aquisição apropriado. Variar a adição de outros componentes, dependendo da fonte de luz e da aplicação específica. A roda de filtros e do obturador deve ser usado com uma fonte de luz xenon arco tradicional. No entanto, fontes de luz LED e sistemas de iluminação não requerem esses componentes. <ol><li> Posicione o recording câmara sob o microscópio e utilizando um sistema de perfusão de escoamento por gravidade, com vários reservatórios de seringas aquecidas estabelecer uma taxa de perfusão contínua de 2-3 ml / min de 37 ° C tampão de Krebs. Certifique-se para impedir a formação de bolhas de ar em ambas as linhas de entrada e de sucção ligada a um sifão de vácuo. </li><li> Traga o plexo desejados em foco sob iluminação de campo claro. Evitar overexposing tecido, o que pode levar a foto branqueamento. </li><li> Examine o Fluo-4 loading dentro de gânglios e selecione gânglios saudável para a imagem latente. / Gânglios danificadas insalubres irá apresentar autofluorescência ou pontuada morfologia e não deve ser usada para imprimir. </li><li> Uma vez gânglio é selecionado, desviar a trajetória da luz para a câmera e obter uma imagem ao vivo com software de aquisição de imagem. Certifique-se de que gânglio está em foco e definir a taxa de aquisição de imagens e tempos de exposição. NOTA: as taxas de aquisição de imagem e tempos vão variar de acordo com os eventos investigadores deseja gravar. Para a maioria dos experimentos, imagenssão tradicionalmente adquiridas a 0,5-1 Hz para as células gliais e até 10/02 Hz para os neurônios, porque as respostas glial Ca 2+ não são tão rápido como Ca 2+ transientes em neurônios. </li><li> Comece a experiência e estabelecer actividade de base por 30 s. </li><li> Aplicar drogas pré-aquecidas de interesse, tais como agonistas e antagonistas utilizando o sistema de perfusão de fluxo por gravidade a um caudal de 2-3 ml / min. Siga aplicação de agonistas / antagonistas de retorno a uma perfusão de tampão normal e permitir um período de lavagem / recuperação de pelo menos 10 min. NOTA: Os tempos de aplicação de drogas pode variar dependendo do composto individual e desenho experimental. Em geral, uma aplicação de 20-30 seg agonista é suficiente para activar a proteína G de receptores acoplados em neurónios e células gliais. Entretanto, os canais iónicos dependentes de ligante (como receptores nicotínicos de acetilcolina) exigem épocas de aplicação de, no máximo, 5-10 seg. As exposições da duração causará canais iônicos ligando fechado para dese rapidamentensitize. Antagonistas deve ser aplicada durante aproximadamente 3-15 minutos para assegurar o bloqueio completo das vias do receptor. No entanto, esta é uma generalização grosseira e os investigadores devem sempre otimizar qualquer droga experimental em seu paradigma particular. </li><li> Parar a gravação e exibição de filme de lapso de tempo do experimento. Selecionar cuidadosamente regiões de interesse (de ROI) usando o software de análise de imagem adequada. </li><li> Use software para normalizar e comparar ROI intensidade de fluorescência contra o seu valor fluorescente linha de base inicial. Alterações na fluorescência normalizada são directamente proporcionais às variações na [Ca 2+]. <ol><li> Utilize uma modificação de um método descrito anteriormente 26 utilizando Af / F = ((F 1 - 0 F) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / 0 F) do fundo, em que F1 é a fluorescência em qualquer ponto e F0 é a fluorescência de base, para melhorar a precisão de avaliação. Isso ajuda a modificaçãona redução do ruído a partir de alterações de fluorescência em preparações de tecidos que apresentam movimento da camada muscular subjacente ao plexo mioentérico. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes. 
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure. 
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.

