PS tem um Canada Research Chair em Biologia Celular da retina e do Instituto de Pesquisa Alcon New Investigator Award. Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (221.478), a Canadian Diabetes Association (OG-3-11-3329-PS), Ciências Naturais e do Conselho de Pesquisa do Canadá Engenharia (418637) e A Fundação Fighting Blindness Canadá. O suporte também foi fornecido pelo Réseau de Recherche en Santé de la Visão du Québec.

Declaração de Ética: Todos experimentação animal adere as diretrizes de cuidados de animais estabelecidas pela Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração para o uso de animais em Ophthalmic and Vision Research e pelo Conselho Canadense de Cuidado Animal. 1. Oxigênio Induzida Retinopatia (OIR) <ol><li> Registar a data de nascimento de filhotes de rato como P0. </li><li> Registre todos os pesos dos animais aquando da entrada em O 2 para garantir uma faixa de peso adequado. Nota: Para C57BL / 6 ratos em P17, o peso corporal deve variar entre 5 e 7,5 g de NV máxima 32. A fim de manter a consistência do ambiente, é recomendado o uso da mesma ninhada de controlo (para ratinhos geneticamente modificados, bem como ratinhos que receberam tratamentos experimentais). Ao avaliar os efeitos de um vetor viral, deve-se considerar o tropismo do vírus e dar tempo suficiente para a plena expressão de transgenes por vírus entregues. Rapidamente expressar viralOs vectores, tais como os lentivírus 3 ª geração 24, 25, 33 são recomendados. </li><li> Filhotes lugar do mouse no P7 (C57BL / 6 ou desejado tensão) e um CD1 fomentar mãe em uma câmara de oxigênio fixado em 75% O 2 por 5 dias 27. Umidade e temperatura ambiental foram mantidas constantes durante toda a exposição O 2. Nota: As instalações de investigação equipados com uma fonte central de O 2 são ideais e limitar a substituição pesado de O vazio 2 tanques. Se estiver trabalhando com camundongos transgênicos ou nocaute, é importante para garantir que o controle e os ratos experimental são adquiridos do mesmo fornecedor para limitar desvios genéticos dentro das mesmas cepas 30, 29. </li><li> Em P12, remover ratinhos a partir da câmara de oxigénio e retornar os animais ao ambiente de O 2. </li></ol> 2. Injeção intravítrea para entrega de Compostos para o Inner Retina (When avaliar os efeitos de um composto farmacológico ou proteína recombinante) <ol><li> No P14, anestesiar ratos com 2% de isoflurano em oxigênio 2 L / min (ou proteção animal aprovado pelo comitê de anestésico de escolha). A fim de verificar a eficácia da anestesia, sequencialmente beliscar a cauda, ​​pé de trás e da orelha com uma pinça. </li><li> Posicione o mouse sobre o ventre. </li><li> Usando uma seringa esterilizada de 10 mL equipado com uma agulha de vidro puxado chanfrada, realizar uma injecção de um volume máximo de 1 ml de solução contendo o composto a ser investigada ou veículo (solução salina fisiológica) no limbo posterior do olho, com um 45 ° ângulo de evitar a lente. Nota: A-agulha de vidro puxado está ligado à seringa utilizando uma gota de epoxi-resina. </li><li> Aplique uma gota de pomada oftálmica lubrificante (de preferência com antibiótico) com um cotonete para o olho do mouse. </li><li> Retorne o mouse de volta para a jaula com a promoção mãe. Ratos são, então, cuidadosamente monitorizados até recoberto e totalmente ambulatorial. </li></ol> 3. Avaliação da perfusão navio e função de barreira (Integridade) por Angiofluoresceinografia <ol><li> Anestesiar ratos com isoflurano a 2% em oxigênio 2 L / min (ou proteção animal aprovado pelo comitê de anestésico de escolha). A fim de verificar a eficácia da anestesia, sequencialmente beliscar a cauda, ​​pé de trás e da orelha com uma pinça. Nota: Esta é normalmente realizada no P17 quando a regeneração é avaliada. Também levar a cabo a análise em P19 e P21 para determinar se a integridade vascular é preservada ao longo do tempo. </li><li> Uma vez anestesiados, pesar o mouse. </li><li> Faça uma incisão na linha média do abdome com uma tesoura de dissecação. Nota: Os instrumentos de dissecação devem ser regularmente verificados e afiada. </li><li> Cortar costelas lateralmente e levantar a caixa torácica com o auxílio de uma pinça. Nota: É necessário cortar lateralmente como possível, para evitar danos no coração. </li><li> Após a remoção peripHeral tecido do coração, prender a aorta descendente com pinça hemostática. </li><li> Lentamente injetar fluoresceína-dextrano para o ventrículo esquerdo usando uma agulha G 25. Nota: Se a função de barreira vascular é investigado, 70 kDa fluoresceína-dextrano é empregado como ele vai vazar para fora dos vasos quando a integridade dos vasos é comprometida. Se o investigador quer fundido vasos sanguíneos, 2 MDa fluoresceína-dextrano é usado. As etapas críticas: 1) Para garantir uma repartição homogênea, centrífuga fluoresceína-dextrano e injetar o sobrenadante, 2) a fim de evitar a constrição dos vasos, injetar solução de fluoresceína-dextrano aquecido, 3) O seu tempo de circulação não deve excesso de 4 min. </li><li> Decapitar ratos 2 min após a injeção com uma tesoura de operação. </li></ol> 4. Enucleação e Eye Fixation Nota: Ao avaliar as taxas de regeneração vascular, primeiro coletar retinas no P12 e, adicionalmente, no P14 e P17. Aumentar o número de ponto de tempo amostrados para determinação mais precisa das taxas de revascularização 24. <ol><li> Incline a cabeça do rato e colocá-lo de lado. </li><li> Retire a pele e as pálpebras cobrem os olhos com uma tesoura de dissecação. </li><li> Coloque uma pinça curva abaixo do olho e puxe-o até que o nervo óptico é cortada. </li><li> Vire a cabeça do rato para seu outro lado e realizar os mesmos passos (passos 4.2 e 4.3). </li><li> Para garantir uma melhor penetração do fixador, perfurar um buraco na câmara anterior do olho usando 30 G agulha. </li><li> Transferir os olhos para um tubo contendo 4% de paraformaldeído (PFA) e fixar durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Remover e lavar os olhos PFA 4 vezes com uma solução de PBS gelado. </li></ol> 5. Dissecção da retina <ol><li> Coloque rato olhos em uma placa de Petri contendo PBS frio e realizar dissecção das retinas sob microscópio estereoscópico. </li><li> Retire a gordura / tecido extra em torno do olho com micro-dissecção scissors. </li><li> Corte a córnea com uma tesoura micro-dissecção. </li><li> O uso de dois pares de pinças, minuciosamente descascar a esclera distância a partir da periferia em direcção ao nervo óptico e descartar. </li><li> Aperte a lente (bola esbranquiçada abaixo da córnea) com uma pinça e extraí-lo do copo olho. Utilizar um par de pinças, como um apoio, e a outra para agarrar e levantar cuidadosamente e remover a lente. </li><li> Separar os vasos hialóide da face interna da retina utilizando escovas pequenas (tamanho 0) e uma pinça. </li><li> Retirar feixes de vasos hialóide ligados ao disco óptico usando uma pinça. </li><li> Transferência dissecados retinas de dois tubos ml de microcentrífuga contendo PBS e colocar em gelo antes de se iniciar o processo de coloração. </li></ol> 6. Retinal Vascular Coloração <ol><li> Incubar as retinas dissecados durante a noite com agitação suave a 4 ° C em uma solução de fluorescência acoplado a isolectina B4 (rodamina-lectina ou outra) em PBS contendo 1 mM de CaCl2 </sub&gt; (uma diluição de uma solução B4 2 mg / ml isolectina é recomendado 1:100). Durante o procedimento de coloração inteira, cobrir os tubos com folha de alumínio ou uma película opaca para proteger da luz. </li><li> No dia seguinte, remover a solução de corante e lavar retinas 3x em PBS durante 10 min à temperatura ambiente. </li></ol> 7. Preparação de retina Flatmounts <ol><li> Retinas, do lado fotorreceptor para baixo de transferência, sobre uma lâmina de microscópio e fazer quatro incisões radiais equidistantes profundas utilizando um bisturi cirúrgico para dividir a retina em quatro quadrantes de igual tamanho. Durante as incisões, a cinta da retina, com uma escova, de modo que ele não se mova. </li><li> Usando duas escovas embebidas em PBS, alise cuidadosamente a quadrantes fotorreceptor side-down e mergulhe a retina em meio de montagem para evitar a foto-branqueamento. Em seguida, coloque cuidadosamente uma lamela sobre a superfície da retina montado sem a aplicação de pressão e garantir que as bolhas de ar não se acumulam sob a lamínula. &lt;/ Li&gt; </ol> 8. Imagem e Quantificação de Vasoobliteration (VO) e neovascularização (NV), como descrito anteriormente 31 <ol><li> Tire fotos de retinas inteiras montado com um microscópio de epi-fluorescência com uma ampliação de 10x. </li><li> Abra a imagem da retina em software de edição de fotos, unir e medir a área total da retina, ea área avascular. Área pode ser expressa em pixels. </li><li> Determinar a extensão de VO, dividindo o número de pixels na área avascular pelo número de pixels na área total da retina. </li><li> Determinar a extensão da NV-se dividindo o número de pixels de NV pelo número de pixels na área total da retina, tal como descrito 31. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+selection+for+different+mtDNA+genotypes+in+heteroplasmic+mice.">Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice.</a> Nat Genet. 16, 93-95 (1997).</li><li>Mattapallil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rd8+mutation+of+the+Crb1+gene+is+present+in+vendor+lines+of+C57BL/6N+mice+and+embryonic+stem+cells,+and+confounds+ocular+induced+mutant+phenotypes.">The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes.</a> Investigative ophthalmolog., &amp; visual science. 53, 2921-2927 (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Qual é a maneira mais eficaz de estimular o crescimento de novos vasos saudáveis ​​no tecido nervoso isquêmico? É terapeuticamente válida para interferir e acelerar ocorrem naturalmente rebrota vascular? Em patologias neuro-isquêmica, como retinopatias isquêmicas ou acidente vascular cerebral, degeneração vascular está associado à redução da função neuronal 35-38. Daí para combater lesão precoce, restabelecendo micro-circulação regional durante o segmento de imediato / precoce da doenç...

Ao longo do desenvolvimento do SNC, nervos, células do sistema imunológico e vasos sanguíneos estabelecer redes notavelmente acoplados para garantir adequada perfusão tecidual e permitir a transmissão de informações sensoriais 1-5. O colapso dos sistemas vascular resulta na oxigenação dos tecidos ea oferta insuficiente metabólica comprometida e é cada vez mais reconhecida como um importante contribuinte para a patogênese de doenças neurodegenerativas 6. Abandono vascular e a deterioração da unidade neurovascular dentro do cérebro, por exemplo, está associado com a demência vascular, lesões vasculares da matéria branca do cérebro 7 e doença de Alzheimer com estenose de arteríolas e vasos de pequeno calibre 8. Além disso, a função de barreira vascular prejudicada é pensado para contribuir esclerose múltipla 9 e esclerose lateral amiotrófica 10. De relevância direta para o modelo de retina descrito neste protocolo, cegandodoenças tais como a retinopatia diabética 11 e retinopatia da prematuridade 12, 13 são caracterizados por uma fase de degeneração vascular precoce. O estresse isquêmico que se seguiu na retina neurovascular desencadeia uma segunda fase de neovascularização excessiva e patológica que provavelmente se origina como uma resposta compensatória ao oxigênio restabelecer o fornecimento de energia e 14-16. Uma estratégia atractiva para superar o stress isquémico que é central para a progressão da doença é o de restaurar redes vasculares funcionais especificamente nas zonas isquêmicas do sistema neuro-retina (Figuras 2 e 3). Provocar uma resposta angiogênico controlado pode vir transversalmente como um contra-senso para uma condição em que os tratamentos anti-angiogênicos, tais como anti-VEGF são considerados tratamentos adaptados. No entanto, a evidência para a validade desta abordagem é montagem. Por exemplo, aumentando a rebrota vascular &quot;fisiológico-like&quot; em ischemretinopatias ic foi elegantemente demonstrado através da introdução de células precursoras endoteliais 17, a inibição da Müller VEGF expresso de células na supressão induzida de outros fatores angiogênicos 18, injeção de células progenitoras mielóides 19, a inibição da NADPH oxidase a apoptose induzida por 20, aumentando dietético ω-3 fatty poliinsaturados ingestão de ácido 21, o tratamento com um fragmento do terminal carboxilo do triptofano tRNA 22, e a administração directa de VEGF ou FGF-2, para a protecção de células gliais 23. Além disso, foi demonstrado que o