O sistema nervoso entérico (ENS) está organizado em dois plexos ganglionados embutidas na parede do trato digestivo 1. Estes circuitos neurais intramusculares, o plexo mientérico (MP) e plexo submucosa (PMS), são compostas de neurónios e células da glia entérico (Figura 1) 2. O MP e SMP regular gastrointestinais (GI) funções tais como a motilidade intestinal e absorção epitelial e secreção, respectivamente 3. Glia Entérico estão localizados em estreita proximidade com os neurônios dentro gânglios mas populações de glia entérico também existem dentro interligando tratos de fibras e porções extra-ganglionares da parede do intestino 3,4. Glia entéricos foram originalmente acreditado para fornecer apenas suporte nutritivo para os neurônios. No entanto, estudos recentes sugerem fortemente que as interações neurônio-glia são essenciais para ENS funciona 5,6. Por exemplo, os dados mostram que as células da glia entérico &quot;ouvir&quot; a actividade neuronal 7e modulam circuitos neuronais 6,8, proteger os neurônios entéricos de estresse oxidativo 9 e são capazes de gerar novos neurônios entéricos em resposta à lesão 10,11. O protocolo apresentado nesta revisão técnica fornece um método simples e robusta para examinar a complexa interação entre neurônios e células gliais entéricas usando in situ Ca2 + intracelular de imagem. Ca 2+ é uma molécula de sinalização onipresente em células excitáveis ​​e desempenha um papel essencial em eventos de sinalização sináptica no sistema nervoso 12. Excitação de neurônios ou células gliais entéricas provoca uma elevação na concentração citoplasmática de Ca2 + ou pelo influxo através de canais de Ca2 + -permeable ou Ca 2+ liberação dos estoques intracelulares de cálcio. Imagem Ca 2 + transientes em neurônios e células gliais com corantes fluorescentes é uma técnica amplamente utilizada para estudar a organização funcional e dinâmica do estabelecido ea 13-17 ENS. Ca 2+ de imagem tem se mostrado uma ferramenta importante no estudo de segmentos de tecido GI intactas para elucidar a propagação da excitabilidade por meio de redes de marcapasso ICC 18 e intestino músculo liso 19,20. Ele permite que os pesquisadores para investigar um amplo espectro de parâmetros fisiológicos e fornece informação sobre as sua distribuição espacial e dinâmica temporal. As células podem ser eficientemente manchado de forma minimamente invasiva por meio de indicadores fluorescentes à membrana permeável e protocolos de coloração otimizados 21. Isto oferece a oportunidade de monitorizar um grande número de neurónios e células da glia entérico em preparações funcionalmente conservados 14-16,22, bem como in vivo 23. Whole mount-preparações de tecido são granel carregado com um corante indicador de afinidade elevada de Ca 2+, tais como Fluo-4 que aumenta a sua fluorescência quando ligados a Ca 2+. Mudanças na fluorescência são registradas por uma câmera CCD e analisadas digitalmente 6. O advento da Ca 2+ proporcionou a oportunidade de acompanhar de neurônios e células glia interações, a capacidade de resposta a vários estímulos, e o envolvimento desses tipos de células em processos gastrointestinais em tempo real. In situ Ca 2+ imaging rendeu grande visão sobre os mecanismos de sinalização de neurônios entéricos e glia e possui diversas vantagens em relação aos modelos de cultura de células 6,24. Primeiro, in situ preparações manter o ambiente da matriz nativa de neurônios e células gliais e deixar a maior parte de suas conexões para atingir tecido intacto. Em segundo lugar, a genética e morfologia da glia entérico culta é significativamente alterada em comparação com in vivo 6,24. Terceiro, muitas interacções heterotípicos são perdidos em cultura de células primárias e estabelecer limites, que avaliam as interacções célula-célula. Embora as células cultivadas são bem adequados para a investigação de propriedades fundamentais, a sua usefulness para o estudo de interações complexas entre glia e neurônios entéricos é limitado. Investigando interação neurônio-glia utilizando uma abordagem in situ é mais fisiologicamente relevante como as vias sinápticas permanecem intactos 25. Em comparação com as abordagens de cultura de células, uma abordagem em situ oferece melhores condições para compreender sistematicamente as interações complexas entre neurônios e glia entérico. Além disso, a organização planar do plexo ganglionados em preparações inteiras de montagem é ideal para imagens fluorescentes de Ca 2+ intracelular transientes e esta técnica fornece uma abordagem simples para avaliar a atividade do neurônio-glia na ENS.

<table><tbody><tr><td>BubbleStop Syringe Heater&amp;nbsp;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type II, powder</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td>Roboz&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Fixed-stage microscope</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM dye</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>Minutien Pins</td><td></td></tr><tr><td>iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS camera</td><td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion chamber</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Molecular Probes</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>Scopolamine</td><td>Sigma</td><td>S1013&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&amp;nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

A utilização adequada desta técnica permite aos investigadores para medir com precisão de Ca2 + intracelular [Ca2 +] i transientes em neurônios entéricos e glia em todo o monte preparações de tecido. Um exemplo representativo de um evocou-agonistas Ca 2+ respostas em glia dentro de um gânglio myenteric do cólon do rato é mostrado no vídeo 1. Os resultados a seguir são destinadas a ilustrar alguns resultados representativos temos obtidos utilizando este método. Em primeiro lugar, a Figura 2 ilustra os resultados de uma experiência de medição da glia entérico [Ca 2+] i alterações em resposta à estimulação por ATP dentro do cólon de cobaia longitudinal do plexo mientérico do músculo (PMLM preparações). Especificamente, esta figura mostra o método de análise apropriada do protocolo experimental listadas acima, incluindo o contorno do gânglio e asteriscos denotam a localização dos neurónios entéricos mientérico analisados. Estes resultados também illustrate a dose ideal de cem ATP micromolar sobre a mobilização de [Ca2 +] i em cobaias glia myenteric. Esta resposta pode ser utilizado para calibrar a estimulação da glia entérico e normalizar as respostas a estímulos testar. A seguir, a figura 3 elucida como seleccionar adequadamente as regiões de interesse (ROI) que envolve as células gliais, mostrado com circundante círculos amarelos. Estes resultados também mostram que as alterações de fluorescência desejadas em condições basais e em resposta a estímulos farmacológicos. Finalmente, a Figura 4 mostra as considerações espaciais para a escolha de glia entérico e neurônios para [Ca2 +] i respostas em preparações Todo-mount. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> Figura 1. Organização das ENS. A ENS contém dois principais plexos ganglionados. O plexo mioentérico está localizado entre o lcamadas musculares ongitudinal e circulares. O plexo submucosa está situado entre a mucosa e da camada muscular circular. A ENS é exclusivamente composta de neurônios e células gliais entérico. Tratos de fibras do nervo conectar os gânglios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> Figura 2. Entérico glia na cobaia colônica plexo mioentérico respondem ao ATP in situ. (A) Fluo-4 fluorescência em um gânglio myenteric (delineado pela linha tracejada) em condições basais. As setas apontam para feixes de fibras interganglionic espessura. (B) Após a estimulação com 100 mmol / L ATP, as células gliais, mas não neurônios, aumentar rapidamente Fluo-4 fluorescência indicando um aumento da [Ca 2+] <sub&gt; i. Note-se que as células que respondem são pequenos e rodear os neurónios muito maiores (espaços escuros marcados por asteriscos). (C) glia entérico responder ao ATP de um modo dependente da dose com 1 mmol / L eliciar respostas máximas de 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ler um versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> Figura 3. Murino células S-100-GFP + no cólon respondem plexo mientérico de ATP in situ. (A) células gliais (verde) em um rato do cólon gânglio mientérico S-100-GFP + (descritos pela linha tracejada). Seis regiões de interesse (ROI) que envolve as células gliais dentro do gânglio são mostrados como círculos amarelos. As setas indicam tratos de fibras grossas que levam até o gânglio. Os asteriscos dlocalização enote de 2 neurônios entéricos. (B) Same gânglio mostrando Rhod-2 de fluorescência em condições basais. (C) Após a estimulação com 100 mmol / L ATP, as células gliais responder com aumento [Ca2 +] i, como mostrado pelo aumento Rhod- 2 de fluorescência. (D) Traces correspondente a cada ROI mostrado na A-C. (E) resposta média (média ± SEM) das 6 ROIs mostrados na D 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> Figura 4. Em imagiologia in situ de comunicação entérico neurónio-glia-a. (A) (Imagens representativas pseudocolored) a partir de uma experiência de imagem Ca 2+ onde um todo-mountpreparação de plexo mientérico foi desafiado com o agonista do receptor P2X7 neuronal BzATP (100 pM, 30 s). Note-se que o agonista neuronal provoca um aumento na fluorescência Fluo4 no neurónio (A &#39;), antes de as células gliais circundantes entéricos (A &quot;). (B) Análise da alteração na fluorescência ao longo do tempo em células da glia (azul) e os neurónios (vermelho ) após a aplicação do agonista neuronal, BzATP. (C) neuronal e da glia respostas de BzATP em tampão normais (linhas sólidas) e em tampão com baixo Ca 2+ e Mg 2+ (linhas tracejadas) para potenciar receptores P2X7 neuronais 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Vídeo 1. evocada pelo agonista Ca 2+ em resposta glia entéricositu. Este vídeo mostra um gânglio myenteric do cólon distal do rato carregado com o Ca 2+ corante indicador, Fluo-4. O agonista de células da glia, ADP, é adicionado ao banho, quando indicado. ADP provoca um aumento intracelular de Ca2 + em glia entérico como observado pela elevação transitória em Fluo-4 fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a>

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In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

In Situ Ca 2+ Imagem do Sistema Nervoso Entérico

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

in-situ-ca2-imaging-of-the-enteric-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

17.1K visualizações.  Michigan State University. The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging. 