modulando pistas de orientação neuronais clássicos, tais como netrinas Semaforinas ou em retinopatias isquêmicas acelera a regeneração vascular de vasos saudáveis ​​dentro da retina e, consequentemente, reduz a angiogénese patológica 24, 25. De relevância clínica direta, vários dos estudos realizados em animais acima mencionados fornecem evidências de que a promoção re vasculargeração durante a fase isquêmica precoce de retinopatias pode reduzir significativamente risco de vista pré-retinal neovascularização 19, 23, 24, 26, provavelmente através da redução da carga isquêmica. Elaboração de estratégias terapêuticas que estimulam a regeneração dos vasos funcionais continua a ser um desafio significativo para os biólogos vasculares. Aqui nós descrevemos um sistema experimental que utiliza o modelo do rato de retinopatia induzida por oxigênio (OIR), para explorar estratégias para modular a rebrota vascular dentro da retina. Desenvolvido por Smith et al., Em 1994, 27, este modelo serve como um proxy para retinopatias proliferativas humanos e consiste em expor filhotes P7 rato para 75% O 2 até P12 e, posteriormente, re-introduzir os filhotes para a sala ambiente O 2-tensão (Figura 1). Este paradigma vagamente imita um cenário onde um bebê prematuro é ventiladocom o O 2. A exposição de filhotes de rato à hiperóxia provoca degeneração dos capilares da retina e microcirculação, e produz uma área reprodutível de vaso-obliteração (VO) normalmente avaliada em saída de O 2 no P12, embora a área VO máxima é atingida aos 48 hr (P9) após exposição ao O 2 28. No ratinho, as zonas avasculares VO regenerar-se espontaneamente ao longo da semana seguinte re-introdução de ar ambiente e, eventualmente, as zonas de VO são completamente re-vascularização (figura 2). Re-introdução de ar ambiente, de ratinhos submetidos a OIR também provoca neovascularização pré-retinal (NV) (máximo a P17), que é tipicamente avaliada para determinar a eficácia de paradigmas de tratamento anti-angiogénicos. Na sua forma mais pura, o modelo OIR fornece uma ferramenta altamente reprodutível e quantificável para avaliar a degeneração vascular induzida por oxigénio e determinar a extensão da neovascularização destrutiva pré-retiniana 29-31. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Vários paradigmas de tratamento exploratório que modulam a regeneração vascular CNS pode ser investigado usando o modelo OIR incluindo o uso de compostos farmacológicos, terapia genética, deleção do gene e muito mais. A propensão de uma determinada abordagem para influenciar rebrota vascular é avaliada passo a passo na janela entre P12 (VO máxima após saída da hiperóxia) e P17 (NV máxima). A avaliação dos resultados do tratamento na NV patológico pode ser rapidamente e facilmente determinada em paralelo e foi exaustivamente descrito por Stahl e colegas 30, 31. Aqui nós fornecemos um procedimento simples passo-a-passo para investigar a modulação da revascularização fisiológica dentro da retina neural por compostos farmacológicos, terapêuticos potenciais, vetores virais ou para estudar a influência dos genes candidatos em camundongos transgênicos ou nocaute.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1224">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:639px;">C57Bl/6 mice ((Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:639px;">CD1 nursing mothers</td>
			<td style="width:181px;">Vendor of choice</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:639px;">Operating Scissors straight</td>
			<td style="width:181px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:175px;">14192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:639px;">Dissecting Scissors straight</td>
			<td style="width:181px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:175px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:639px;">Vannas Eye Scissors</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:175px;">72-8483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:639px;">Iris Forceps, curved, serrated</td>
			<td style="width:181px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:175px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:639px;">Brushes 362R size 0</td>
			<td style="width:181px;">Dynasty</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:639px;">Dumont Forceps #3; straight</td>
			<td style="width:181px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:175px;">500338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:639px;">Surgical Blade, size 10</td>
			<td style="width:181px;">Bard-Parker</td>
			<td style="width:175px;">371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:639px;">Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I</td>
			<td style="width:181px;">Vector Laboratories, Inc</td>
			<td style="width:175px;">RL-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:639px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td style="width:175px;">16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:639px;">Fluoromount G</td>
			<td style="width:181px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:175px;">17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:639px;">Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:639px;">Leica MZ9.5 Stereomicroscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:181px;">Leica</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:639px;">Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">46945</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of vascular regeneration in the cns using the mouse retina

A retina roedor é, talvez, o sistema de mamífero mais acessível que a investigar interacção neurovascular dentro do sistema nervoso central (SNC). É cada vez mais reconhecido que várias doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, esclerose múltipla e esclerose lateral amiotrófica apresentam elementos de comprometimento vascular. Além disso, as causas mais importantes de cegueira em populações pediátricas e de trabalho idade (retinopatia da prematuridade ea retinopatia diabética, respectivamente) são caracterizadas por degeneração vascular e insuficiência de rebrota vascular fisiológico. O objetivo deste documento técnico é fornecer um protocolo detalhado para estudar a regeneração vascular CNS na retina. O método pode ser utilizado para elucidar os mecanismos moleculares que conduzem à falha de crescimento vascular após lesão isquémica. Além disso, possíveis modalidades terapêuticas para acelerar e restaurar plexos vasculares saudáveis ​​podem ser exploradas. Achados obtained utilizando a abordagem descrita pode fornecer meios terapêuticos para retinopatias isquêmicas, tais como diabetes ou que de prematuridade e possivelmente beneficiar outros distúrbios vasculares do SNC.

O modelo OIR é amplamente utilizada para estudar a degeneração vascular induzida por oxigênio e neovascularização patológica induzida por isquemia na retina e tem sido fundamental para o desenvolvimento de tratamentos atualmente empregados anti-angiogênicos para doenças oculares 27, 29, 30. Os resultados obtidos com este modelo pode ser vagamente extrapolados para retinopatias isquêmicas, como a retinopatia diabética proliferativa e retinopatia da prematuridade 30. <p class="jove_con...

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Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

A retina de roedores tem sido reconhecida como uma janela de acesso para o cérebro. Neste documento técnico que proporcionam um protocolo que utiliza o modelo de ratinho de retinopatia induzida por oxigénio para estudar os mecanismos que levam à insuficiência de regeneração vascular dentro do sistema nervoso central após a lesão isquémica. O sistema descrito também pode ser aproveitada para explorar estratégias para promover o crescimento de vasos sanguíneos funcionais dentro da retina e do SNC.

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.3K visualizações.  McGill University.  A retina de roedores tem sido reconhecida como uma janela de acesso para o cérebro. Neste documento técnico que proporcionam um protocolo que utiliza o modelo de ratinho de retinopatia induzida por oxigénio para estudar os mecanismos que levam à insuficiência de regeneração vascular dentro do sistema nervoso central após a lesão isquémica. O sistema descrito também pode ser aproveitada para explorar estratégias para promover o crescimento de vasos sanguíneos...