Vídeo: In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Bioquímica

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neurociência

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Visualização in vivo do gânglio trigêmeo de ratos com indicadores de cálcio

In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their large signal-to-noise ratio makes GECIs a powerful tool for detecting stimulus-evoked activity in sensory neurons. GECIs facilitate population-level analysis of stimulus encoding with the number of neurons that can be studied simultaneously. This population encoding is most appropriately done in vivo. Dorsal root ganglia (DRG), which house the soma of sensory neurons innervating somatic and visceral structures below the neck, are used most extensively for in vivo imaging because these structures are accessed relatively easily. More recently, this technique was used in mice to study sensory neurons in the trigeminal ganglion (TG) that innervate oral and craniofacial structures. There are many reasons to study TG in addition to DRG, including the long list of pain syndromes specific to oral and craniofacial structures that appear to reflect changes in sensory neuron activity, such as trigeminal neuralgia. Mice are used most extensively in the study of DRG and TG neurons because of the availability of genetic tools. However, with differences in size, ease of handling, and potentially important species differences, there are reasons to study rat rather than mouse TG neurons. Thus, we developed an approach for imaging rat TG neurons in vivo. We injected neonatal pups (p2) intraperitoneally with an AAV encoding GCaMP6s, resulting in &gt;90% infection of both TG and DRG neurons. TG was visualized in the adult following craniotomy and decortication, and changes in GCaMP6s fluorescence were monitored in TG neurons following stimulation of mandibular and maxillary regions of the face. We confirmed that increases in fluorescence were stimulus-evoked with peripheral nerve block. While this approach has many potential uses, we are using it to characterize the subpopulation(s) of TG neurons changed following peripheral nerve injury.

Autor em destaque: Explorando os mecanismos periféricos da dor neuropática na lesão do nervo trigêmeo 

Genetically encoded calcium indicators (GECI) enable a robust, population-level analysis of sensory neuron signaling. Here, we have developed a novel approach that allows for in vivo GECI visualization of rat trigeminal ganglia neuron activity.

In-Vivo Imagem de cálcio de neurônios sensoriais no gânglio trigeminal de ratos

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their ...

Advanced Imaging of Dorsal Root Ganglion Neurons for Sensory Modality Research

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the protocol for in vivo calcium imaging of the exposed DRG in response to various visceral and somatic stimuli. Pirt-GCaMP6s mice or C57BL6 mice intrathecally injected with AAV viruses packaged with GCaMP6s were utilized to capture Ca2+ transients. The amplitude of these transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. Afferent fibers originate from internal organs, with primary neuronal cell bodies in spinal or vagal ganglia. Studies on visceral nociception and acupuncture analgesia can potentially be conducted on primary sensory neurons using advanced imaging technologies like in vivo calcium imaging, allowing for the recording of neuronal activity ensembles in the intact animal during stimulation or intervention. The responses of DRG neuron ensembles to somatic and visceral stimuli applied to their corresponding receptive fields were recorded. This technique illustrates how neuronal populations react to various types of somatic and visceral stimuli. It is possible to comprehensively compare neuronal ensemble responses to different stimuli, which is a particularly valuable approach in research on visceral pain and segmental mechanisms of somatic stimulation, such as acupuncture.

The present protocol outlines in vivo calcium imaging for measuring the responses of ensembles of lumbar-6 DRG neurons to somatic and visceral stimuli. Thorough comparisons can be made among neurons responding to different stimuli. This protocol is valuable for investigating mechanisms of visceral pain and somatic stimulation, such as acupuncture.

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the ...

In Situ Ca ²⁺ Imagem do Sistema Nervoso Entérico

Resumo

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In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

In-Vivo Imagem de cálcio de neurônios sensoriais no gânglio trigeminal de ratos

In-Vivo Imagem de cálcio de neurônios sensoriais no gânglio trigeminal de ratos

In-Vivo Imagem de cálcio de neurônios sensoriais no gânglio trigeminal de ratos

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli